Name: 使用大西洋鲑鱼锌示例证明的补充方法评估鱼类饲料中的矿物供应情况 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: 了解大西洋鲑鱼饲料中锌的生物利用度评估方法，结合体外溶解度测试、RTgutGC细胞摄取实验和体内喂养试验，系统分析不同锌化学形态对鱼类营养的影响。该方法为水产饲料微量矿物质优化提供重要参考。

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本工作在挪威研究理事会资助的APREMIA项目（大西洋鲑鱼矿物质表观利用率与需求量，资助号：244490）下完成。

第4节中的饲喂试验是根据挪威法规（FOR-2015-06-18-761）和欧洲立法（指令2010/63/EU）进行的。
1. 使用尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法评估大西洋鲑鱼饲料可溶性组分中锌的化学形态
<ol>
	<li>提取缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.5）
	<ol>
		<li>将适量三（羟甲基）氨基甲烷溶解于超纯H2O中，配制成所需离子强度（100 mM）的提取缓冲液。</li>
		<li>用HCl溶液调节溶液pH至8.5，并使用pH计监测pH变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>饲料样品的制备 
	注意：所用饲料样品基于大西洋鲑鱼商用饲料配方，主要蛋白质来源为植物性成分（即约5%鱼源蛋白、10%鱼油、68%植物蛋白和12%植物油）。饲料中额外添加了硫酸锌。
	<ol>
		<li>使用研钵和研杵手工研磨饲料样品。</li>
		<li>对饲料样品进行过筛，确保提取所用的饲料颗粒粒径相近（850 µm至1.12 mm）。</li>
		<li>随后进行锌的提取操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从饲料样品中提取锌
	<ol>
		<li>称取约0.5 g饲料样品，设三个重复，分别放入15 mL锥形管中。</li>
		<li>向样品中加入提取缓冲液（5 mL，100 mM Tris-HCl，pH 8.5）。</li>
		<li>将样品置于旋转仪上（20 rpm），在4 °C条件下提取24小时。</li>
		<li>以3000 × g 离心10分钟，分离可溶性与非可溶性组分。</li>
		<li>使用0.45 µm一次性注射器滤器过滤可溶性组分。</li>
		<li>将滤过的样品转移至洁净的离心管中。</li>
		<li>按照步骤1.6所述方法，使用SEC-ICP-MS对可溶性组分进行锌形态分析。 
		注意：图2中总结了从饲料样品中提取锌的操作流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流动相溶液（50 mM Tris-HCl + 3% MeOH，pH 7.5）
	<ol>
		<li>将6.057 g三（羟甲基）氨基甲烷溶解于1 L的3% MeOH溶液（v/v）中，配制流动相溶液。</li>
		<li>用HCl溶液调节溶液pH至7.5，并使用pH计监测pH变化。</li>
		<li>用0.45 μm膜滤器过滤流动相溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SEC柱分离范围的分子量校准
	<ol>
		<li>通过分子量校准来标定分离范围。 
		注意：本研究中使用了甲状腺球蛋白（660 kDa）、Zn/Cu超氧化物歧化酶（32 kDa）、肌红蛋白（17 kDa）和维生素B12（1.36 kDa）。</li>
		<li>将各标准品用超纯H2O配制成已知浓度的溶液。</li>
		<li>取250 µL标准品溶液加入高效液相色谱（HPLC）样品瓶中，制备样品。</li>
		<li>将含有标准品的样品瓶加载至样品分析序列中。</li>
		<li>在分析序列开始和结束时运行分子量校准，监测127I（甲状腺球蛋白）、66Zn（Zn/Cu超氧化物歧化酶）、57Fe（肌红蛋白）和59Co（维生素B12）。 
		注意：分子量校准与锌形态分析同时进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用SEC-ICP-MS进行锌形态分析 
	注意：本实验中采用的SEC-ICP-MS法进行锌形态分析，基于已有文献10,11所述原理建立，并针对大西洋鲑鱼饲料样品进行了进一步优化7。
	<ol>
		<li>采用尺寸排阻色谱（SEC）柱联用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）对可溶性组分进行锌形态分析。</li>
		<li>取250 µL可溶性组分加入HPLC样品瓶中，制备样品。</li>
		<li>分析前，向所有样品中加入0.5 µL维生素B12进行内标，通过监测59Co信号校正保留时间漂移。</li>
		<li>用提取缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.5）稀释可溶性组分，并定容至1 mL。</li>
		<li>将样品按随机顺序排列，设置分析序列。</li>
		<li>根据仪器制造商的说明对ICP-MS进行调谐。</li>
		<li>按照表Table 1中列出的HPLC和ICP-MS仪器参数进行锌形态分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大西洋鲑鱼饲料中添加锌的体外溶解度
注意：所使用的饲料样品基于大西洋鲑的商业饲料配方，其蛋白质来源主要为植物性成分（即约5%鱼粉、10%鱼油、68%植物性原料和12%植物油）。
<ol>
	<li>使用刀式研磨机以 3000 rpm 转速研磨大西洋鲑鱼饲料样品 10 秒，随后于 4 °C 保存，待进一步分析。</li>
	<li>称取约 0.2 g 步骤 2.1 中研磨后的饲料样品，加入已知比活度的锌放射性示踪剂（65Zn），置于 5 mL 带盖样品管中。 
	注意：该操作必须在放射性核素操作室中进行。操作人员须接受过放射性同位素操作培训并取得相应资质。必须严格遵守所在机构辐射安全管理部门建议的安全与防护措施。</li>
	<li>随后按以下方法配制淡水鱼类肠道腔内缓冲液。
	<ol>
		<li>配制盐溶液 A：称取 11.65 g NaNO3、0.55 g KNO3 和 0.4 g MgSO4，溶于超纯 H2O 中，并定容至 60 mL。</li>
		<li>配制盐溶液 B：称取 0.31 g Ca(NO3)2·4H2O，溶于超纯 H2O 中，并定容至 10 mL。</li>
		<li>使用 500 mM HEPES 储备液作为盐溶液 C。</li>
		<li>配制盐溶液 D：称取 1.2 g MgCl2，溶于超纯 H2O 中，并定容至 20 mL。</li>
		<li>配制盐溶液 E：称取 0.9 g MgSO4，溶于超纯 H2O 中，并定容至 20 mL。</li>
		<li>将 0.55 g CH3COCOONa 溶于 10 mL 超纯 H2O 中，配制丙酮酸溶液。</li>
		<li>将 0.9 g 半乳糖（C6H12O6）溶于超纯 H2O 中。</li>
		<li>使用磁力搅拌器充分溶解，将盐溶液 A、B、D 和 E 通过高压灭菌法灭菌，溶液 C、丙酮酸溶液和半乳糖溶液则通过 200 µm 注射器滤器过滤灭菌。</li>
		<li>在配制好上述各种储备液后，取以下体积混合以配制 100 mL 工作缓冲液：盐溶液 A 6.8 mL、B 4.14 mL、C 5 mL、D 2.5 mL、E 1.5 mL，以及丙酮酸和半乳糖溶液各 1.14 mL，最后用去离子水定容至 100 mL。 
		注：上述缓冲液将模拟淡水鲑科鱼类肠道腔内的离子组成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>另配制六份步骤 2.6 中所述缓冲液，并分别加入以下氨基酸之一（半胱氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸），使终浓度达到 5 mM。</li>
	<li>将淡水鱼类肠道腔内缓冲液（反应体积 = 3 mL；pH 7.4）加入饲料样品中。</li>
	<li>使用步骤 2.4 中所述含不同氨基酸（终浓度 5 mM）的缓冲液重复步骤 2.5。</li>
	<li>盖紧管盖，将样品管置于旋转摇床中，以 25 rpm 转速旋转 30 分钟。</li>
	<li>以 1157 × g 离心 10 分钟，分离可溶性与非可溶性组分。</li>
	<li>使用伽马计数器测定可溶性与非可溶性组分中 65Zn 的每分钟计数（cpm）。</li>
	<li>计算锌放射性同位素（65Zn）在可溶性与非可溶性组分中的分布比例。</li>
</ol>
3. 使用体外肠道模型（RTgutGC）评估锌化学形态的吸收
<ol>
	<li>RTgutGC 细胞培养 
	注意：本步骤中使用的所有实验材料均应为无菌状态。
	<ol>
		<li>将冻存的 RTgutGC 细胞在 20 °C 的水浴中轻柔复苏。</li>
		<li>用移液器轻柔吸取含细胞的溶液，并将其悬浮于 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 L15 培养基中。 
		注意：10% FBS 仅用于复苏冻存细胞。后续传代时使用 5% FBS。由于不同批次 FBS 的成分可能存在差异，建议从同一批次中购买并储备足够用量，以避免血清成分的批间差异。</li>
		<li>将细胞悬液加入 75 cm2 的细胞培养瓶中，并在 19 °C、常压条件下置于培养箱中培养。</li>
		<li>观察细胞状态，当细胞达到汇合（80% 汇合度，通过显微镜下观察细胞表面密度进行评估）时，将细胞传代至新的培养瓶（后续传代）或收集用于实验。 
		注意：RTgutGC 细胞接种至培养瓶后 1 小时和 1 周的示例见图 3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞收集及暴露实验前准备
	<ol>
		<li>用 1 mL 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液清洗细胞两次。每次清洗后，使用无菌吸管吸除 EDTA 溶液。</li>
		<li>用胰蛋白酶处理细胞（0.7 mL 胰蛋白酶，浓度为 0.25%，溶于磷酸盐缓冲液 [PBS] 中）。</li>
		<li>轻柔地以小角度旋转培养瓶，使胰蛋白酶均匀覆盖瓶壁表面。</li>
		<li>继续旋转 2 分钟，使细胞脱落。</li>
		<li>轻柔旋转 2 分钟后，加入 10 mL L15/FBS 培养基以中和胰蛋白酶。</li>
		<li>用无菌移液器将所得细胞悬液转移至锥底离心管中，于 130 × g 离心 3 分钟。</li>
		<li>使用血细胞计数板手动计数，测定收获细胞的密度。</li>
		<li>加入适量 L15/FBS 培养基，调节细胞密度至 5 × 104 个细胞/mL。</li>
		<li>用移液器将 1 mL 细胞悬液加入 24 孔板的每孔中，使最终细胞密度为 5 × 104 个细胞/孔。 
		注意：建议使用多通道移液器，以减少误差并节省时间。</li>
		<li>将接种后的 24 孔板置于 19 °C、常压条件下的培养箱中培养 48 小时，之后进行实验。 
		注意：胰蛋白酶应储存于 -20 °C；EDTA 溶液和 L15/FBS 培养基应储存于 4 °C。使用前将所有工作溶液和培养基温度调节至 19 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暴露培养基的制备 
	注意：此步骤必须在无菌条件下于通风橱中进行。
	<ol>
		<li>通过混合 6.8 mL 盐溶液 A（步骤 2.3.1）、1.14 mL 溶液 B（步骤 2.3.2）、5 mL 溶液 C（步骤 2.3.3），以及各 1.14 mL 的丙酮酸（步骤 2.3.6）和半乳糖（步骤 2.3.7），配制 L15/ex 培养基。用无菌细胞培养级蒸馏水定容至 100 mL。</li>
		<li>通过混合 6.8 mL 盐溶液 A（2.3.1）、4.14 mL 溶液 B（2.3.2）、5 mL 溶液 C（2.3.3）、2.5 mL 溶液 D（2.3.4）、1.5 mL 溶液 E（2.3.5），以及各 1.14 mL 的丙酮酸（2.3.6）和半乳糖（2.3.7），配制 FW 培养基。用无菌细胞培养级蒸馏水定容至 100 mL。</li>
		<li>采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定暴露培养基中离子浓度，方法见其他文献12。 
		注意：培养基中离子浓度的分析结果见表 2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>锌（65Zn）流入实验
	<ol>
		<li>在完全 L15/FBS 培养基中，将 RTgutGC 细胞接种至 24 孔板（每孔 5 × 104 个细胞）。</li>
		<li>在 19 °C、常压条件下培养 48 小时。</li>
		<li>使用 0.5 M NaOH 将所有实验培养基调节至 pH 7.4，可选择性地加入 2 mM 浓度的 L-甲硫氨酸（L-Met）或 DL-甲硫氨酸（DL-Met）。 
		注意：步骤 3.4.3 中所述缓冲液的 pH 调节必须在步骤 3.4.5 处理细胞前新鲜配制。</li>
		<li>培养结束后，吸除孔中培养基，并用 PBS 充分冲洗。</li>
		<li>加入已调节 pH 的 FW 实验培养基，静置 20 分钟以使细胞适应。</li>
		<li>将 RTgutGC 细胞暴露于步骤 3.4.3 所述培养基中，其中含有名义浓度为 3.07、6.14、12.27 和 24.55 µM 的 65Zn(II)（以 ZnCl2 形式添加，放射活性约为 4 kBq/mL）。</li>
		<li>立即后，将细胞置于 19 °C 培养箱中孵育 15 分钟。</li>
		<li>15 分钟孵育结束后，吸除培养上清液并从孔中移除。</li>
		<li>用冰冻的 FW 培养基（含 200 µM Zn，pH 7.4）冲洗细胞，然后加入 5 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）缓冲液（pH 7.4）孵育 5 分钟，以去除任何吸附的 65Zn(II)。</li>
		<li>将细胞暴露于上述培养基体系中，可选择性地加入或不加入 10 mM 的氨基酸转运抑制剂 2-氨基双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸（BCH）。</li>
		<li>15 分钟暴露期结束后，重复步骤 3.4.8 和 3.4.9。</li>
		<li>RTgutGC 细胞将以单层形式贴附于孔底。使用 0.2% 热十二烷基硫酸钠（SDS）去垢剂（每孔 100 µL）消化细胞。 
		注意：SDS 溶液在使用前需在 90 °C 水浴中预热 1 小时。</li>
		<li>吸除并回收细胞消化液至 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>使用伽马计数器测定细胞消化液的放射活性。 
		注意：每分钟计数（cpm）需校正放射性衰变和本底活性，并根据 Glover 和 Hogstrand13 所述公式进行比活性计算。</li>
		<li>为定量细胞蛋白浓度，使用 500 µL 0.5 M NaOH 匀浆细胞。</li>
		<li>采用 Bradford 法试剂盒测定细胞样品中的蛋白浓度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。 
		注意：蛋白浓度测定后，RTgutGC 细胞的锌摄取速率可表示为 pmoles Zn min-1 mg-1 蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 大西洋鲑（Salmo salar）对膳食锌的表观利用率
注意：大西洋鲑鱼饲料的配方基于商业饲料，其蛋白质来源主要为植物性成分（即约5%鱼源蛋白、10%鱼油、68%植物蛋白和12%植物油）。两种饲料分别添加了无机锌源（硫酸锌）或有机锌源（甘氨酸锌螯合物），使饲料中锌浓度达到150 mg/kg。此外，饲料中添加0.01%的氧化钇（饲料级）作为惰性标记物，用于计算表观消化率系数。
<ol>
	<li>将大西洋鲑（SalmoBreed 品系，年龄 1+ 年，混合性别群体）在各自水族箱中进行驯化，直至鱼类适应实验条件。</li>
	<li>通过监测大西洋鲑每日摄食量评估其驯化情况。 
	注意：本试验设置三个重复水族箱，共使用六个水族箱。在喂养试验期间，水温为 11.9 ± 0.3 °C，溶解氧饱和度为 101 ± 5%。</li>
	<li>用实验饲料喂养鱼类 11 天。</li>
	<li>使用三卡因甲磺酸盐储备溶液每升水中加入 6 mL 进行过量麻醉以实施安乐死。</li>
	<li>通过从腹鳍向肛门方向挤压，将来自同一水族箱鱼类的粪便收集至培养皿中，形成混合粪便样品。</li>
	<li>用刮铲将培养皿中的粪便转移至 50 mL 锥形管中，并立即在 -20 °C 下保存样品。 
	注意：样品在 -20 °C 下保存直至进一步分析。</li>
	<li>在 -80 °C 下对粪便样品进行冷冻干燥处理，持续 72 小时。</li>
	<li>使用研钵和研杵手动将粪便样品研磨成细粉并充分均质化。</li>
	<li>采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定饲料和粪便样品中锌（Zn）和钇（Yttrium）的浓度（方法见其他文献9）。</li>
	<li>使用以下公式计算表观可利用系数（AAC，%）： 
	<img alt="用于锌吸收分析的 AAC 计算公式；分子和分母中均引用钇" src="/files/ftp_upload/59862/59862eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
</ol>

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<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nutrient+Requirements+of+Fish+and+Shrimp%22">Nutrient Requirements of Fish and Shrimp</a>. , The National Academies Press. (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

锌的肠道吸收似乎受到锌物种化学形态的影响13。在这方面，本文所述方案的使用使得能够依次研究大西洋鲑中锌“生物可利用性”背后的化学和生物学因素。
本研究报道了一种锌形态分析方法的应用。通过尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法（SEC-ICP-MS），获得了大西洋鲑饲料可溶性组分中锌化学形态分子量的定性数据。该分析通过将锌组分峰的保留时间与分子量校准标准品的保留时间进行比较实现，所用标准品包括：甲状腺球蛋白（660 kDa）、锌/铜超氧化物歧化酶（32 kDa）、肌红蛋白（17 kDa）和维生素B12（1.36 kDa）。在锌形态分析中遇到的一个挑战是由于缺乏相应的分析标准品，难以鉴定未知的锌化学形态。在尺寸排阻色谱（SEC）中，分子的分离基于其尺寸与固定相孔径的相对大小。原则上，较大的分子迁移较快，先洗脱，而较小的分子迁移较慢，后洗脱14。因此，每一个含锌的峰可能包含多种分子量相近的化合物15，这也增加了鉴定未知锌化学形态的难度。此外，本研究测试了多种温和的提取条件以提取锌，但提取出的锌含量较低（约10%）。采用温和的提取条件旨在保持锌化学形态的完整性，但这可能影响了提取效率7。
在体外溶解度实验中，补充的锌（作为放射性同位素）的溶解度 65ZnCl2) 表明氨基酸（尤其是组氨酸和赖氨酸）增加了锌（Zn）的溶解度图5）。在模拟胃肠道条件下直接使用饲料样品进行体外溶解度测定，是基于锌形态变化依赖于pH值这一认识16然而，胃肠道起始部位的酸性条件可能导致元素形态发生某些不可逆的变化（例如，ZnO -&#62; ZnCl2， 在胃部酸性条件下存在盐酸时）。然而，此处使用的锌源为 ZnSO4 且其溶解度因培养基中的氨基酸而提高。接下来需要回答的问题是：溶解度的增加能否转化为可利用性？为此采用了RTgutGC肠道细胞系来研究这一问题。在动物矿物质营养的背景下，“可利用性”这一术语难以明确定义，且其在细胞水平（体外）与整体动物（体内）中的调控可能存在差异。因此，在使用肠道细胞系进行体外评估时，采用“摄取”这一术语。该细胞系提供了有关锌在肠道上皮细胞摄取机制的有用信息，该机制是调控动物体内矿物质可利用性这一复杂调节过程的一部分。RTgutGC细胞在氨基酸（如甲硫氨酸）存在条件下，表现出更强的顶端锌摄取能力。 图6然而，在大西洋鲑体内，无机锌源与有机锌源的表观利用率之间无显著差异。在该体内利用率研究中，锌源的比较是在饲料锌水平远高于大西洋鲑已知锌需求量的条件下进行的。17饲料中总锌浓度为150 mg/kg。当所测试的膳食水平处于动物达到饱和前的线性动态范围内时，不同来源锌的生物可利用性差异更易于显现。在本项体内研究中，大西洋鲑可能已接近锌饱和状态，导致所用不同锌源之间的吸收差异不明显。
综上所述，第一种方法提供了关于大西洋鲑鱼饲料可溶性组分中不同锌化学形态的定性信息；第二种方法表明，在氨基酸配体存在下，添加的锌体外溶解度得到改善；第三种方法证实，氨基酸对溶解度的改善可促进锌在肠道上皮的吸收；相反，第四种方法未能发现无机源与有机源锌对大西洋鲑鱼生物可利用性之间的差异。总之，尽管体外实验结果与体内研究结果不一致，但这些体外实验方案仍为理解锌生物可利用性的不同组分提供了有价值的见解。

传统上，鱼粉和鱼油被用于大西洋鲑鱼饲料中。然而，这些成分正越来越多地被植物性成分所取代1。上述饲料成分的变化导致了矿物质在饲料中的生物可利用性降低，尤其需要提高大西洋鲑鱼饲料中锌（Zn）的可利用性2。这种可利用性降低可能是由于饲料基质中锌含量、锌的化学形态和/或抗营养因子发生变化所致。在此背景下，一类新型添加剂——通常被称为“有机来源”——已出现，并有望成为鱼类膳食矿物质更易利用的来源。因此，理解调控矿物质及其来源在鱼类中可利用性的基本化学与生理机制至关重要。锌是所有生物体必需的微量元素3。在鱼类中，锌作为信号分子的作用已在细胞旁路和细胞内水平上得到描述4。在大西洋鲑鱼中，锌缺乏与骨骼异常以及多种锌金属酶活性降低相关5,6。
本研究描述了一种系统性方法，通过将锌（Zn）划分为四种不同化学和生物学复杂性的组分，来理解其可利用性。所涉及的方法分为四个部分，如图1所示：（1）利用尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法（SEC-ICP-MS）分析大西洋鲑饲料可溶性组分中锌的化学形态7；（2）体外评估添加至大西洋鲑饲料中锌的溶解度；（3）利用体外肠道模型（RTgutGC）评估锌化学形态的吸收情况8；（4）大西洋鲑（Salmo salar）体内锌的表观可利用性9。类似的方法也可开发用于其他对水产养殖鱼类具有营养意义的矿物质（如锰、硒、铜）的研究。

<table><tbody><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 膜滤器</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 % 胎牛血清</td><td>Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1282 Compugamma 实验室伽马计数器</td><td>LKB Wallac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 孔板（Falcon，TPP 微孔板）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10048760</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基双环(2.2.1)庚烷-2-羧酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A7902</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞培养瓶（Falcon，TPP 组织培养瓶）</td><td>TPP Techno Plastic Products AG&amp;nbsp;</td><td>90075</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf Centrifuge 5702</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>30089</td><td></td></tr><tr><td>DL-蛋氨酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>59-51-8</td><td></td></tr><tr><td>D-蛋氨酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M9375</td><td></td></tr><tr><td>实验用鱼类饲料</td><td>Skretting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>保护柱，TSKgel SWxl 型（7 &amp;mu;m 粒径）</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>53319</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱联用 7500ce 电感耦合等离子体质谱仪</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck</td><td>1.00317</td><td></td></tr><tr><td>刀式研磨仪</td><td>GM 300, Retsch Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 培养基</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>&amp;nbsp;21083027</td><td></td></tr><tr><td>L-蛋氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>23128</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>LiChrosolv, HPLC 级, Merck&amp;nbsp;</td><td>1.06035</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 水（18.2&amp;nbsp;M&amp;Omega;&amp;nbsp;cm）&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肌红蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>NexION 350D 电感耦合等离子体质谱仪</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计&amp;nbsp;</td><td>inoLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>RTgutGC 细胞&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由瑞士联邦水科学与技术研究所（Eawag）环境毒理学系 Kristin Schirmer 教授博士无偿提供</td></tr><tr><td>SEC 柱，TSKgel G3000SWxl</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢筛网（850?&amp;mu;m - 1.12?mm）</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>超氧化物歧化酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7571</td><td></td></tr><tr><td>甲状腺球蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1001</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>PharmaQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(羟甲基)氨基甲烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>含 0.25% 胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液</td><td>Biowest</td><td>L0910</td><td></td></tr><tr><td>Versene EDTA 溶液</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>维生素 B12</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸锌螯合物</td><td>Phytobiotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸锌</td><td>Vilomix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用互补方法评估鱼类饲料中的矿物质可利用性——以大西洋鲑鱼饲料中锌为例

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

评估膳食微量矿物质的可利用性是鱼类矿物质营养研究中的主要挑战。本文旨在介绍一种结合多种方法的系统性策略，用于评估大西洋鲑（Salmo salar）饲料中锌（Zn）的可利用性。考虑到大西洋鲑饲料中可能存在多种锌的化学形态，本研究假设饲料中锌的可利用性受其化学形态的影响。因此，本研究中的第一项实验方案描述了如何从饲料中提取不同的锌化学形态，并采用尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法（SEC-ICP-MS）进行分析。随后，开发了一种体外方法，用于评估大西洋鲑饲料中膳食锌的溶解度。第三项实验方案描述了利用虹鳟肠道细胞系（RTgutGC）作为鱼类肠道上皮模型，研究改变锌化学形态组成对锌吸收影响的方法。将体外方法所得结果与一项体内研究进行比较，该体内研究考察了添加至大西洋鲑饲料中的无机和有机锌源的表观可利用性。结果表明，饲料中存在多种锌化学形态，且有机锌源的有效性在很大程度上取决于用于螯合锌的氨基酸配体。体外方法的结果与体内研究的结果相关性较低。然而，本文所述的体外实验方案为鱼类饲料中锌可利用性及其评估提供了关键信息。

利用尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法（SEC-ICP-MS）评估大西洋鲑鱼饲料可溶性组分中锌的化学形态 
SEC-ICP-MS 方法可提供有关大西洋鲑鱼饲料可溶性组分中所含锌化学形态的信息。图4展示了在可溶性组分中检测到的锌的色谱图。该色谱图是通过 SEC-ICP-MS 方法获得的。在大西洋鲑鱼饲料的可溶性组分中检测到五个含锌峰。每个峰具有不同的分子量：峰一（约 600 kDa）、峰二和峰三（32 至 17 kDa）、峰四（17 至 1.36 kDa）以及峰五（> 1.36 kDa）。其中峰四含量最高，其次依次为峰二、峰三、峰五和峰一。由于所用饲料包含海洋源和植物源成分，并额外添加了锌（如硫酸锌），因此可溶性组分中的锌化学形态可能来源于多种成分。根据锌化学形态的分子量范围推测，这些化合物可能是金属蛋白。
大西洋鲑饲料中添加锌的体外溶解度 
在氨基酸存在的情况下，添加的65Zn溶解度增加。所有测试的氨基酸均提高了添加65Zn的溶解度。蛋氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸均能促进65Zn的溶解度；其中组氨酸和赖氨酸的作用更为显著（图5）。
利用体外肠道模型（RTgutGC）评估锌形态的吸收 
在RTgutGC细胞中，顶端锌的吸收受到2 mM浓度L-蛋氨酸或DL-蛋氨酸存在的显著影响。此外，与未用BCH处理的细胞相比，当存在BCH（一种氨基酸转运系统阻断剂）时，蛋氨酸对RTgutGC细胞锌吸收的影响受到负向抑制（图6）。
大西洋鲑（Salmo salar）对膳食锌的表观利用率 
在大西洋鲑的实用饲料中，添加无机锌源（硫酸锌）或有机锌源（甘氨酸锌螯合物）时，锌的表观利用率相同。在大西洋鲑中，添加无机锌源（硫酸锌）时锌的表观利用率估计值为 31% ± 12%（%，n = 3），添加有机锌源（甘氨酸锌螯合物）时为 31% ± 3%。
<img alt="大西洋鲑鱼矿物质可利用性示意图；显示吸收、溶解度和化学形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：采用互补方法系统评估矿物质可利用性的综合流程示意图。 该方法用于研究大西洋鲑鱼中锌的可利用性，包括锌的化学形态、肠道环境中的锌溶解度、肠道细胞对锌的吸收以及表观锌可利用性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="锌形态分析流程图，包括提取、离心、过滤和SEC-ICP-MS过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：饲料样品中锌提取流程的概要。 采用温和的提取条件从饲料样品中提取锌，随后进行锌的形态分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养生长对比，显微镜图像显示稀疏与密集的细胞分布，200μm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：RTgutGC细胞接种至细胞培养瓶后1小时（左）和1周后（右）的示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SEC 色谱图；蛋白质峰；分子量；分析图；时间与计数；kDa 标度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过 SEC-ICP-MS 分析大西洋鲑鱼饲料可溶性组分中含锌组分的色谱图。 三条重复曲线分别以蓝色、红色和黑色线条表示。分子量标定使用以下标准蛋白：甲状腺球蛋白（660 kDa，监测 127I）、Zn/Cu 超氧化物歧化酶（32 kDa，监测 66Zn）、肌红蛋白（17 kDa，监测 57Fe）、维生素 B12（1.36 kDa，监测 59Co）；峰 1（P1）：约 600 kDa，保留时间（RT）8.2 分钟；峰 2+3（P2+3）：32 至 17 kDa，RT 14.2 和 15.3 分钟；峰 4（P4）：17 至 1.36 kDa，RT 16.3 分钟；峰 5（P5）：> 1.36 kDa，RT 23.2 分钟。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氨基酸对65Zn回收率的柱状图；在淡水条件下的比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：氨基酸对大西洋鲑饲料中添加锌体外溶解度的影响。 数据以均值 ± 标准差表示（n = 3）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Dunnett多重比较检验，将各氨基酸组的均值与对照组（无氨基酸）进行比较。星号表示方差分析的显著性水平（P值 &lt; 0.05 (*)，&lt; 0.01 (**)，&lt; 0.001 (***)，&lt; 0.0001 (****)）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RTgutGC细胞中锌吸收的比较；柱状图显示L-蛋氨酸、DL-蛋氨酸及无氨基酸条件的影响" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59862/59862fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：蛋氨酸及氨基酸转运抑制剂（2-氨基双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸，BCH，10 mM）的影响。数据以均值±标准差表示（n = 3）。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行数据分析，随后进行Tukey多重比较检验，显著性水平设为p &lt; 0.05。组间事后差异以柱上方的上标字母表示；上标字母不同的柱之间具有统计学差异（p &lt; 0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59862/59862fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HPLC 设置</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>色谱柱</td>
			<td>SEC 色谱柱 
			(30 cm x 7.8 mm, 5 µm 粒径) + 保护柱 (7 µm 粒径)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>校准范围</td>
			<td>1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>流动相</td>
			<td>50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>流速</td>
			<td>0.7 mL min−1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进样体积</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP–MS 设置</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>射频功率</td>
			<td>1550 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>等离子体气体流速</td>
			<td>15.0 L min−1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>载气流速</td>
			<td>0.86 L min−1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>补气流速</td>
			<td>0.34 L min−1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>驻留时间</td>
			<td>每同位素 0.1 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>监测的同位素</td>
			<td>127I, 66Zn, 59Co, 57Fe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 高效液相色谱仪和电感耦合等离子体质谱仪的仪器参数设置概览。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化学成分（mM）</td>
			<td>L15/ex</td>
			<td>实验培养基（L15/FW）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硝酸钠</td>
			<td>155</td>
			<td>155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硝酸钾</td>
			<td>6.2</td>
			<td>6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硫酸镁</td>
			<td>3.8</td>
			<td>19.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硝酸钙</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化镁</td>
			<td>-</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸钠</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>半乳糖</td>
			<td>5.7</td>
			<td>5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.1</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离子强度</td>
			<td>178</td>
			<td>258</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td>离子组成（mM）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>钙离子，Ca2+ *</td>
			<td>1.6 ± 0.1</td>
			<td>5.3 ± 0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>镁离子，Mg2+ *</td>
			<td>3.9 ± 0.3</td>
			<td>32.5 ± 0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>钾离子，K+ *</td>
			<td>8.2 ± 1.2</td>
			<td>8.6 ± 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>钠离子，Na+ *</td>
			<td>160 ± 3</td>
			<td>157 ± 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硝酸根，NO3- **</td>
			<td>164</td>
			<td>172.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硫酸根，SO4- **</td>
			<td>3.8</td>
			<td>18.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯离子，Cl- **</td>
			<td>1.5</td>
			<td>31.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 所测试实验培养基的化学成分与离子组成。

本文详细阐述了一种系统评估大西洋鲑微矿物流通性的方法。该方法包括生物学复杂性逐步增加的工具和模型：（1）化学形态分析，（2）体外溶解度实验，（3）细胞系摄取研究，以及（4）活体鱼类研究。&#160;

评估饲料中微量矿物质的可利用性是鱼类矿物质营养研究中的主要挑战。本文旨在描述一种……

我们研究了在饲料成分变化的背景下，锌、硒等微量金属以不同化学形态或来源（即所谓的）溶解度的可利用性。在放射性核素实验组中，称取约0.2克粉碎的大西洋鲑鱼饲料样品，加入已知比活度的锌放射性示踪剂，置于5毫升体积的样品管中混合。另准备六份等量缓冲液，并向每份中分别加入此处所示的一种氨基酸，使其终摩尔浓度达到5毫摩尔。加入淡水肠道腔内缓冲液以孵育样本。接着，将淡水肠道腔内缓冲液加入含有氨基酸的缓冲液等分试样中。盖紧管盖，并在旋转仪上以25 RPM转速旋转30分钟。然后，在 1,157 × g 条件下离心 10 分钟，以分离可溶性和非可溶性组分。使用γ计数器测定可溶性和非可溶性组分中锌放射性示踪剂的每分钟计数。用一毫升 EDTA 溶液将源自虹鳟鱼的肠道细胞系清洗两次，每次清洗后用移液器吸出溶液。用0.25%胰蛋白酶溶液处理洗涤后的细胞。将培养瓶轻轻以锐角旋转两分钟，然后加入10毫升含5%胎牛血清（FBS）的L-15培养基以中和胰蛋白酶。使用无菌移液管将所得的细胞悬液转移至锥底离心管中。在130 × g条件下离心3分钟。然后使用血细胞计数板通过手动计数测定收获细胞的密度。将细胞以每毫升50,000个细胞的密度接种到24孔板中，每孔接种一毫升，实验前将培养板置于19摄氏度、正常大气条件下孵育48小时。喂养鱼类11天并实施安乐死后，通过从腹鳍向肛门方向刮取收集鱼类粪便的混合样本，并将其置于培养皿上。使用刮铲将粪便从培养皿转移至50毫升锥形管中。立即将样品储存在 20 摄氏度条件下。本研究采用多种互补方法评估鱼饲料中矿物质的可利用性。通过尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法对大西洋鲑鱼饲料进行代表性分析，可获得可溶性组分中锌化学形态的相关数据。在此组分中可观察到五个含锌的峰，每个峰具有不同的分子量。可溶性组分中发现的锌化学形态可能来源于多种途径，因为所使用的饲料包含海洋来源和植物来源的成分，并额外添加了补充成分。这些物质的分子量范围表明，它们可能是金属结合蛋白。尽管添加的锌65的溶解度会增加所有被检测氨基酸的存在量，但组氨酸和赖氨酸的存在使锌的溶解度更高。在Arteca GC细胞中，顶端锌吸收受到2毫摩尔浓度L-蛋氨酸或DL-蛋氨酸存在的显著影响。此外，BCH的存在会负向影响蛋氨酸对锌吸收的作用。本方案的主要优势在于，我们尝试将视觉、分析以及体内研究中的不同方法相结合，以在研究矿物质可利用性时实现相互比较与补充。

assessing-mineral-availability-fish-feeds-using-complementary-methods

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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斑马鱼中金属及金属化合物的药物毒物动力学分析速率提高，有利于环境与临床转化研究。通过采用电感耦合等离子体质谱法对消化后的斑马鱼组织进行痕量金属分析，克服了水生暴露吸收量未知的局限性。...

斑马鱼暴露于铂基和钌基化合物后通过电感耦合等离子体质谱法检测剂量摄取及其更广泛的应用

本方案详细介绍了Zn的制备方法2+-受限培养基、培养容器和种子培养物以生产 Zn2+-结核分枝杆菌中受限制的核糖体。微量的Zn2+ 导致 Zn2+限制生长，我们描述了用作生物指示剂以验证锌的形态发生特征2+ 局限性 体外 在模式细菌中， 耻垢分枝杆菌， 以及人类病原体 M. tuberculosis.

使用Mycobacterium smegmatis作为分枝杆菌锌限制生长条件下的一种生物指示剂

本研究介绍了一种基于明胶的喂食方法，可实现对成年斑马鱼进行精确、无创且基于体重的口服药物递送。该方案展示了可靠的摄食接受性，并以MK-801的成功递送作为原理验证，产生了预期的行为学效应。...

一种简单且精确的基于投喂的鱼类口服给药方法

了解大西洋鲑鱼饲料中锌的生物利用度评估方法，结合体外溶解度测试、RTgutGC细胞摄取实验和体内喂养试验，系统分析不同锌化学形态对鱼类营养的影响。该方法为水产饲料微量矿物质优化提供重要参考。

利用互补方法评估鱼类饲料中的矿物质可利用性——以大西洋鲑鱼饲料中锌为例

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