Name: 人类胰腺胰岛的单细胞RNA测序与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学习使用液滴微流控单细胞RNA测序技术对人类胰腺胰岛细胞进行高通量转录组分析，识别稀有细胞类型并研究疾病中的基因调控机制。该方法适用于多种物种的胰岛组织。

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1. 人胰岛解离
<ol>
	<li>获取来自15至80岁、性别不限的遗体器官捐献者的胰岛，除非研究目的需要特定人群捐献者的胰岛。
	<ol>
		<li>分离后，将分离的胰岛在供应商处的组织培养设施中保存2-3天。胰岛损伤通常需要超过1天才变得可见。</li>
		<li>将胰岛放入瓶中，并完全浸没于胰岛培养基中，通过隔夜运输送至实验室。</li>
		<li>从胰岛供应商处获取所运送胰岛的胰岛当量（IEQ）数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在胰岛到达当日进行复苏。此步骤应在生物安全柜中操作，以尽量减少污染风险。
	<ol>
		<li>将完全胰岛培养基（CMRL-1066，10% (v/v) FBS，1×青霉素-链霉素，2 mM谷氨酰胺）置于冰箱中冷却。</li>
		<li>将胰岛从瓶中转移至一个50 mL锥形管中。</li>
		<li>向空瓶中加入10 mL预冷的完全胰岛培养基，冲洗残留的胰岛，并将液体转移至锥形管中。</li>
		<li>以200 x g离心2分钟以回收胰岛。吸除上清液，保留约1-2 mL培养基与沉淀一同留存。</li>
		<li>用预冷的完全胰岛培养基重悬胰岛。根据供应商提供的IEQ数值，每5000 IEQ加入12 mL培养基。</li>
		<li>将含胰岛的培养基倒入一个10 cm未经处理的组织培养皿中，在37 °C、5% CO2的空气环境中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下方法对胰岛进行解离。此步骤应在过夜孵育后进行。
	<ol>
		<li>预先温育完全胰岛培养基和细胞解离溶液。</li>
		<li>在室温下配制含0.04% BSA的1× PBS溶液。</li>
		<li>使用P200移液器计数并手工挑选200-300个胰岛，转移至含有5 mL预温完全胰岛培养基的15 mL锥形管中。</li>
		<li>以200 x g离心2分钟收集胰岛。轻柔吸除上清液，避免扰动管底沉淀。</li>
		<li>加入1.0 mL预温的细胞解离溶液，通过轻柔吹打使沉淀分散。在37 °C孵育9-11分钟，每隔3分钟缓慢吹打10秒，以使细胞解离为单细胞状态。</li>
		<li>当胰岛细胞充分解离且溶液变浑浊时，加入9 mL完全胰岛培养基，并通过30 µm细胞筛过滤至新的15 mL锥形管中。</li>
		<li>用2 mL完全胰岛培养基冲洗原管和细胞筛，收集残留胰岛并加入同一管中。</li>
		<li>以400 x g离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>轻柔吸除培养基，将细胞沉淀重悬于5 mL含0.04% BSA的1× PBS（PBS-BSA）溶液中。</li>
		<li>通过新的30 µm细胞筛过滤至15 mL锥形管中，再以400 x g离心5分钟收集细胞。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于200-300 µL 1× PBS-BSA溶液中。</li>
		<li>测定细胞浓度，并调整体积至最终浓度为400-500个细胞/µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单细胞悬液质量控制
<ol>
	<li>使用基于荧光的自动细胞计数器测定细胞浓度34。
	<ol>
		<li>将10 μL细胞与0.5 μL AO/DAPI混合，用移液枪充分吹打混匀。取10.5 μL混合液加入载玻片，运行细胞计数检测以确定细胞数量和活率。</li>
		<li>根据细胞计数结果，必要时对细胞悬液进行稀释或过滤处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用微流控芯片进行单细胞分离。遵循微流控芯片制造商提供的方案35。
<ol>
	<li>将3'凝胶珠和逆转录（RT）试剂置于室温下（&#62;30分钟）。如需要，用TE缓冲液重悬RT引物。</li>
	<li>在低吸附离心管中按表1所述配制RT主混合液。</li>
	<li>确定每个样本所需的输入细胞数量。计算为达到目标细胞数所需的细胞悬液体积（X）。每个样本需加入的无核酸酶水体积为33.8-X μL。</li>
	<li>对于每个待分选的样本，向0.2 mL PCR条形管中加入33.8-X μL无核酸酶水，然后向每根条形管中加入66.2 μL主混合液。此时不要向条形管中加入细胞。轻轻吹打混匀。将准备好的条形管置于冰上。</li>
	<li>将微流控芯片放入芯片盒中。调整芯片盒方向，确保油井（标记为第3行）最靠近实验操作者。</li>
	<li>若运行的样本少于8个，请按以下顺序使用50%甘油填充未使用的通道：
	<ol>
		<li>向所有未使用通道的第1行孔中各加入90 µL 50%甘油。</li>
		<li>向所有未使用通道的第2行孔中各加入40 µL 50%甘油。</li>
		<li>向所有未使用通道的第3行孔中各加入270 µL 50%甘油。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将凝胶珠短暂涡旋。全速涡旋30秒。多次轻敲条形管管壁以收集珠子。确认无气泡存在。</li>
	<li>向已准备好的条形管中加入X μL细胞悬液。吹打混匀5次。不更换枪头，立即将90 μL细胞混合液转移至芯片的第1行孔中。</li>
	<li>等待30秒后，向第2行孔中缓慢加入40 μL凝胶珠。此步骤需极缓慢地进行移液操作。向第3行各孔中加入270 μL分选油。</li>
	<li>将芯片密封垫圈卡入芯片支架的卡槽中。将组装好的芯片支架放入单细胞分选仪中，按下运行按钮。</li>
	<li>运行完成后立即取出芯片支架组件。</li>
	<li>从支架上取下芯片密封垫圈，以45°角打开芯片盒，从芯片中取出100 μL乳浊液，转移至蓝色塑料96孔板中。</li>
</ol>
4. 单细胞cDNA扩增。遵循微流控芯片制造商的方案35。
<ol>
	<li>反转录。 
	注意：此步骤应在洁净的专用PCR操作台内进行，以防止未扩增的cDNA受到微生物及其他污染。
	<ol>
		<li>使用加热板封膜机将96孔蓝色板用铝箔密封。</li>
		<li>在热循环仪中运行反转录反应，程序如下：53 °C 反应45分钟 → 85 °C 反应5分钟 → 4 °C 保存。 
		注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反转录后纯化
	<ol>
		<li>将核酸结合磁珠和核酸片段大小选择磁珠恢复至室温，并涡旋振荡以重新悬浮。此时，将样品清洁缓冲液在65 °C解冻10分钟。将所有其他试剂恢复至室温并涡旋振荡。</li>
		<li>按照表2和表3所示配制缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化学破乳并纯化。
	<ol>
		<li>轻轻从板上移除铝箔密封膜。</li>
		<li>向每个乳液中加入125 μL粉红色破乳试剂。等待1分钟后，将全部液体转移至洁净的0.2 mL条形管中。确保条形管中存在一层透明液体和一层粉红色液体。</li>
		<li>从条形管底部吸取125 μL粉红色层，注意不要扰动透明层。少量粉红色液体（约15 μL）残留在管中属正常现象。</li>
		<li>向条形管中加入表2中的200 μL清洁混合液，并在室温孵育10分钟。</li>
		<li>将条形管置于磁力架上，待溶液澄清后，移除上清并弃去，随后用80%乙醇洗涤磁珠两次。让磁珠干燥1分钟。</li>
		<li>将条形管从磁力架上取下，向磁珠中加入表3中的35.5 μL洗脱液。用移液器吹打以充分重悬磁珠。室温孵育2分钟。</li>
		<li>将条形管放回磁力架，待溶液澄清后，将纯化的cDNA从条形管中转移至洁净的0.2 mL条形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增cDNA。
	<ol>
		<li>配制下方表4所示的扩增主混合液。</li>
		<li>向每个样品中加入65 μL cDNA扩增主混合液。将条形管放入热循环仪中，运行以下程序：98 °C 预变性3分钟 → 15个循环 [98 °C 变性15秒 → 67 °C 退火20秒 → 72 °C 延伸1分钟] → 72 °C 延伸5分钟 → 4 °C 保存 
		注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时，或在-20 °C长期保存。</li>
		<li>使用0.6倍体积的核酸片段大小选择磁珠纯化扩增后的cDNA。用80%乙醇洗涤两次，用40.5 μL洗脱液洗脱。</li>
		<li>采用自动化凝胶电泳和基于荧光的DNA定量检测方法对cDNA进行质量控制36,37。 
		注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时，或在-20 °C长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 测序文库构建
<ol>
	<li>对cDNA进行片段化（tagmentation）及纯化38。
	<ol>
		<li>将cDNA归一化至总体积20 μL中含50 ng。此步骤中精确的定量至关重要。</li>
		<li>配制表5中的片段化反应混合液，并在冰上将30 μL分装至每个20 μL的cDNA样品中。将样品放入热循环仪，运行片段化程序：55 °C 5 min → 10 °C 保持。</li>
		<li>使用纯化柱对片段化后的cDNA进行纯化38。向每个样品中加入180 μL DNA结合缓冲液。转移230 μL至离心柱中。</li>
		<li>在1300 x g条件下离心2 min，弃去穿流液。</li>
		<li>用300 μL DNA洗涤缓冲液洗涤两次。再于1300 x g离心2 min，以确保乙醇完全去除。</li>
		<li>向离心柱中加入31 μL洗脱缓冲液，室温孵育2 min，以洗脱纯化的片段化cDNA。</li>
		<li>在1300 x g条件下离心2 min，回收纯化产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本加索引PCR。
	<ol>
		<li>选择在多重测序运行中不会重叠的条形码。</li>
		<li>按表6所示配制样本索引PCR主混合液。</li>
		<li>向30 μL纯化样品中加入60 μL样本索引PCR主混合液。</li>
		<li>向每个样品中加入10 μL浓度为20 μM的4-寡核苷酸样本索引（记录所用索引）。此时总反应体积为100 μL。</li>
		<li>将样品放入热循环仪，热盖温度设为105 °C。运行以下程序：98 °C 45 s → 12-14个循环 [98 °C 20 s → 54 °C 30 s → 72 °C 20 s] → 72 °C 1 min → 4 °C 保持。 
		注意：此为安全暂停点。样品可在4 °C保存最多72小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用双轮磁珠纯化法纯化文库。
	<ol>
		<li>向样品中加入100 μL核酸片段大小选择磁珠，用移液器充分混匀。室温孵育5 min。</li>
		<li>将样品置于磁力架上，静置至溶液澄清。移除并弃去上清液。</li>
		<li>用200 μL 80%乙醇洗涤两次。</li>
		<li>在磁力架上干燥磁珠2 min。从磁力架上取下，向磁珠沉淀中加入50.5 μL EB缓冲液。用移液器吹打重悬磁珠。</li>
		<li>室温孵育2 min。转移至磁力架，静置2 min。将50 μL洗脱样品转移至新的八联管中。</li>
		<li>向样品中加入40 μL核酸片段大小选择磁珠，室温孵育5 min。转移至磁力架，待溶液澄清后，移除并弃去上清液。</li>
		<li>用125 μL 80%乙醇洗涤两次。</li>
		<li>在磁力架上干燥磁珠2 min。从磁力架上取下，向磁珠沉淀中加入60.5 μL EB缓冲液。用移液器吹打重悬磁珠。</li>
		<li>室温孵育2 min。转移至磁力架，静置2 min。将50 μL洗脱样品转移至新的八联管中。此即最终文库。</li>
		<li>样品可在4 °C保存最多72小时，或在-20 °C长期保存。注意：此为安全暂停点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用自动化凝胶电泳和基于荧光的DNA定量检测方法对最终文库进行定量和质量控制36,37。在进行质量控制前，将样品稀释1:10。</li>
</ol>
6. 文库测序
<ol>
	<li>将每个待测序样品归一化至 2 ng/μL，并将 3 μL 归一化后的各样品混合在一起。</li>
	<li>使用基于荧光的 DNA 定量分析法测定混合样品的浓度37。</li>
	<li>将混合样品稀释至 0.25 ng/μL。</li>
	<li>按如下方法对混合样品进行变性：12 μL 稀释后的混合样品（0.25 ng/μL）+ 1 μL DNA 对照（1 nM），2 μL EB 缓冲液 + 5 μL NaOH（0.4N）。室温孵育 5 分钟，然后加入 10 μL 200 mM Tris（pH 8.0）。</li>
	<li>将 4.05 μL 变性样品加入 1345.95 μL HT1 溶液中。取 1.3 mL 加入测序仪的试剂盒中，按照制造商指南39运行测序程序，测序方案为 26 个循环（Read 1）+ 8 个循环（i7 Index）+ 0 个循环（i5 Index）+ 55 个循环（Read 2）。</li>
</ol>
7. 读段比对（补充文件1）
<ol>
	<li>运行 Cell Ranger（v2.0.0）将测序产生的原始碱基识别（BCL）文件解复用为 FASTQ 文件。将 FASTQ 文件比对至人类 B37.3 基因组组装序列和 UCSC 基因模型，以获得基因表达定量结果。</li>
	<li>比对质量控制。
	<ol>
		<li>生成比对指标，并检查 Q30 碱基、有效条形码比例、与细胞相关的读段比例、比对上的读段比例以及每个细胞中检测到的读段数。</li>
		<li>检查条形码秩图，确保与细胞相关的条形码与背景之间有清晰分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析（补充文件 2）
<ol>
	<li>细胞质量控制与预处理。
	<ol>
		<li>排除检测到的基因数 &#60; 500、唯一分子标识符（UMI）总数 &#60; 3000、以及存活率评分 &#62; 0.2 的细胞，具体标准如前所述32。根据组织和细胞类型调整阈值。</li>
		<li>去除双细胞（doublets）。
		<ol>
			<li>使用 R 软件包 mclust40 分析五种内分泌激素基因（胰高血糖素 - GCG、胰岛素 - INS、生长抑素 - SST、胰多肽 - PPY 和胃饥饿素 - GHRL）的双峰表达模式（高表达和低表达模式）。</li>
			<li>去除表达超过一种激素基因的细胞，即具有两个或以上激素基因处于高表达模式的细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 R 软件包 Seurat41，在单细胞水平上根据总 UMI 对基因表达进行标准化，并乘以 10,000 的缩放因子。</li>
		<li>去除在少于 3 个细胞中被检测到的基因。</li>
		<li>基于所有细胞的平均表达量和离散度识别高变基因。根据组织和细胞类型调整阈值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用高变基因进行主成分分析。根据选定的主成分数量对细胞进行聚类。通过将某一细胞簇与其他所有细胞进行比较，鉴定各细胞簇富集的基因。</li>
</ol>

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<li>Muraro, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Cell+Transcriptome+Atlas+of+the+Human+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas.</a> Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).</li>
<li>Segerstolpe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptome+Profiling+of+Human+Pancreatic+Islets+in+Health+and+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).</li>
<li>Bose, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+microfluidics+for+single-cell+RNA+printing+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing.</a> Genome Biology. 16 (120), (2015).</li>
<li>Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling.+Combinatorial+labeling+of+single+cells+for+gene+expression+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry.</a> Science. 347 (6222), 1258367(2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Zheng, G. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8 (14049), (2017).</li>
<li>Dominguez Gutierrez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signature+of+the+Human+Pancreatic+epsilon+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell.</a> Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Cell+Transcriptomic+Map+of+the+Human+and+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas+Reveals+Inter-+and+Intra-cell+Population+Structure.+Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse.</a> Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type-specific+expression+changes+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li>
<li>Wang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptomics+of+the+Human+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas.</a> Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotime+Ordering+of+Single+Human+beta-Cells+Reveals+States+of+Insulin+Production+and+Unfolded+Protein+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response.</a> Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Sequencing+of+Single+Human+Islet+Cells+Reveals+Type+2+Diabetes+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).</li>
<li>Chemometec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nucleocounter+NC-250%3A+Cell+count+and+viability+assay%22">Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay</a>. , (2015).</li>
<li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2210X+Genomics%3A+Chromium+Single+Cell+3%E2%80%99+Reagents+Kits+v2%3A+User+Guide%22">10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide</a>. , 10X Genomics. (2017).</li>
<li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+Bioanalyzer%3A+High+Sensitivity+DNA+Kit+Guide%22">Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide</a>. , Agilent Technologies. (2013).</li>
<li>Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Qubit%3A+dsDNA+High+Sensitivity+Assay+Kit%22">Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit</a>. , Thermo Fischer Scientific. (2015).</li>
<li>Illumina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina+Nextera+DNA+Library+Prep+Reference+Guide%22">Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide</a>. , Illumina. (2016).</li>
<li>Illumina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22llumina+NextSeq+500+System+Guide%22">llumina NextSeq 500 System Guide</a>. , Illumina. (2018).</li>
<li>Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mclust+5%3A+Clustering%2C+Classification+and+Density+Estimation+Using+Gaussian+Finite+Mixture+Models%5BTitle%5D)+AND+%22R+J%22%5BJournal%5D)">mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models.</a> R J. 8 (1), 289-317 (2016).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single+cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Preprint+at+bioRixv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single cell data.</a> Preprint at bioRixv. , (2018).</li>
<li>DePasquale, E. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoubletDecon%3A+Cell-State+Aware+Removal+of+Single-Cell+RNA-Seq+Doublets%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoubletFinder%3A+Doublet+detection+in+single-cell+RNA+sequencing+data+using+artificial+nearest+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrublet%3A+computational+identification+of+cell+doublets+in+single-cell+transcriptomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Dominguez Gutierrez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Signature+of+Proliferating+Human+Pancreatic+alpha+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells.</a> Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

所有作者均为 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 的员工和股东。

近年来发展的单细胞技术为鉴定细胞类型和研究人类胰岛细胞的分子异质性提供了新平台。我们采用基于液滴微流控的单细胞分离与数据分析方案来研究人类胰岛。该方案成功获得了来自超过20,000个单个人类胰岛细胞的RNA测序数据，且测序质量与批次效应的变异相对较小。
具体而言，本方案中有两个步骤对获得高质量结果至关重要。在解离人胰岛时需格外小心，应注意避免过度消化胰岛。单细胞分液是成功开展单细胞实验的另一个关键步骤。我们在图3中展示了高质量与低质量乳浊液的示例。清晰的乳浊液通常表明在分液步骤中收集到的细胞数量不足。
获取分离的原代人胰岛是构建大规模人胰岛单细胞转录组的一个限速步骤。来自不同尸体供体的分离胰岛通常在不同时间进行处理，因此在数据分析过程中应仔细评估潜在的样本依赖性批次效应。整合分析可用于识别不同批次间共同的细胞类型和亚群41。批次效应也可通过批次校正的表达量量化方法进行调整42</sup...

胰岛释放内分泌激素以调节血糖水平。五种在功能和形态上各不相同的内分泌细胞参与这一重要功能：α细胞产生胰高血糖素，β细胞产生胰岛素，δ细胞产生生长抑素，PP细胞产生胰多肽，ε细胞产生饥饿素1。基因表达谱分析是表征正常或特定条件下内分泌细胞的有用方法。传统上，全胰岛基因表达谱通过微阵列和下一代RNA测序技术获得2,3,4,5,6,7,8。尽管全胰岛转录组有助于识别器官特异性转录本和疾病候选基因，却无法揭示每种胰岛细胞类型的分子异质性。激光显微切割（LCM）技术已被用于直接从胰岛中获取特定细胞类型9,10,11,12，但目标细胞群体的纯度仍不足。为克服这些局限，已采用荧光激活细胞分选（FACS）技术来分离特定的内分泌细胞群体，例如α细胞和β细胞13,14,15,16,17,18。此外，Dorrell 等人采用基于抗体的FACS分选方法将β细胞分为四个亚群19。经FACS分选的胰岛细胞还可用于单细胞RNA测序的培养；然而，基于培养板的方法在可扩展性方面面临挑战20,21,22。
为了获得每种内分泌细胞类型的高质量、大规模转录组数据，我们将微流控技术应用于人胰岛细胞。该微流控平台能够以高通量、高质量和可扩展的方式，从大量单细胞中生成转录组数据23,24,25,26,27。除了揭示大量捕获的细胞类型的分子特征外，当提供足够数量的细胞时，高度可扩展的微流控平台还能实现对稀有细胞类型的鉴定。因此，将该平台应用于人胰腺胰岛，使得对分泌饥饿素的ε细胞这一稀有内分泌细胞类型进行了分析；由于其数量稀少，该细胞类型的已知功能十分有限28。近年来，我们及他人已发表多项研究，报道了利用该技术获得的人胰岛大规模转录组数据29,30,31,32,33。这些数据均为公开资源，可供胰岛研究领域用于研究内分泌细胞的异质性及其在疾病中的意义。
本文介绍了一种基于液滴微流控技术的单细胞RNA测序方案，该方案已用于生成约20,000个人类胰岛细胞的转录组数据，包括α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、ε细胞以及少量非内分泌细胞32。该实验流程从分离的人类胰岛开始，涵盖了胰岛细胞解离、单细胞捕获及数据分析等步骤。该方案需使用新鲜分离的胰岛，适用于人类及其他物种（如啮齿类动物）的胰岛。利用此流程，可构建在基础状态及其他条件下无偏倚且全面的胰岛细胞图谱。

<table><tbody><tr><td>30 &amp;micro;m 预分离滤器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>细胞滤筛</td></tr><tr><td>8孔板</td><td>Chemometec</td><td>102673-680</td><td>Dell 计数法载玻片</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>安捷伦</td><td>5067-4626</td><td>用于质量控制</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>单细胞培养基</td></tr><tr><td>铬单细胞3'文库 &amp;amp; 凝胶珠试剂盒 v2，16次反应</td><td>10X Genomics</td><td>120237</td><td>单细胞试剂</td></tr><tr><td>Chromium单细胞A芯片试剂盒v2，48次反应（6个芯片）</td><td>10X Genomics</td><td>120236</td><td>微流控芯片</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>ThermoFisher</td><td>11530-037</td><td>完全胰岛培养基</td></tr><tr><td>EB缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>Eppendorf twin-tec 96孔PCR板，蓝色，半裙边</td><td>VWR</td><td>47744-112</td><td>乳液板</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-036</td><td>完全胰岛培养基</td></tr><tr><td>人胰岛</td><td>Prodo Labs</td><td>HIR</td><td>分离的人胰岛</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>完全胰岛培养基</td></tr><tr><td>Nextera DNA文库制备试剂盒（96个样本）</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1031</td><td>文库构建试剂</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 高输出试剂盒 v2.5（75 个循环）</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2005</td><td>测序</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>完全胰岛培养基</td></tr><tr><td>Qubit 高灵敏度 dsDNA 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>用于质量控制</td></tr><tr><td>溶液18</td><td>Chemometec</td><td>103011-420</td><td>细胞计数实验试剂</td></tr><tr><td>SPRISelect 试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>B23318</td><td>纯化珠</td></tr><tr><td>组织培养皿（10 cm）</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>用于胰岛培养</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td>细胞解离液</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean &amp;amp; 浓缩仪-5，50 次反应</td><td>VWR</td><td>77001-152</td><td>文库纯化柱</td></tr></tbody></table>

单细胞rna测序及人胰岛分析

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

胰岛由具有独特激素表达模式的内分泌细胞组成。这些内分泌细胞在正常和病理条件下表现出功能差异。本实验方案的目标是利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，获得每种内分泌细胞类型的高质量、大规模转录组数据。此类数据可用于构建在正常或特定条件下每种内分泌细胞类型的基因表达谱。该过程需要谨慎操作、精确测量以及严格的质控。在本方案中，我们详细描述了人胰岛组织的解离、测序及数据分析的具体步骤。约20,000个人类单胰岛细胞的代表性结果展示了该方案的成功应用。

单细胞RNA测序工作流程包括三个步骤：将完整的人胰岛解离为单细胞悬液，利用基于液滴的技术捕获单个细胞，以及分析RNA测序数据（图1）。首先，获取的人胰岛在夜间孵育。在显微镜下观察完整胰岛（图2A）。采用RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）技术验证解离后胰岛细胞的完整性。如图2B所示，分别使用GCG和INS mRNA探针对解离的α细胞和β细胞进行可视化。 
在单细胞捕获步骤之前，需要确定细胞数量和活力。活力较低或碎片较多的细胞不适合进行后续处理。理想的细胞浓度通常为 400 至 500 个细胞/µL在单细胞分离步骤中，将约6000个细胞加载至微流控芯片中， 100 μL 从芯片中移除了乳液中的凝胶珠。 <strong class="xfig...

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。

单细胞RNA测序及人胰岛分析

胰岛由具有独特激素表达模式的内分泌细胞组成。这些内分泌细胞在应对……时表现出功能差异。

该方案可生成单个人类胰岛细胞的高通量转录数据，可用于研究内分泌细胞异质性、鉴定稀有细胞类型以及疾病中的基因调控。该技术能够产生大规模的单细胞数据，操作简便，处理时间相对较短。该方法可应用于其他物种的胰岛细胞，也可用于分析其他新鲜分离的组织。然而，该方案需要优化以适应特定组织的解离程序。制备高质量的单细胞悬液至关重要。在单细胞分选前对细胞悬液进行质量控制非常关键，同时必须小心且快速地处理乳液。一些质量检查点，例如判断芯片是否堵塞，通过观察比阅读更直观。在获取人胰岛并过夜培养后，使用 P200 移液器计数并手动挑选 200 至 300 个胰岛。将胰岛转移至含有 5 毫升预热至 37°C 的完全胰岛培养基的 15 毫米锥形管中。将离心管放入离心机中，在200 × g条件下离心两分钟。小心吸走上清液，避免扰动管底的沉淀物。加入1 mm预热的细胞解离溶液，通过轻柔吹打上下混匀以充分分散沉淀。将胰岛在37摄氏度下孵育9至11分钟。每隔3分钟，缓慢吹打溶液上下10秒，以使细胞解离为单细胞。当胰岛细胞充分解离且溶液变浑浊后，加入9毫升完全胰岛培养基，通过30微米细胞滤网过滤至新的15毫升锥形管中。以400 × g离心5分钟收集细胞。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于200至300微升含0.4% BSA的1× PBS溶液中。随后，取10微升细胞悬液与0.5微升AO/DAPI混合。用移液器反复吹打混匀。取10.5微升样品滴加到载玻片上，使用基于荧光的全自动细胞计数仪进行细胞计数和活力检测。将微流控芯片放入芯片盒中。将芯片盒朝向调整妥当，确保油井一侧最靠近实验操作者。使用移液器将计算好的细胞体积加入已准备好的管条中。用移液器轻轻吹打混匀5次。不丢弃移液吸头，将90微升细胞混合液转移至芯片的第一行。等待30秒后，极其缓慢地移液，将40微升凝胶微珠加载至第二行。向第三行的孔中加入270微升分区油。将芯片垫圈钩到芯片支架的卡扣上。将组装好的芯片支架放入单细胞分选装置中，按下运行按钮。运行完成后，从支架上取下芯片垫圈，以45度角打开芯片外壳，将100 µL乳液从芯片转移至蓝色塑料65孔板的一个孔中。向每份乳液中加入125微升粉红色破乳试剂。等待1分钟后，将每个孔中的全部液体转移至各0.2毫升离心管中。确保管条中出现一层透明液体和一层粉红色液体。用移液器从管条底部吸取125微升粉红色层，注意不要扰动上层透明液体。管中残留约15微升粉红色液体属于正常现象。然后向每根管条中加入200微升纯化混合液，在室温下孵育10分钟。将管条转移至磁力架上，静置两分钟，使溶液澄清。移除上清液并弃去。随后用80%乙醇洗涤磁珠两次。让磁珠干燥一分钟。将管条从磁铁上取下，向磁珠中加入35.5 µL洗脱液。用移液器吹打使磁珠充分重悬于溶液中，并在室温下孵育两分钟。将管条转移至磁力架上，静置使溶液澄清。将纯化的互补DNA从

single-cell-rna-sequencing-and-analysis-of-human-pancreatic-islets

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

人类胰腺胰岛的单细胞RNA测序与分析

获得高质量且数量合适的胰岛是成功进行胰岛移植的重要前提之一。在本视频中，我们将逐步介绍采用改良自动化方法进行人胰腺胰岛分离的操作流程（第一部分：胰腺组织的消化与收集）。...

人胰岛分离：第一部分：胰腺组织的消化与收集

本文描述了用于大规模获取和分析免疫组织化学染色胰腺标本的新型计算机辅助方法：（1）整张切片的虚拟切片采集；（2）大规模数据的批量分析；（3）二维虚拟切片的重建；（4）胰岛的三维定位绘图；以及（5）数学分析。...

计算机辅助的大规模胰岛质量、大小分布及结构的可视化与定量分析

激光显微切割技术能够从微量的实质组织中分离特定细胞。本文描述了一种从手术标本中获取人胰腺胰岛用于转录组学研究的实验方案。该方案可增强人β细胞固有的自发荧光，从而便于其收集。...

改进的人类胰岛手术标本激光显微切割操作方案

离体胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。目前用于研究在天然三维结构中培养的胰岛的技术耗时长、效率低，且很少被使用。本研究介绍了一种简单、高效的新方法，可用于制备高质量的全培养胰岛石蜡切片。...

胰岛组织石蜡切片包埋

我们描述了一种从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞并进行单细胞RNA测序的方法。该方法可用于分析胰腺内分泌细胞谱系发育、细胞异质性及转录组动态变化。...

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析

本方案概述了一种针对人原代胰岛样本中β细胞的线粒体自噬蛋白复合物形成进行定量分析的方法。该技术因而能够利用有限的生物材料进行线粒体自噬分析，这对于珍贵的人胰腺β细胞样本至关重要。...

利用邻近连接技术原位可视化人胰岛β细胞中的内源性线粒体自噬复合物

在本方案中，使用专有的多平台应用程序中实现的计算算法对胰岛进行重建和分析。...

胰岛的计算重建作为结构与功能分析的工具

胰腺化生细胞是可发展为胰腺肿瘤的恶性细胞前体。然而，分离完整且具有活性的胰腺细胞具有挑战性。本文介绍一种高效的胰腺组织解离方法，所获得的细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维、三维共培养实验。...

胰腺组织解离以分离有活力的单细胞

本方案描述了一种利用腺病毒递送环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器和cAMP差异检测器，对原代人源拟胰岛中细胞内信号传导事件与胰岛素及胰高血糖素分泌进行同步采集与共定位分析的方法。 原位 （cADDis）和微型灌流系统。...

用于同步评估荧光生物传感器动态与激素分泌谱的人类伪胰岛系统

本方案描述了从小鼠完整胰腺中分离内皮细胞的方法。...

小鼠胰腺内皮细胞的分离

本方案描述了从冷冻的非人灵长类动物胰岛中分离高质量细胞核的步骤，可用于进行单细胞核同时RNA测序和ATAC测序，同时保留同一标本中的大部分胞质组分，以用于代谢组学分析。...

制备用于联合单核RNA测序与ATAC测序及整体代谢组学分析的非人灵长类胎儿胰岛冻存样本

学习使用液滴微流控单细胞RNA测序技术对人类胰腺胰岛细胞进行高通量转录组分析，识别稀有细胞类型并研究疾病中的基因调控机制。该方法适用于多种物种的胰岛组织。

单细胞RNA测序及人胰岛分析

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