集成细胞操控平台与单探针联用技术用于悬浮单细胞中药物及代谢物的质谱分析

由于该方法可分析溶液中的细胞，因此可用于研究接近天然环境中的细胞，包括患者来源的细胞样本分析。该技术对细胞样本的预处理要求极低或无需预处理。

因此，我们可以在常温条件下在线分析单个细胞，从而探索细胞异质性。该技术可应用于研究多种不同疾病状态下的液体活检样本，因为它能够直接分析从患者样本中分离出的不同类型细胞。要将单孔玻璃管加工成具有尖锐尖端的锥形探针，首先将单孔玻璃管放入垂直移液管固定器的夹具中，使玻璃管相对于加热线圈居中，然后拧紧夹具以固定玻璃管。

加热线圈由18号镍铬电阻丝缠绕在金属棒上2.5圈构成。将玻璃管的温度程序设置为19.5。将电磁阀柱塞设置在4的位置。

触发电磁阀以拉动玻璃毛细管。此步骤可在尖端形成两个融合在一起的探针。使用断头法在每个探针尖端约一毫米处进行切割，使探针尖端形成直径约为10微米的开口。

为了弯曲玻璃探针以便于与ICMP耦合，采用单探针SCMS装置。首先将拉制好的玻璃探针放入显微操作仪中，使其顶端位于铂加热丝上方约三毫米处。

然后，将铂丝加热至最高温度的30%。将探针从原始位置弯曲约45度。将倒置显微镜显微注射装置放置在电动载物台上的两个细胞操作系统中，以便于与质谱仪轻松耦合。

安装玻璃细胞筛选装置时，将玻璃细胞筛选探针的长端插入显微注射仪的毛细管夹持器内，并拧紧螺丝以固定探针。调整探针尖端，使其与加热板呈平行倾斜状态。将显微注射仪的金属夹持器牢固安装至细胞操作系统中。

然后将探针尖端置于倒置显微镜光源的近中央位置。将含有单根探针的玻片固定在细胞操作系统的臂夹中。通过将毛细管插入塑料卡套的套筒内，并用手拧紧接头，将提供溶剂的毛细管连接至导电接头。

将导电接头的另一端连接至毛细管，该毛细管与装有采样溶剂的注射器相连，方法是将毛细管插入套管中并拧紧接头。在本实验中，使用含0.1%甲酸的乙腈作为采样溶剂。将注射器固定在质谱仪的注射泵上。

将纳米电喷雾电离（nanoelectrospray ionization）或纳米ESI发射器置于延伸离子传输管入口约一毫米处。使用细胞操作系统控制单探针的空间移动，将纳米ESI发射器精准地位于延伸离子传输管前端中央位置。用移液器将细胞从细胞培养瓶中转移至15毫升离心管中。

在37°C下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于4 mL含有药物化合物的RPMI培养基中，药物浓度为所需的处理浓度。根据实验需求优化质谱仪的实验参数。

在仪器软件的“扫描模式”标题下，选择“定义扫描”。参数设置为：在 m/z 400 处分辨率为 60,000，单次微扫描，最大注入时间为 100 毫秒，自动增益控制开启。在进样泵设置中，选择流速为 150 纳升每分钟。

选择NSI源并施加约4.5千伏的电压。打开倒置显微镜，并将顶板和底透镜的放大倍数均设为40倍。将其连接到笔记本电脑的USB端口，以捕获实时视频。

打开加热板并将其温度设置为 37 摄氏度。在计算机上，进入“采集数据”选项卡，并在采集时间下选择“连续”。为准备用于分析的样品，用移液器吸取 2 至 3 微升样品至小型培养皿的皿盖中。

将样品置于倒置显微镜光源中央，位于加热板上方。准备玻璃细胞选择探针以进行分析。使用细胞操作系统移动探针，使其顶端在倒置显微镜下聚焦，并与细胞处于同一焦平面。

使用细胞操作系统将细胞选择探针的尖端移动至目标细胞以进行分析。此过程通过倒置显微镜进行监测。轻轻转动显微注射仪的手柄，调节管路内矿物油的位置。

通过显微注射仪提供轻柔的负压，将目标细胞固定在细胞选择探针尖端。使用细胞操作系统，在数字显微镜聚焦于单个探针尖端以监控该过程的条件下，将位于细胞选择探针尖端的细胞移至单个探针尖端。采用未经处理的K-562细胞建立实验方法。

在典型的SCMS实验中，从细胞转移至检测细胞内容物再到测量结束，可以观察到质谱的明显变化。通过监测三种常见的细胞脂质峰PC 34:4、PC 36:4和PC 38:5，以确认细胞已成功转移并检测到细胞内容物。在未经处理的细胞裂解液样本上进行MS/MS分析，可确认750至850质荷比范围内多种磷脂酰胆碱（PC）的分子身份。

使用ICMP单探针质谱装置，在K-562细胞孵育后检测到了吉西他滨、紫杉醇和OSW1。这些结果表明，该方法可用于在接近天然的环境中，对溶液中的单个细胞内的脂质、药物及代谢物进行单细胞水平的研究。请务必将玻璃细胞选择探针牢固地插入通用移液器支架中，以确保能够充分施加负压。

该方法也可应用于患者来源的样本，以区分多种细胞类型间细胞代谢物的差异，从而帮助我们更深入地理解这些疾病状态。在建立该方法后，我们有望实现对单细胞水平药物化合物的定量分析。在处理细胞时，必须配备适当的个人防护装备，包括实验服和手套。

处理玻璃时可佩戴额外的眼部防护装备。