Name: 高产细胞外囊泡制剂的纯化远离病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 学习细胞外囊泡高效纯化技术，通过密度梯度超速离心和纳米颗粒捕获实现病毒分离。该方法适用于HIV、埃博拉等病毒系统的EV研究，回收率显著优于传统超速离心法。

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我们感谢Kashanchi实验室的所有成员，特别是Gwen Cox。本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（项目编号：AI078859、AI074410、AI127351-01、AI043894和NS099029，授予F.K.）的支持。

1. 细胞外囊泡（EVs）的过滤与沉淀
<ol>
	<li>为制备感染或转染细胞（即细胞系和/或原代细胞）的培养上清液，将约10 mL处于对数生长后期的细胞在适当的培养基（如含10%胎牛血清[FBS]的RPMI或DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养5天。 
	注意：所有培养基试剂应无细胞外囊泡（EV）污染，可直接购买（参见材料表），或通过在100,000 × g条件下预先超速离心血清90分钟自制。本方案已成功应用于多种常用细胞系，包括：CEM、Jurkat、293T、U937（未感染细胞系），U1、J1.1、ACH2、HUT102、MT-2（HIV-1和HTLV-1感染细胞系），多种转染细胞，以及原代髓系细胞和T细胞（感染与未感染状态）；然而，该方案亦可用于任何细胞类型，包括需要特殊培养基或培养条件的细胞。不同细胞类型的细胞密度可能需要优化。建议在培养5天后使用尽可能高的细胞密度，同时保持最低程度的细胞死亡。</li>
	<li>将培养物在3,000 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞，并弃去细胞沉淀。</li>
	<li>使用无菌0.22 µm滤器过滤培养上清液，并将滤液收集至洁净离心管中。</li>
	<li>向滤过的上清液中加入等体积的聚乙二醇（PEG）沉淀试剂（1:1比例），反复倒置离心管数次以确保混合均匀。 
	注意：切勿&#160;涡旋振荡。</li>
	<li>将混合物于4 °C过夜（O/N）孵育。</li>
	<li>在室温（RT）下以1,500 × g离心30分钟，获得形态异质的EV沉淀。 
	注意：EV沉淀通常呈白色或近白色。</li>
	<li>弃去去除EV后的培养上清液。</li>
	<li>用150–300 µL不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬EV沉淀，并置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 密度梯度的构建
<ol>
	<li>将碘克沙醇密度梯度介质与1×PBS混合，在不同的微量离心管中配制11种1 mL的密度梯度溶液，碘克沙醇浓度从6%到18%，以1.2%为增量递增，如图1A所示。</li>
	<li>涡旋振荡每支试管以充分混匀。</li>
	<li>将各密度梯度溶液逐层加入已预先清洗并干燥的摆动转子超速离心管中，从18%的溶液（#18）开始，至6%的溶液（#6）结束，如图1B所示。 
	注意：所有离心管应在装载梯度溶液前，先用10%次氯酸钠溶液喷洒消毒，随后用去离子水冲洗3次，并用无菌去离子水进行最终清洗。</li>
	<li>将重悬的EV沉淀（300 µL）小心加至超速离心管中已分层的梯度顶部。</li>
	<li>在4 °C条件下，以100,000 × g 离心90分钟。</li>
	<li>小心从超速离心管中逐层收集1 mL的各梯度组分，并分别转移至新的微量离心管中。</li>
</ol>
3. 使用纳米颗粒富集细胞外囊泡组分
<ol>
	<li>使用等体积的 NT80、NT82 和 1× PBS 制备含有 30% 纳米颗粒的悬浮液。 
	注意：使用前应涡旋混合，以确保均匀性。</li>
	<li>向每根含有密度梯度组分的微量离心管中加入 30 µL 悬浮液，并通过移液器吹打或倒置数次充分混匀。</li>
	<li>将含有纳米颗粒并富集 EV 的密度梯度组分微量离心管在 4 °C、约 20 rpm 条件下旋转过夜（O/N）。</li>
	<li>在室温下以 20,000 × g 离心 5 分钟，对密度梯度组分微量离心管进行离心。</li>
	<li>弃去上清液，并用 1× PBS 将 EV 沉淀洗涤两次。 
	注意：纳米颗粒沉淀可在 -20 °C 冻存，或直接用于后续多种检测（如 PCR、Western blot、质谱分析及其他检测）。</li>
</ol>
4. 下游检测中纳米颗粒沉淀物的推荐制备方法
<ol>
	<li>用于RNA提取
	<ol>
		<li>将沉淀重悬于50 µL经0.001%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理并用0.2 µm滤膜过滤的灭菌去离子水中，然后根据试剂盒制造商的说明书提取RNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于凝胶电泳
	<ol>
		<li>直接将沉淀重悬于15 µL Laemmli缓冲液中。</li>
		<li>在95 °C下加热样品3次，每次3分钟，每次加热之间轻轻涡旋并短暂离心。</li>
		<li>以20,000 x g离心15秒，然后将全部洗脱物直接上样至凝胶。 
		注意：为获得最佳结果，应限制上样至凝胶的颗粒物量，并以100 V电压运行凝胶，以确保任何残留颗粒保留在加样孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于胰蛋白酶消化
	<ol>
		<li>在进行烷基化和胰蛋白酶消化前，将沉淀重悬于20 µL尿素中。纳米颗粒可通过在室温下以14,000 x g离心10分钟沉淀。含有胰蛋白酶消化肽段的样品可转移至新的收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).</li>
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</ol>

B.L. 与中国台湾的 Ceres Nanosciences 公司有关联，该公司生产本文所使用的试剂和/或仪器。其他所有作者均声明不存在潜在的利益冲突。

本方案通过联合分离方法，可提高细胞外囊泡（EV）的得率，并实现病毒与EV的有效分离。在进行沉淀法EV分离、密度梯度（DG）分离及纳米颗粒富集之前，可对相对大量的起始材料（即细胞上清液）进行过滤处理，最终获得约30 µL的浓缩体积，便于直接用于多种下游检测。采用纳米颗粒富集步骤至关重要，因为与传统的超速离心法相比，这些EV富集型纳米颗粒已被证明能更高效地捕获囊泡，从1 mL培养上清液中获得的囊泡数量至少相当于10 mL经超速离心处理的培养上清液所得囊泡量15。总体而言，本方案整合了多种成熟技术，因此操作难度较低。然而，引入EV富集纳米颗粒属于较新的技术，可能需要根据具体的下游检测或研究的生物学靶标进行故障排查和/或方法优化。我们建议将纳米颗粒与过滤后的细胞培养上清液在4℃孵育过夜。若目标蛋白或RNA在模型系统中丰度较低，可适当延长孵育时间以确保充分捕获目标分子。在下游检测中使用纳米颗粒时，通常可通过将沉淀重悬于各检测所需的样品缓冲液中实现。例如，纳米颗粒可直接重悬于Laemmli缓冲液中用于Western blot分析。为更有效地将捕获物质从纳米颗粒中洗脱出来，建议通过加热和涡旋震荡循环促进...

以外泌体（exosome）为代表的细胞外囊泡（EV）研究，主要聚焦于直径在30–120 nm之间、并具有三种四跨膜蛋白标志物CD81、CD9和CD63的EV亚群，其发展在很大程度上依赖于分离和纯化目标囊泡的方法学进步。由于现有技术复杂且耗时，所获得的样本通常包含通过不同途径产生、在内容物、大小和密度上具有高度异质性的囊泡群体，从而限制了对多层面机制的深入解析。尽管这一问题几乎影响所有EV研究，但在病毒感染背景下研究EV时尤为关键，因为病毒颗粒（virion）和病毒样颗粒（VLP）的直径可能与目标囊泡相近。例如，人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的直径约为100 nm，与多种EV的尺寸大致相同。鉴于此，我们设计了一种新型的EV分离流程，以解决上述问题。
目前细胞外囊泡（EV）分离的金标准是超速离心法。该技术利用不同囊泡的密度差异，通过差速离心使高密度颗粒与低密度颗粒在各阶段发生差异性沉降，从而实现分离1,2。该方法需要经过多个低速离心步骤，以去除完整细胞（300–400 × g，10 分钟）、细胞碎片（约 2,000 × g，10 分钟）以及凋亡小体/大囊泡（约 10,000 × g，10 分钟）。初步纯化后，再通过高速超速离心（100,000–200,000 × g，1.5–2 小时）使EV沉淀。为进一步提高EV纯度，还需进行洗涤步骤，但这会导致所分离EV数量减少，从而降低总得率3,4。此外，该方法需要大量细胞（约 1 × 108 个）和大体积样本（&#62; 100 mL）才能获得理想结果，这进一步限制了其应用。
为应对日益增长的关切，近年来利用亲水性聚合物沉淀囊泡已成为一种有用的技术。聚乙二醇（PEG）或其他相关沉淀试剂可使用户通过将样品与所选试剂孵育，再经过一次低速离心，即可沉淀样品中的囊泡、病毒以及蛋白质或蛋白质-RNA聚集体1,2,5。我们此前曾报道，与传统的超速离心法相比，使用PEG或相关方法沉淀细胞外囊泡（EVs）可显著提高得率6。该策略快速、简便，无需额外昂贵设备，易于放大，并能保持EV的结构完整性。然而，由于该方法具有非特异性，所得样品中包含多种成分，如游离蛋白质、蛋白质复合物、多种EV以及病毒颗粒，因此需要进一步纯化以获得目标组分1,2,7,8。
为了克服通过不同沉淀方法获得的细胞外囊泡（EVs）存在的异质性问题，常采用密度梯度超速离心法（DG）根据颗粒的密度实现更优的分离。该方法利用密度梯度介质（如碘克沙醇或蔗糖）建立阶梯式梯度，从而实现EVs与蛋白质、蛋白复合物以及病毒或病毒样颗粒（VLPs）的分离。需要注意的是，尽管过去认为DG能够更精确地分离EV的不同亚群，但现在已知不同囊泡的大小和密度可能存在重叠。例如，外泌体的漂浮密度为1.08–1.22 g/mL9，而来自高尔基体（COPI+ 或网格蛋白+）的囊泡密度为1.05–1.12 g/mL，内质网来源的囊泡（COPII+）则沉降于1.18–1.25 g/mL1,2,3,4,9。此外，若需将外泌体组分与含有病毒颗粒的组分进行比较，其难度可能取决于目标病毒的密度——除HIV-1外，还存在其他可能与外泌体阳性组分在相同密度下达到平衡的病毒2。
最后，为了进行后续的可视化和功能分析，对细胞外囊泡（EV）样本进行富集是EV研究中的关键步骤。使用能够富集EV的纳米颗粒，特别是直径为700–800 nm的多功能水凝胶颗粒，是获得高浓度EV样本的关键环节。这些纳米颗粒具有高亲和力的芳香族捕获基团，并被多孔的外层筛分壳所包裹，以提高选择性。本研究中使用的纳米颗粒包含两种不同核心捕获基团的制剂（Reactive Red 120 NT80 和 Cibacron Blue F3GA NT82），已证明可增强从多种试剂和生物流体中捕获EV的效果（见材料表）6,10,11,12,13,14,15。这些颗粒可从多种起始材料中便捷地富集EV，包括碘克沙醇组分、细胞培养上清液，以及患者生物流体，如血浆、血清、脑脊液（CSF）和尿液6,13。
本文介绍的方法通过结合多种技术——EV 沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获，提高了现有EV纯化技术的效率，简化了操作流程，减少了样本需求量，并提高了产量，从而获得更均一的EV样本，适用于所有EV相关研究。该方法在研究病毒感染过程中EV及其内容物时尤为有用，因为它包含一步0.22 µm过滤，以去除较大的非目标囊泡和病毒样颗粒（VLPs），并通过密度分离总EV群体，从而有效将EV与病毒颗粒区分开来。

<table><tbody><tr><td>CEM CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 细胞</td><td>NIH 艾滋病试剂计划</td><td>117</td><td>CEM</td></tr><tr><td>不含 Ca 和 Mg 的 DPBS (1x)</td><td>Quality Biological</td><td>114-057-101</td><td></td></tr><tr><td>ExoMAX Opti-Enhancer</td><td>Systems Biosciences</td><td>EXOMAX24A-1</td><td>PEG 沉淀试剂</td></tr><tr><td>外泌体耗竭型胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB3</td><td>血清</td></tr><tr><td>HIV-1 感染的 U937 细胞</td><td>NIH 艾滋病试剂计划</td><td>165</td><td>U1</td></tr><tr><td>Nalgene 注射器滤器 0.2 &amp;micro;m SFCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Nanotrap (NT80)</td><td>Ceres Nanosciences</td><td>CN1030</td><td>Reactive Red 120 核心</td></tr><tr><td>Nanotrap (NT82)</td><td>Ceres Nanosciences</td><td>CN2010</td><td>Cibacron Blue F3GA 核心</td></tr><tr><td>Optima XE-980 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 密度梯度介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250mL</td><td>碘克沙醇</td></tr><tr><td>SW 41 Ti 摆桶转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管，14 mm × 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr></tbody></table>

高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

目前细胞外囊泡（EV）研究领域的主要难题之一是在病毒感染环境下获得高纯度的EV制备物。本方法旨在将EV与病毒颗粒（如HIV-1）分离，相较于传统的超速离心法，具有更高的效率和得率。我们的实验流程包含三个步骤：EV沉淀、密度梯度分离和颗粒捕获。在完成颗粒捕获后，可直接进行后续检测分析（如蛋白质印迹和PCR）。与其他分离方法（如超速离心法）相比，该方法的优势在于仅需极小的起始样本体积。此外，相较于需要多次超速离心的其他EV分离方法，本方法操作更为简便。然而，该方法在功能性EV检测方面的应用存在一定局限，因为从颗粒上洗脱出完整EV较为困难。此外，该方法主要适用于基础科研环境，尚不具备商业化应用的可行性。

PEG 沉淀可提高细胞外囊泡（EV）的得率 
与传统的超速离心法相比，我们采用的联合分离方法在EV回收效率方面显著更高，这一点从所需起始材料体积减少了90%即可明显看出。目前EV分离的金标准——超速离心法，通常需要约100 mL的培养上清液才能制备出足够用于下游检测的EV样品，而我们的新方案仅需10 mL。这一显著减少得以实现，主要得益于使用了PEG EV沉淀试剂，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定，该试剂可显著提高EV的产量。如图2A所示的结果（此前已发表6）表明，使用10 mL培养上清液时，PEG沉淀法可回收7.27 × 1010个EV，约为使用相同起始材料进行超速离心法所回收EV数量（1.45 × 108）的500倍。在特定EV亚型——外泌体（exosome）的分离效率方面也观察到了提升，表现为特征明确的外泌体标志蛋白CD81、CD63和CD9的水平显著升高。采用Western...

本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。

目前细胞外囊泡（EV）研究领域的主要难题之一是在病毒感染条件下获得纯化的EV制备物……

本方案具有重要意义，因为它通过结合多种技术浓缩细胞外囊泡（EVs），同时实现病毒颗粒与细胞外囊泡的分离。该方法在多种下游分析和无病毒EV制备物的表征方面，其EV回收率高于当前超速离心的金标准。本方案非常适合细胞外囊泡及病毒感染的研究。该方法可适用于其他病毒系统，例如 HTLV、埃博拉病毒、寨卡病毒等。初次使用该方法的研究人员可能在纳米颗粒制备过程中遇到困难，因此我们建议严格遵循我们的操作规范。根据具体实验系统，可能需要进行一定的优化。对该方法进行可视化演示，对于展示整个实验流程和操作细节至关重要，这将减少初次使用者所需的时间和错误。首先从感染或转染的细胞中制备培养上清液。在37°C和5%二氧化碳条件下，将约10毫升处于对数生长后期的细胞培养五天，确保所有培养基试剂均不含细胞外囊泡。当培养物准备就绪后，以 3,000 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去沉淀。用无菌的 0.22 微米滤器过滤上清液，并将滤液收集至洁净离心管中。向滤液中加入等体积的 PEG 沉淀试剂，反复倒置离心管以充分混匀。将混合物在4°C下孵育过夜。孵育结束后，以1500 × g离心30分钟，获得异质性细胞外囊泡（EV）沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于150至300 µL不含钙和镁的1× PBS中。在准备密度梯度的同时，将沉淀物置于冰上保存。按照文中所述方法，用碘克沙醇配制密度梯度介质，共11个密度梯度，密度范围为6%至18%碘克沙醇。每管涡旋混匀后，将各密度梯度组分依次叠加至洁净干燥的摆动桶式超速离心管中。将重悬的EV沉淀加至密度梯度顶部，在4°C条件下以10,000 × g超速离心90分钟。小心地将超速离心管中的每一份级分转移至新的微量离心管中。通过混合等体积的NT80、NT82和1×PBS，制备30%的纳米颗粒悬液，用于EV组分的富集。涡旋纳米颗粒混合物以确保均匀性。向每份密度梯度组分中加入30 µL悬液，并通过移液或倒置试管进行混匀。最关键的步骤是在密度梯度分离后，加入纳米颗粒以浓缩细胞外囊泡（EV）。若无此步骤，EV 的回收率会很低。将含有纳米颗粒的密度梯度组分在 4 摄氏度下旋转过夜。然后在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，并用1×PBS洗涤EV沉淀两次。为准备进行RNA提取，根据文稿说明，将沉淀重悬于50微升经高压灭菌、去离子、过滤并经depsy处理的水中。随后可使用 commercial kit 提取RNA。进行凝胶电泳分析时，将沉淀重悬于15 µL Laemmli缓冲液中。将样品在95 °C加热3分钟。重复此加热步骤两次，每次加热之间轻轻涡旋混匀并短暂离心样品。在20,000 ×g 条件下离心样品15秒，然后直接将上清液加样至凝胶中。为获得最佳结果，应限制加样至凝胶中的颗粒量，并在100伏电压下电泳，以防止任何加载的纳米颗粒进入凝胶。与传统的超速离心法相比，聚乙二醇（PEG）沉淀法可显著提高细胞外囊泡（EV）的回收效率。使用 10 毫升培养液时，该方法的产量比超速离心法高出约 500 倍。该方法还可提高外泌体的分离效率，表现为外泌体标志蛋白水平显著升高。Western PLA 分析显示，CD81 增加了 3000 倍，CD63 增加了 4 倍，CD9 增加了 40 倍。此外，该方案通过从病毒颗粒中分离细胞外囊泡（EV），可进一步研究EV介导的HIV1感染机制。Western PLA分析显示，EV存在于三个组分群体中，而病毒仅存在于其中两个组分中。EV 的 10.8 至 12 级分无病毒污染。需要牢记最重要的一点是，纳米颗粒对于实现最佳 EV 富集至关重要，必须添加。许多下游检测，如蛋白质印迹、PCR、基于质谱的纯二甲基化分析以及基于培养板的细胞检测均可进行。这些检测可用于表征、机制和/或功能研究。该技术能够实现对细胞外囊泡（EV）内容物及功能的特异性研究，且不会受到病毒背景污染的干扰。这为研究细胞外囊泡（EV）在发病机制中的作用以及潜在治疗手段的开发提供了基础。为了克服该技术的局限性，并将EV的制备与分离应用于大体积样本，我们建议使用先进的系统，例如切向流过滤。在密度梯度分离过程中，最危险的仪器是超速离心机。确保所有离心管重量相同，以避免失衡和潜在的转子故障。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

高产细胞外囊泡制剂的纯化远离病毒

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：DeMarino, C.，等．远离病毒的高产量细胞外囊泡制备物的纯化．J. Vis. Exp.

在病毒颗粒共存条件下细胞外囊泡的分离与富集

本视频介绍了从新鲜或冷冻组织中提取细胞外囊泡的技术。分离得到的细胞外囊泡可用于进一步分析，以揭示其在疾病发病机制中的重要作用。...

细胞外囊泡提取：利用差速离心法从完整组织样本中分离细胞外囊泡的技术

关键词：细胞外囊泡，差速离心，组织样本，分离技术，生物标志物，液体活检

本视频展示了基于密度梯度超速离心的纯化方法，用于分离适合进行表征研究的细胞外囊泡亚群。...

细胞外囊泡亚群的纯化：利用密度梯度超速离心法纯化细胞外囊泡亚群的技术

本方案用于从肝脏中分离组织来源的细胞外囊泡（EVs）。该方案描述了一个两步法流程，包括先进行胶原酶灌注，再通过差速超速离心，以分离肝脏组织中的细胞外囊泡。...

从肝脏中分离组织细胞外囊泡

细菌会分泌携带生物活性分子的纳米级细胞外囊泡（EVs）。EV研究主要关注其生物发生机制、在微生物间及宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及潜在的治疗应用。本文介绍了一种可放大的从多种细菌中分离EV的方法流程，以促进EV研究的标准化。...

可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

本方案详细描述了从蓝细菌培养物中分离、浓缩和表征细胞外囊泡的方法。同时讨论了从不同规模培养物中纯化囊泡的技术路径、各方法之间的权衡，以及处理野外样品时的注意事项。...

蓝细菌胞外囊泡的分离与表征

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。...

利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。...

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过...

利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

学习细胞外囊泡高效纯化技术，通过密度梯度超速离心和纳米颗粒捕获实现病毒分离。该方法适用于HIV、埃博拉等病毒系统的EV研究，回收率显著优于传统超速离心法。

高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

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