高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

本方案具有重要意义，因为它通过结合多种技术浓缩细胞外囊泡（EVs），同时实现病毒颗粒与细胞外囊泡的分离。该方法在多种下游分析和无病毒EV制备物的表征方面，其EV回收率高于当前超速离心的金标准。本方案非常适合细胞外囊泡及病毒感染的研究。

该方法可适用于其他病毒系统，例如 HTLV、埃博拉病毒、寨卡病毒等。初次使用该方法的研究人员可能在纳米颗粒制备过程中遇到困难，因此我们建议严格遵循我们的操作规范。根据具体实验系统，可能需要进行一定的优化。

对该方法进行可视化演示，对于展示整个实验流程和操作细节至关重要，这将减少初次使用者所需的时间和错误。首先从感染或转染的细胞中制备培养上清液。在37°C和5%二氧化碳条件下，将约10毫升处于对数生长后期的细胞培养五天，确保所有培养基试剂均不含细胞外囊泡。

当培养物准备就绪后，以 3,000 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去沉淀。用无菌的 0.22 微米滤器过滤上清液，并将滤液收集至洁净离心管中。向滤液中加入等体积的 PEG 沉淀试剂，反复倒置离心管以充分混匀。

将混合物在4°C下孵育过夜。孵育结束后，以1500 × g离心30分钟，获得异质性细胞外囊泡（EV）沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于150至300 µL不含钙和镁的1× PBS中。

在准备密度梯度的同时，将沉淀物置于冰上保存。按照文中所述方法，用碘克沙醇配制密度梯度介质，共11个密度梯度，密度范围为6%至18%碘克沙醇。每管涡旋混匀后，将各密度梯度组分依次叠加至洁净干燥的摆动桶式超速离心管中。

将重悬的EV沉淀加至密度梯度顶部，在4°C条件下以10,000 × g超速离心90分钟。小心地将超速离心管中的每一份级分转移至新的微量离心管中。通过混合等体积的NT80、NT82和1×PBS，制备30%的纳米颗粒悬液，用于EV组分的富集。

涡旋纳米颗粒混合物以确保均匀性。向每份密度梯度组分中加入30 µL悬液，并通过移液或倒置试管进行混匀。最关键的步骤是在密度梯度分离后，加入纳米颗粒以浓缩细胞外囊泡（EV）。

若无此步骤，EV 的回收率会很低。将含有纳米颗粒的密度梯度组分在 4 摄氏度下旋转过夜。然后在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。

弃去上清液，并用1×PBS洗涤EV沉淀两次。为准备进行RNA提取，根据文稿说明，将沉淀重悬于50微升经高压灭菌、去离子、过滤并经depsy处理的水中。随后可使用 commercial kit 提取RNA。

进行凝胶电泳分析时，将沉淀重悬于15 µL Laemmli缓冲液中。将样品在95 °C加热3分钟。重复此加热步骤两次，每次加热之间轻轻涡旋混匀并短暂离心样品。

在20,000 ×g 条件下离心样品15秒，然后直接将上清液加样至凝胶中。为获得最佳结果，应限制加样至凝胶中的颗粒量，并在100伏电压下电泳，以防止任何加载的纳米颗粒进入凝胶。与传统的超速离心法相比，聚乙二醇（PEG）沉淀法可显著提高细胞外囊泡（EV）的回收效率。

使用 10 毫升培养液时，该方法的产量比超速离心法高出约 500 倍。该方法还可提高外泌体的分离效率，表现为外泌体标志蛋白水平显著升高。Western PLA 分析显示，CD81 增加了 3000 倍，CD63 增加了 4 倍，CD9 增加了 40 倍。

此外，该方案通过从病毒颗粒中分离细胞外囊泡（EV），可进一步研究EV介导的HIV1感染机制。Western PLA分析显示，EV存在于三个组分群体中，而病毒仅存在于其中两个组分中。

EV 的 10.8 至 12 级分无病毒污染。需要牢记最重要的一点是，纳米颗粒对于实现最佳 EV 富集至关重要，必须添加。

许多下游检测，如蛋白质印迹、PCR、基于质谱的纯二甲基化分析以及基于培养板的细胞检测均可进行。这些检测可用于表征、机制和/或功能研究。该技术能够实现对细胞外囊泡（EV）内容物及功能的特异性研究，且不会受到病毒背景污染的干扰。

这为研究细胞外囊泡（EV）在发病机制中的作用以及潜在治疗手段的开发提供了基础。为了克服该技术的局限性，并将EV的制备与分离应用于大体积样本，我们建议使用先进的系统，例如切向流过滤。在密度梯度分离过程中，最危险的仪器是超速离心机。

确保所有离心管重量相同，以避免失衡和潜在的转子故障。