Name: 来自胚胎GFP-表达小鼠的Ex Vivo Oculo运动切片培养,用于对Oculo运动神经外生长进行时移成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 学习离体切片培养技术，用于实时成像追踪小鼠动眼神经轴突生长。该方法保留局部微环境，可评估轴突导向机制，为发育神经生物学研究提供重要工具。

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由美国国立眼科研究所 [5K08EY027850]、美国国立儿童健康与人类发育研究所 [U54HD090255]、哈佛大学-视觉临床科学家发展项目 [5K12EY016335]、骑士圣殿眼科基金会 [职业启动资助] 和儿童医院眼科基金会 [教员探索奖] 提供资助。ECE 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

本文所述所有动物实验均经波士顿儿童医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并依照其规程执行。
1. 定时交配
<ol>
	<li>将 ISLMN:GFP（胰岛运动神经元绿色荧光蛋白；MGI: J:132726；Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J 货号:&#160;017952）雄性和雌性小鼠于夜间合笼交配。称量雌鼠体重，并在交配前记录体重。 
	注意：ISLMN:GFP 可特异性标记运动神经元，其表达的法尼基化绿色荧光蛋白（GFP）无细胞毒性，定位于运动神经元及其轴突的细胞膜，可在发育过程中实现神经的可视化25。其他荧光标记品系也可使用。</li>
	<li>于清晨检查阴道栓。发现阴道栓的当天记为 E0.5。</li>
	<li>在 E10.5 时通过体重增加和/或超声确认妊娠。妊娠母鼠体重应至少增加 1 g。在 E10.5 时可通过超声观察到胚胎。</li>
</ol>
2. 准备&#160;切片培养所需的试剂和振动切片机
<ol>
	<li>配制 500 mL 切片缓冲液：将 5 mL HEPES 和 5 mL 青霉素/链霉素加入 500 mL 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。&#160;冷却至 4 °C。 
	注意：多余的切片缓冲液应储存在 4 °C，可用于后续的脑片培养实验。</li>
	<li>配制 50 mL 培养基：在无菌操作台中，将 12.5 mL HBSS、12.5 mL 胎牛血清、250 µL 葡萄糖、250 µL L-谷氨酰胺和 125 µL HEPES 加入 24.4 mL FluoroBright DMEM 中。（终浓度：含 25% HBSS、25% 胎牛血清、0.5% 葡萄糖、1 mM 谷氨酰胺和 2.5 mM HEPES 的 FluoroBright DMEM。）&#160;将培养基在无菌水浴中预热至 37 °C。&#160; 
	注意：培养基可在 4 °C 下保存最多 3 周。
	<ol>
		<li>在无菌操作台中，向 6 孔板的每孔加入 1.5 mL 培养基。&#160;向每孔中放入一个细胞培养插件（材料表）。&#160;将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的无菌培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 4% 低熔点琼脂糖：将 2 g 低熔点琼脂糖溶解于 50 mL 无菌 PBS 中。以 30–60 秒为间隔进行微波加热，直至完全溶解。置于 40 °C 水浴中以保持液态。 
	注意：多余的琼脂糖可在室温（RT）下保存，并在后续脑片培养实验中重新融化使用。</li>
	<li>设置振动切片机：在振动切片机上安装新刀片。检查设置参数：切片厚度为 400–450 µm。预冷切片机载物台。在外槽中放入冰块。使用专用于活体脑片的切片室和载物台。切勿将固定组织与活体脑片使用同一切片室，以免残留的固定剂对脑片造成损伤。</li>
	<li>将显微镜载物台顶部培养箱预热至 37 °C 并通入 5% CO2。</li>
	<li>准备解剖操作：清洁手术器械并喷洒 70% 乙醇。将两个培养皿装满 HBSS 并置于冰上。打开一个 12 孔组织培养板，将盖子倒扣放在冰上。打开一个 6 孔组织培养板，向每孔中放入细胞培养膜插件并加入 1.5 mL 培养基。将该 6 孔板预置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。</li>
</ol>
3. 收集E10.5胚胎并制备切片
注意：从这一步开始的所有操作都应尽快完成。始终将胚胎置于冰上。
<ol>
	<li>将怀孕母鼠（E10.5）置于 CO2 室内实施安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒腹部，使用剪刀剪开腹腔，取出子宫并放入盛有冰上预冷的 HBSS 的培养皿中，迅速洗去血液。将清洗后的子宫转移至第二个盛有冰上预冷 HBSS 的培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，从子宫角和单个羊膜囊中取出胚胎，将胚胎放置在 12 孔板盖子的内侧表面，并保持在冰上。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用滤纸吸除每个胚胎周围的液体。 
	注意：若滤纸接触胚胎，胚胎可能会粘附在滤纸上。</li>
	<li>将胚胎包埋于琼脂糖中。将熔化的琼脂糖倒在每个胚胎上，使其完全覆盖，并保持在冰上。待琼脂糖凝固后，立即翻转每个胚胎，并在另一侧再添加琼脂糖。继续保留在冰上。</li>
	<li>使用荧光解剖显微镜，修剪胚胎周围的琼脂糖，以便将其正确固定在振动切片机载物台上。动眼神经核及早期轴突生长部位具有荧光信号。调整胚胎方向，使动眼神经核、生长中的轴突与眼球呈一条直线，并用刀片沿此直线平行方向切割琼脂糖（位于胚胎背侧，见图1A）。 
	注意：此面将被胶粘至振动切片机载物台（胚胎将以仰卧位放置，头部最靠近切片刀）。动眼神经核与眼球之间的连线应与振动切片机刀片平行。</li>
	<li>将振动切片机腔室中加入冰冷新鲜切片缓冲液。使用超级胶水将胚胎固定在振动切片机载物台上，确保刀片与动眼神经核和眼球平行。待胶水完全干燥后，将载物台浸入缓冲液中，使胚胎朝向远离刀片的方向。</li>
	<li>切取厚度为 400–450 µm 的组织切片。&#160; 使用无菌移液管收集每一片切片，并放入冷切片缓冲液中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，挑选包含动眼神经核和眼球的切片，使用无菌移液管将其转移至 6 孔板中的细胞培养插件上。将培养板放回 37 °C 培养箱中。或者，可由一人负责切片，另一人同时进行切片转移操作。尽量缩短从切片完成到放入培养箱之间的时间。 
	注意：切片应以动眼神经核和轴突发出的荧光信号最接近成像显微镜物镜的方向摆放。在倒置显微镜下，应将切片放置于膜上，使动眼神经核和轴突位于培养板下方，最接近物镜。</li>
	<li>从振动切片机载物台上清除残留琼脂糖，将下一个胚胎用超级胶水固定至载物台，并重复步骤 3.7–3.9，直至所有胚胎均完成切片并接种。</li>
	<li>向各孔培养基中加入选定浓度的抑制剂或重组分子，以构建剂量-反应曲线。&#160; 使用适当的溶剂进行稀释。 
	注意：若使用 DMSO，必须使用组织培养级 DMSO。或者，也可将可释放蛋白的微珠放置于切片的特定位置。</li>
	<li>将培养板置于配备 37 °C 及 5% CO2 环境的显微镜腔室内。&#160; 设置显微镜每 30 分钟（或根据需要更频繁）对每个切片拍摄相差图像和荧光图像。切片可维持培养 48–72 小时。</li>
</ol>

<ol><li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+%28CCDDs%29%3A+insights+into+axon+growth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li>
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<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li>
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<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li>
<li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li>
<li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li>
<li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+in+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li>
<li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li>
<li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96(2018).</li>
<li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li>
<li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CXCR4%2FCXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li>
<li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309(2011).</li>
<li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li>
<li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li>
<li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li>
<li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种离体脑片培养方案相较于传统的轴突导向检测具有显著优势23。每个颅神经运动核的尺寸不再成为限制因素，且无需进行困难的解剖操作。该方法保留了轴突生长所经过的内源性微环境，从而可以在维持其他信号通路的同时，特异性地调控某一信号通路。此外，还可以在轴突路径的不同位置评估其效应。由于轴突导向在行进路径上依赖多种线索及其组合29，该方法因此具备显著优势。与分离培养或组织块培养不同，在本实验体系中生长的轴突不会被切断，因此可评估初始轴突生长过程，而非轴突再生过程。在大多数其他导向检测中，实际评估的是轴突再生而非初始轴突生长。避免轴突切断还可排除重要的潜在混杂因素，因为神经元未受到损伤或应激状态。
最关键的两个步骤是胚胎切片时的定位方向，以及尽量缩短母体安乐死后到将切片放入培养箱之间的时间。胚胎必须始终置于冰上。在定位方面，我们尝试过多种不同的模具，但由于此阶段胚胎之间存在个体差异，我们发现根据解剖显微镜下的荧光信号进行手动定位最为有效。然而，手动定位限制了可用于研究的胚胎时间窗口。在 E10.0 ...

眼动系统为研究轴突导向机制提供了一个精巧的模型。该系统相对简单，由三条支配六条眼外肌（EOM）的脑神经组成，这些肌肉负责眼球运动，以及一条支配上睑提肌（LPS）的神经，后者负责抬起眼睑。动眼神经支配LPS和四条EOM——下斜肌以及内直肌、下直肌和上直肌。其余两条神经，即滑车神经和外展神经，各自仅支配一条肌肉，分别为上斜肌和外直肌。眼球运动可提供易于观察的表型，用以判断神经支配是否正常、缺失或异常。此外，存在一些因神经发育或轴突导向缺陷引起的人类眼动障碍疾病，统称为先天性脑神经失支配障碍（CCDDs）1。
尽管具有这些优势，由于技术上的局限性，动眼神经系统在轴突导向研究中很少被使用2,3,4,5,6,7,8,9,10。体外轴突导向实验存在诸多缺点11。共培养实验中，将神经元组织块与靶组织组织块12或转染细胞13共同培养，其结果依赖于组织块的对称性以及组织块与靶组织之间精确的位置关系。条纹实验14,15中，将两种信号分子以交替条纹形式铺展，观察轴突是否优先生长于其中一种条纹上，但该方法仅能表明一种底物比另一种更受偏好，无法说明任一底物是否具有吸引性或排斥性，或是否具有生理相关性。微流控装置可形成精确的化学梯度，但会对生长中的轴突施加剪切应力16,17,18，从而影响其生长。此外，在所有这些方法中，获取组织块或解离细胞时，向外生长的轴突必须被切断，因此这些实验实际上研究的是轴突再生，而非初始的轴突生长。最后，这些体外方法移除了影响轴突及其在路径不同位置对信号响应的微环境，且传统上仅能孤立地测试单一信号。这些缺点之外，动眼神经系统中各个核团体积较小，使得无论是组织块还是解离培养的分离操作在技术上都极具挑战性。此外，动眼神经元的原代培养通常具有异质性，伴随显著的细胞死亡，且依赖于细胞密度，需要汇集来自多个胚胎的细胞（Ryosuki Fujiki，个人交流）。然而，包括基因敲除小鼠模型在内的体内方法，由于耗时长且成本高，不适合用于筛选研究。
已建立的全胚胎培养方法19可实现对迁移细胞的标记20或特异性分子的阻断21，但全胚胎培养需在旋转瓶中孵育，因而无法对标记结构进行实时成像。允许对胚胎进行操作并随后在母体子宫或腹腔内继续发育（保持胎盘连接）的外科技术也已实现22，但这些方法同样无法实现延时成像。
为了克服体外实验的障碍并实现对信号通路的快速筛选，研究人员开发了一种离体胚胎脑片培养技术23，该技术改编自先前发表的外周神经突起生长实验方案24。利用该方案，可以在包含眼外肌靶组织在内的多种周围结构存在的情况下，对发育中的动眼神经进行时间序列成像。通过向培养基中添加小分子抑制剂、生长因子或导向信号分子，我们能够在轴突路径的多个位点评估导向过程的扰动情况，从而更快速地鉴定潜在的生长和导向因子。

<table><tbody><tr><td>24孔组织培养板</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>6孔组织培养板</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管（燧石玻璃）</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（200 g/L）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（1X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液（1M）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（250 nM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Loctite超级胶水</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Millicell细胞培养小室（30 mm，亲水性PTFE，0.4 μm）</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Moria迷你穿孔勺</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 × 15 mm）</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1X，pH 7.4）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀—钝头</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-12</td><td></td></tr><tr><td>Ti Eclipse Perfect Focus 配TIRF系统</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机（VT 1200S）</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机刀片（双刃，不锈钢）</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr></tbody></table>

利用胚胎期表达gfp小鼠的离体动眼神经脑片培养进行动眼神经突起生长的延时成像

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

精确的眼球运动对视觉至关重要，但控制眼球运动系统的发育过程，尤其是调控轴突导向的分子通路，尚未被完全阐明。这部分是由于传统轴突导向实验技术上的局限性所致。为了鉴定影响动眼神经的其他轴突导向信号分子，研究人员建立了一种离体脑片实验方法，可在轴突向眼部生长的过程中进行实时成像。该方法采用 E10.5 的 IslMN-GFP 胚胎，将其包埋于琼脂糖中，使用振动切片机进行切片，随后将脑片置于显微镜载物台培养箱中培养，并通过延时显微摄影持续观察 24–72 小时。对照组脑片能够重现轴突在体内从神经核团延伸至眼眶的时间进程。可在培养基中加入小分子抑制剂或重组蛋白，以评估不同轴突导向通路的作用。该方法的优势在于能够更好地保留轴突生长所经过的局部微环境，避免切断正在生长的轴突，并可在其生长路径上的多个时间点对轴突行为进行观察。此外，该方法还能识别对特定轴突亚群的影响。例如，抑制 CXCR4 可导致仍位于中脑内的轴突由正常向腹侧生长转为背侧生长，而已从腹侧穿出的轴突则不受影响。

正常结果： 图1 提供了实验的示意图。从小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5）开始，动眼神经核发出的首批轴突即开始出现26在E10.5时，可在间充质中观察到包含早期先驱神经元的束状动眼神经。在E10.5的胚胎之间（即使同一窝胚胎内），该神经向眼眶延伸的距离存在显著差异，这可能是由于发育时间相差数小时所致。在正常发育过程中 子宫内 发育过程中，首批表达GFP的动眼神经轴突在接下来的18–24小时内到达眼眶/眼部（至E11.5阶段），随后开始分支并抵达其最终靶区27在脑片培养中，这一时序得以重现（图2视频 1）。切片可在所有方向上生长并扩展，持续长达72小时，可见轴突从神经核向眼部延伸。我们发现，评估眼动神经轴突生长的最佳时间段为前36–48小时。有时可在神经核内观察到运动神经元的移动（未展示）。在某些切片中，根据其方向，滑车神经核也可能存在。滑车神经轴突在切片内横向延伸，但常出现...

离体脑片实验可实现动眼神经生长的实时成像。通过将 E10.5 IslMN:GFP 胚胎包埋于琼脂糖中，在振动切片机上进行切片，并置于载物台培养箱中培养以制备脑片。通过向培养基中添加抑制剂来评估轴突导向通路的作用。

利用胚胎期表达GFP小鼠的离体动眼神经脑片培养进行动眼神经突起生长的延时成像

准确的眼球运动对视觉至关重要，但眼动系统的发育，特别是控制轴突的分子通路……

本方案使我们能够识别动眼神经中活跃的轴突导向通路，并实时评估这些通路在神经走行路径不同位点所发挥的作用。该技术保留了轴突行进过程中所经过的局部环境及其最终靶区。生长中的轴突未被切断，因此可评估的是初始轴突的外向生长，而非再生过程。该方法可为动眼系统中轴突导向的研究提供见解，亦可经调整后用于其他神经的轴突导向研究。该技术需要反复练习才能掌握，操作迅速极为重要。初次尝试时，应仅使用少量胚胎，而非整窝胚胎。开始操作前，首先通过超声在胚胎第10.5天（经定时交配确定）确认妊娠。收获胚胎后，用70%乙醇喷洒怀孕小鼠的腹部，用剪刀打开腹腔以取出子宫。将子宫置于含冰冻HBSS的培养皿中清洗，然后将其放入第二个含有新鲜冰冻HBSS的培养皿中。在解剖显微镜下，将胚胎从子宫角及其各自的羊膜囊中取出，每取出一个胚胎，立即将其放置于预冷的12孔板盖内侧，置于冰上。用滤纸吸去每个胚胎周围的液体，注意不要触碰胚胎本身，随后将胚胎浸入液态的4%低熔点琼脂糖中。将12孔板盖置于冰上，使琼脂糖凝固。当琼脂糖凝固后，将胚胎翻转，并用额外的琼脂糖覆盖每个样本的另一侧。当第二部分琼脂糖完全凝固后，使用荧光解剖显微镜修整每个胚胎周围的琼脂糖，以便使每个胚胎在振动切片机载物台上保持正确的方向。动眼神经核及早期轴突生长应呈现荧光。 将每个胚胎调整至细胞核、向外生长的轴突与眼睛处于一条直线上，使用刀片沿此方向平行修整琼脂糖。接着，用冰冻切片缓冲液填充振动切片机腔室，并用瞬间胶将第一个胚胎固定在振动切片机载物台上，使刀片方向与动眼神经核及眼睛平行。待瞬间胶完全干燥后，将振动切片机载物台浸入液面下，使胚胎朝向远离刀片的方向定位，使用新的振动切片刀片切出厚度为400至450微米的组织切片。使用无菌移液管将每一片切片获取后立即转移至冷切片缓冲液中，并利用荧光解剖显微镜挑选包含动眼神经核和眼睛的切片。使用无菌移液管将选中的切片转移至六孔板中的细胞培养插件上，每个孔内含 1.5 毫升培养基，然后将六孔板置于 37°C 培养箱中。从振动切片机载物台上清除残留的琼脂糖，并用瞬干胶将下一个胚胎固定在载物台上，继续收集切片，直至所有胚胎均完成切片与接种。然后向每孔培养基中加入用适当溶剂稀释的、相应浓度的抑制剂或目的重组分子。建立剂量-反应曲线。在72小时内每30分钟对切片进行相差显微镜和荧光显微镜成像。在正常的胚胎发育过程中，首批表达绿色荧光蛋白的动眼神经轴突在胚胎第11.5天到达眼眶，随后分支并抵达其最终靶区，如本代表性脑片培养实验所观察到的。脑片在振动切片机载物台上的方向至关重要，若方向不正确，将无法获得可解读的切片结果。例如，若胚胎发生侧向倾斜，则切片中仅能观察到一个动眼神经核。如果包埋的胚胎向背部倾斜过度，切片中将不包含眼睛，而可能包含上肢、后脑或脊髓。在将切片放置到培养膜上时，需注意避免组织发生折叠。溶解抑制剂和生

ex-vivo-oculomotor-slice-culture-from-embryonic-gfp-expressing-mice

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

来自胚胎GFP-表达小鼠的Ex Vivo Oculo运动切片培养,用于对Oculo运动神经外生长进行时移成像

我们介绍一种制备中期妊娠小鼠胚胎的器官型切片的方法，用于外周神经突起的培养和延时成像。...

表达GFP的小鼠胚胎器官型切片培养用于外周神经突起实时成像

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

在此，我们开发了所需的工具 离体...

ex vivo 活体成像小鼠神经上皮中的单细胞分裂

该视频展示了从转基因小鼠胚胎中分离动眼神经、滑车神经和脊髓运动神经元的过程。该胚胎的运动神经元表达绿色荧光蛋白（GFP）标记，便于观察和识别。在荧光显微镜下通过手术分离运动神经元，并将其维持在培养基中进行培养。...

从小鼠胚胎中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元

本视频展示了转基因小鼠胚胎动眼神经核组织切片的离体培养与成像。首先分离胚胎并将其包埋于琼脂糖中，利用振动切片机获取包含动眼神经核及眼球的组织切片。将切片置于培养条件下，并使用荧光显微镜进行观察成像。...

转基因小鼠胚胎动眼神经核脑片的离体培养与成像

来源： Wiegreffe, C., 等  利用胚胎小鼠脑组织切片培养进行迁移神经元的延时共聚焦成像 子宫内 电穿孔 J. Vis. Exp. (2017)...

转导小鼠胚胎脑切片中皮层神经元径向迁移的延时成像

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。...

用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero...

In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。...

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

本方案展示了一种简单且可靠的用于研究的方法 原位 轴突生长与生长锥动态。该方法描述了如何制备 离体...

在体 可视化急性离体胚胎脑切片培养中轴突生长与生长锥动态

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

学习离体切片培养技术，用于实时成像追踪小鼠动眼神经轴突生长。该方法保留局部微环境，可评估轴突导向机制，为发育神经生物学研究提供重要工具。

利用胚胎期表达GFP小鼠的离体动眼神经脑片培养进行动眼神经突起生长的延时成像

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