利用胚胎期表达GFP小鼠的离体动眼神经脑片培养进行动眼神经突起生长的延时成像

本方案可帮助我们识别在动眼神经中起作用的轴突导向通路，并实时评估这些通路在神经走行路径不同位点上的功能。该技术保留了轴突迁移过程中所经过的局部环境及其最终靶区。由于生长中的轴突未被切断，因此可评估的是轴突的初始生长，而非再生过程。

该方法可为研究眼动系统中的轴突导向提供见解，也可经调整后用于其他神经的轴突导向研究。该技术需要经过练习才能掌握，操作迅速极为重要。初次尝试时，应仅使用少量胚胎，而非整窝胚胎。

开始操作前，首先通过超声在配种后第10.5天确认妊娠。收集胚胎，用70%乙醇喷洒怀孕小鼠的腹部，用剪刀打开腹腔以取出子宫。将子宫置于含冰浴HBSS的培养皿中清洗，然后将其放入另一含有新鲜冰浴HBSS的培养皿中。

在解剖显微镜下，将胚胎从子宫角及其各自的羊膜囊中取出，每取出一个胚胎，立即将其放置于一个12孔板盖子的内侧表面，并置于冰上。使用滤纸吸除每个胚胎周围的液体，注意不要触碰胚胎本身，然后将胚胎浸入液体状的4%低熔点琼脂糖中。将培养板盖子放在冰上，使琼脂糖凝固。

当琼脂糖凝固后，将胚胎翻转，并用额外的琼脂糖覆盖每个样本的另一侧。当第二部分琼脂糖完全凝固后，使用荧光解剖显微镜修整每个胚胎周围的琼脂糖，以便每个胚胎能够在振动切片机载物台上正确地定位。动眼神经核及早期轴突生长应呈现荧光。

将每个胚胎调整至细胞核、生长的轴突和眼睛呈一条直线，并使用刀片沿此直线平行修切琼脂糖。接着，用冰冻的切片缓冲液填充振动切片机腔室，并用瞬干胶将第一个胚胎粘附到振动切片机载物台上，使刀片与动眼神经核及眼睛保持平行。待瞬干胶完全干燥后，将振动切片机载物台浸入液体中，使胚胎朝向远离刀片的方向定位，然后使用新的振动切片刀片切出400至450微米厚的组织切片。

使用无菌移液管在获取每个切片后立即将其转移至冷切片缓冲液中，并利用荧光解剖显微镜挑选包含动眼神经核和眼睛的切片。使用无菌移液管将所选切片转移至六孔板中的细胞培养插入式培养皿上，每孔加入 1.5 毫升培养基，然后将六孔板置于 37°C 培养箱中。清除振动切片机载物台上的残留琼脂糖，并用超级胶水将下一个胚胎固定在载物台上，继续收集切片，直至所有胚胎均完成切片和接种。

然后将用适当溶剂稀释的目标抑制剂或重组分子以合适的浓度加入各孔的培养基中，建立剂量-反应曲线。在72小时内，每隔30分钟使用相差显微镜和荧光显微镜对脑片进行成像。

在正常的胚胎发育过程中，如本代表性切片培养所示，首批表达绿色荧光蛋白的动眼神经轴突在胚胎第11.5天到达眼眶，随后分支并抵达其最终靶区。切片在振动切片机载物台上的方向至关重要，因为若切片方向不正确，则无法进行有效观察。例如，若胚胎发生侧向倾斜，则切片中仅能观察到一侧的动眼神经核。

如果包埋的胚胎向背部倾斜过度，切片中将不包含眼睛，而可能包含上肢以及后脑或脊髓。在将切片放置到培养膜上时，需注意避免组织发生折叠。使用有机溶剂溶解抑制剂和生长因子时应格外小心。

例如，在本实验中，切片在向培养基中添加乙醇后死亡。请记住将所有物品保持在冰上，并尽量缩短从胚胎取出到将切片放入培养箱之间的时间。利用该技术，我们已开始鉴定在眼动系统中发挥作用的其他轴突导向机制。

使用刀片时请注意安全，某些抑制剂可能具有危害性，应根据其安全特性小心操作。