Name: 小鼠神经干细胞和脑中5-羟基甲基细胞氨酸的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解利用免疫荧光染色和DNA点印迹法检测小鼠神经干细胞及脑组织中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的实验方案。该方法可揭示神经元分化过程中表观遗传修饰的动态变化，为神经发育与疾病研究提供可靠工具。

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XL 部分受国家关键研发计划资助&amp;中国国家重点研发计划（2017YFE0196600）和国家自然科学基金（项目编号：31771395，31571518）。Q.S. 受中国国家重点研发计划（2017YFC1001703）和浙江省重点研发计划（2017C03009）资助。W.X. 受浙江省自然科学基金（LY18H020002）和浙江省科学技术厅（2017C37057）资助。

所有动物实验均已获得浙江大学动物伦理委员会的批准。
1. 成年神经干细胞与神经元的培养
<ol>
	<li>按照先前所述方法，从成年（8-10周龄）C57/BL6雄性小鼠前脑中分离成年神经干细胞31,32。</li>
	<li>在含20 ng/mL FGF-2、20 ng/mL EGF、2% B27添加剂、1%抗生素-抗真菌剂和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养成年神经干细胞。按照先前所述方法，使用1 µM视黄酸和5 µM佛司可林诱导成年神经干细胞分化48小时31,32。</li>
	<li>从胚胎第17天（E17）小鼠海马组织中分离神经元，并在含0.25% L-谷氨酰胺、0.125% GlutaMax和2% B27添加剂的Neurobasal培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养，方法同前33。</li>
</ol>
2. 小鼠经心脏灌注
<ol>
	<li>实验前一天配制10%水合氯醛、4%多聚甲醛（PFA）和磷酸盐缓冲液（PBS），并于4 °C保存。</li>
	<li>使用10%水合氯醛（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉成年雄性或雌性C57 BL/6J小鼠，并通过检查动物的躯体反应确认其已深度麻醉。将小鼠仰卧固定于塑料板上，四肢用胶带固定。</li>
	<li>使用手术剪剪开皮肤，再剪开肌肉组织。用手术剪打开胸腔，暴露心脏，用精细手术剪剪除右心房一小部分。</li>
	<li>使用10 mL一次性无菌注射器，从左心室灌注冰冷的PBS（每只成年小鼠约30 mL）。</li>
	<li>继续灌注4% PFA（每只成年小鼠约在10分钟内灌注30 mL），直至小鼠身体变僵硬。</li>
	<li>使用骨钳打开小鼠颅骨，取出脑组织，放入含有5 mL 4% PFA的15 mL离心管中，于4 °C进行后固定。 
	注意：手术结束后清洁手术区域。</li>
	<li>至少24小时后，将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，于4 °C完成彻底脱水。</li>
</ol>
3. 脑切片
<ol>
	<li>将脑组织样本置于小容器中的最佳切割温度包埋剂（OCT）中，并在 -20 °C 下冷却至少 1 小时。</li>
	<li>使用冷冻切片机将脑组织样本切成 20–40 μm 厚的切片。</li>
	<li>将切片收集至磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 4 °C 下保存。</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>挑取含有目标脑区的切片，放入盛有 PBS 的 24 孔板中。对于盖玻片上的培养细胞，直接进入步骤 4.2。</li>
	<li>在室温下于摇床上用 PBS 洗涤 10 分钟，重复此步骤两次。</li>
	<li>吸除 PBS，加入预热的 1 M HCl，在 37 °C 下处理 30 分钟。 
	注意：在通风橱中，将 1 mL 盐酸（36–38%）加入 10 mL 水中配制 1 M HCl。将 1 M HCl 在 37 °C 培养箱中预热。</li>
	<li>用 PBS 洗涤样品 5 分钟，重复此步骤两次。</li>
	<li>在摇床上室温孵育 1 小时，用含 3% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PBS 封闭样品。</li>
	<li>在摇床上于 4 °C 下与特异性一抗抗体孵育过夜。 
	注意：使用以下一抗抗体：兔多克隆抗体抗 5-羟甲基胞嘧啶（1:5,000）、小鼠单克隆抗体抗 NeuN（1:500）。</li>
	<li>取出样品，在室温下继续孵育 1 小时。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 10 分钟，重复此步骤两次。</li>
	<li>在摇床上室温下与对应一抗的二抗抗体孵育 1 小时，用铝箔覆盖孔板。 
	注意：使用以下二抗抗体：Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG（1:500）、Alexa Fluor 568 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:500）。用 4′-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤 10 分钟，重复此步骤两次。</li>
	<li>将脑切片贴附于载玻片上，加入适量抗荧光淬灭封片剂（约 100–150 μL），盖上优质盖玻片，用指甲油封片。</li>
	<li>使用普通荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜拍摄图像。</li>
</ol>
5. 基因组DNA提取
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死一只成年 C57 BL/6J 小鼠（雄性或雌性），并取出脑组织。</li>
	<li>在冰上冷却的培养皿中分离海马、皮层和小脑组织。用组织研磨器在 1 mL DNA 裂解缓冲液中研磨组织，转移至洁净的微量离心管中。每 600 μL 裂解缓冲液加入 250 μg 蛋白酶 K。对于细胞沉淀，直接加入裂解缓冲液和蛋白酶 K，并充分混匀。 
	注意：DNA 裂解缓冲液的配制：5 mM EDTA、0.2% SDS、200 mM NaCl 溶于 100 mM Tris-HCl 中，pH 8.5。实验前清洗并高压灭菌组织研磨器。</li>
	<li>第二天，每个样本加入约 50 μg RNase A，在 37 °C 下孵育至少 12 小时。</li>
	<li>加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分混匀。</li>
	<li>在 20,817 x g 条件下离心 15 分钟，将上清液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>向上清液中加入 600 μL 氯仿以沉淀 DNA，并充分混匀。</li>
	<li>在 20,817 x g 条件下离心 15 分钟，将上清液转移至另一新的离心管中。</li>
	<li>向上清液中加入 500 μL 异丙醇，并充分混匀。</li>
	<li>在 20,817 x g 条件下离心 15 分钟，彻底弃去上清液。</li>
	<li>用 1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀，在 20,817 x g 条件下离心 1 分钟，彻底弃去上清液。重复一次。</li>
	<li>将 DNA 沉淀完全干燥。</li>
	<li>用 Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）将 DNA 沉淀溶解至适当浓度。</li>
</ol>
6. DNA 点印迹
<ol>
	<li>配制溶液：2 M NaOH、Tris-HCl 缓冲液（pH 8.5）、6× 柠檬酸钠盐水（SSC）。</li>
	<li>按照表1配制样品混合液。</li>
	<li>将DNA样品在100 °C下变性10分钟，然后置于冰上冷却。</li>
	<li>裁剪适当大小的尼龙膜（例如 Hybond-N+），并用6× SSC冲洗。</li>
	<li>将膜置于点印迹装置上，并连接真空泵。每点点样6 μL混合液。</li>
	<li>在80 °C下杂交30分钟，然后用含脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）在室温封闭膜1小时。</li>
	<li>加入一抗，4 °C孵育过夜。 
	注意：使用以下一抗：兔多克隆抗5-羟甲基胞嘧啶抗体（1:5,000）。</li>
	<li>第二天，将样品膜在室温孵育1小时，用TBS洗涤10分钟，重复洗涤两次。</li>
	<li>加入抗兔二抗（1:5,000），室温孵育30分钟。</li>
	<li>用TBS洗涤10分钟，重复洗涤两次。</li>
	<li>显影化学发光信号，并对信号强度进行定量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li>
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<li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905(2013).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
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<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li>
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<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li>
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<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li>
<li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).</li>
<li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

不存在竞争性财务利益。

表观遗传修饰在大脑的发育、成熟和功能中发挥着至关重要的作用。作为DNA修饰的一种稳定标记，动态的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）可响应行为适应和神经元活动，并与基因表达呈正相关；因此，它参与了大脑的正常功能以及神经系统的疾病过程4。为了探究其在细胞和组织中的功能，有必要检测5-hmC的存在，并比较处理前后的水平变化。本文中，我们展示了两种在细胞和组织中检测5-hmC的便捷方法，这些方法可在实验室常见的设备条件下完成。
使用免疫荧光染色和DNA点杂交检测5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的关键试剂是5-hmC抗体。本方法所用的5-hmC抗体已被证实具有高灵敏度和高度特异性。进行5-hmC染色时，需要使用盐酸（HCl）进行DNA变性。组织和细胞经HCl处理的条件是否恰当，对实现完全的DNA变性至关重要，并直接影响实验结果。DNA点杂交是一种灵敏的定量5-hmC含量的方法，且比质谱法更为便捷。要成功完成点杂交，必须将DNA样本精确地点样到膜上。此外，亚甲蓝染色有助于判断DNA样本是否等量上样。需要注意的是，本文所述方法检测的是多种细胞和组织中5-...

表观遗传修饰，包括DNA修饰、组蛋白修饰和RNA修饰，在多种生物学过程和疾病中发挥着重要的功能1,2,3,4,5,6,7。长期以来，DNA甲基化（即5-甲基胞嘧啶（5-mC））被认为是一种高度稳定的表观遗传标记，在基因组中不能再被进一步修饰。最近研究发现，5-mC可由TET（Ten-eleven translocations）家族蛋白（包括TET1、TET2和TET3）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）8,9。进一步研究表明，5-hmC可作为一种稳定的表观遗传标记，通过调控基因表达发挥生物学功能4,10,11,12。
目前的证据表明&#160;5-hmC 在哺乳动物的神经元组织/细胞中相较于其他组织类型显著富集，并在神经元发育过程中表现出动态变化特征13,14. 在&#160;在神经系统中，5-hmC介导的表观遗传修饰在调控神经干细胞、神经元活性、学习与记忆过程中发挥重要作用，并参与多种神经系统疾病，包括Rett综合征、自闭症、阿尔茨海默病、亨廷顿病等。2,13,15,16,17,18,19,20.
目前有多种方法可用于检测细胞和组织中的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）14,21,22,23,24。本文介绍了两种用于检测5-hmC的存在并定量其整体水平的方法：免疫荧光染色和DNA点杂交（dot-blot）。这两种方法操作简便且灵敏度高，已在先前的研究中成功应用25,26,27,28,29,30。这两种方法的关键步骤均为DNA变性。对于5-hmC的免疫荧光染色，样品需用1 M HCl进行预处理；而对于5-hmC点杂交，则使用&#160;NaOH溶液进行DNA变性。结合下一代测序技术，这些方法是研究5-hmC功能的有力工具。

<table><tbody><tr><td>4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 软件</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>抗5-羟甲基胞嘧啶抗体</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>抗NeuN抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培养基</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子-基础型</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>尼龙膜（Hybond&amp;trade;-N+）</td><td>Amersham Biosciences</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠神经干细胞及脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的检测

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

在哺乳动物基因组中已发现多种&#160;DNA修饰。其中，5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶介导的表观遗传机制已被广泛研究。5-羟甲基胞嘧啶在胚胎期及出生后脑发育过程中表现出动态变化特征，参与基因表达的调控，并与多种神经系统疾病相关。本文详细描述了包括免疫荧光染色和&#160;DNA点杂交在内的多种方法，用于检测小鼠培养细胞及脑组织中的5-羟甲基胞嘧啶。

为了揭示5-hmC在成年小鼠海马体中的分布情况，我们使用了针对神经元细胞（NeuN）和5-hmC的抗体进行免疫荧光染色。在海马体中，5-hmC与神经元细胞标志物NeuN共定位良好（图1A-H），提示5-hmC在神经元中富集。
为了确定5-hmC在神经元发育过程中的动态变化，首先对从增殖期和分化期成体神经干细胞（NSCs）中分离的DNA样本进行了点印迹分析。点印迹结果显示，NSC在分化过程中5-hmC的整体水平显著升高（图2A-B）。此外，点印迹结果还显示，神经元中的5-hmC水平显著高于NSCs（图2C-D），提示在神经元发育过程中存在动态的5-hmC修饰。
<img alt="脑组织荧光显微镜图像；DAPI、NeuN、5hmC染色，细胞共定位合并图...

本文介绍了一种利用免疫荧光染色和DNA点杂交方法检测细胞和脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的实验方案。

已鉴定出多种存在于哺乳动物基因组中的DNA修饰。其中，由5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶介导的表观遗传修饰……

本文介绍了一种利用免疫荧光、新方法以及DNA点杂交技术在细胞和脑组织中检测5-羟甲基胞嘧啶的实验方案。5-羟甲基胞嘧啶（即5hmC）是一种重要的表观遗传修饰，在调控基因表达中发挥关键作用，并参与多种神经系统疾病的发生发展。实际上，我们的方法可用于检测多种细胞和组织中的5hmC，操作简便，且仅需使用实验室常见的设备即可完成。首先将小鼠仰面放置在塑料板上，并用胶带固定每个肢体。使用手术剪剪开皮肤和肌肉，打开胸腔。暴露心脏后，用精细手术剪剪除右心房的一小部分。使用10毫升一次性无菌注射器，从左心室向小鼠灌注冷的PBS。然后，用4%PFA灌注小鼠直至其身体变僵硬。接着，用骨钳打开颅骨并取出脑组织。将脑组织放入装有5毫升4%PFA的15毫升离心管中，并在4°C下保存。24小时后，将脑组织转移至30%蔗糖溶液中，在4摄氏度下放置以完成脱水。切片前，将脑组织包埋于最佳切割温度化合物中，并冷却至零下20摄氏度至少一小时。使用冷冻切片机将脑组织样品切成20至40微米厚度的切片。将切片收集到磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在4°C下保存。挑取感兴趣的脑切片，放入含有PBS的24孔板中。在摇床上用PBS清洗切片10分钟。吸去 PBS，加入预热的 1 摩尔盐酸，在 37 摄氏度下处理 30 分钟。盐酸具有腐蚀性，请在化学品操作区配制。随后用 PBS 洗涤样品三次，每次 5 分钟，并用含 3% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PBS 进行封闭。将样品置于摇床上，室温孵育一小时。加入特异性一抗，于4°C摇床中孵育过夜。次日取出样品，室温放置一小时。用 PBS 清洗样品三次，加入二抗。用铝箔覆盖培养板，在室温下振荡孵育一小时。孵育结束后，用 PBS 再次清洗样品三次，然后将其封片于载玻片上。加入 100 至 150 微升抗荧光淬灭封片液，盖上优质盖玻片，并用指甲油封固。使用普通显微镜或共聚焦显微镜对脑切片进行成像。为提取基因组 DNA，首先在冰上冷却的培养皿中分离海马、皮层和小脑组织。加入1毫升DNA裂解缓冲液并研磨组织。将样品转移至干净的微量离心管中，每600微升裂解缓冲液加入250微克蛋白酶K。然后，每个样品加入约50微克RNase A，并在37摄氏度孵育至少12小时。孵育后，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，充分混匀。按照文稿中的指示离心混合物，并将上清液转移至新管中。向上清液中加入600 µL氯仿，充分混匀，然后按照文稿中的指示进行离心。将上清液转移至新离心管中，加入500 µL异丙醇。充分混匀后再次离心，以沉淀DNA。离心后弃去上清液，并根据手稿说明用70%乙醇洗涤DNA沉淀。将DNA沉淀完全空气干燥，然后溶于Tris-HCl缓冲液中。实验开始前，根据论文中的说明配制所需的溶液和样品混合物。将DNA样品在100摄氏度加热10分钟以使其变性，随后置于冰上。裁剪适当大小的尼龙膜，并用6X SSC冲洗。将膜置于点印迹装置上，并连接真空泵。将6微升的样品点加到膜上，在80摄氏度下杂交30分钟。然后，用脱脂牛奶和Tris缓冲盐水（TBS）封闭样品膜，孵育一小时。加入多克隆兔抗5-羟甲基胞嘧啶抗体，4摄氏度下孵育过夜。次日，将样品膜在室温下放置一小时，随后用TBS洗涤三次。将膜与抗兔二抗在室温下孵育30分钟，随后用TBS洗涤三次。显影化学发光信号并对其强度进行定量。该方案可用于在成年小鼠海马中检测5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。使用针对神经元细胞的抗体进行免疫荧光染色，5hmC 检测结果显示神经元中存在 5hmC 的富集。通过点印迹法检测增殖期和分化期成体神经干细胞中分离的 DNA 样品，可确定神经元发育过程中 5hmC 的动态变化。在分化过程中，5hmC 的总体水平显著升高，且神经元中的 5hmC 水平高于神经干细胞。该方法的关键步骤是确保DNA样本完全变性。

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科研

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神经科学

小鼠神经干细胞和脑中5-羟基甲基细胞氨酸的检测

EpiMark 5-hmC 和 5-mC 分析试剂盒可用于分析和定量特定基因座中的 5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。该试剂盒通过利用β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）的酶促反应，将葡萄糖添加到 5-hmC 的羟基上，从而区分 5-mC 与 5-hmC。当 5-hmC 出现在 CCGG 序列背景下时，此修饰会将原本可被切割的 MspI...

高灵敏度检测Balb/C小鼠脑组织中的5-羟甲基胞嘧啶

本文描述了一种两步标记法，首先利用β-葡萄糖基转移酶（β-GT）将叠氮葡萄糖转移至5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），随后通过点击化学反应连接生物素接头，从而实现简便且不受密度影响的富集。该高效且特异的标记方法可实现5-hmC的低背景富集，并通过高通量测序进行表观基因组高通量作图。...

基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶的选择性捕获

本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型，针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。 可通过分离 LacI...

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

在怀孕小鼠中给予两种胸苷类似物EdU和BrdU，可分析胚胎小鼠脑内神经细胞和前体细胞的细胞周期进程。该方法有助于确定基因毒性应激（包括电离辐射）对脑发育的影响。...

评估基因毒性应激后小鼠发育大脑中神经干细胞与前体细胞的细胞周期进程

本文介绍一种基于辣根过氧化物酶标记的二抗和酪胺信号放大技术的高灵敏度免疫化学方法，用于绘制5mC氧化衍生物的空间分布图谱。...

使用高灵敏度免疫组织化学法检测胞嘧啶的修饰形式

新发现的5-甲基胞嘧啶（oxi-mCs）氧化形式，包括5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），可能代表具有独特功能作用的独立DNA修饰。本文描述了一种用于可视化oxi-mCs空间分布、信号强度分析及共定位的半定量工作流程。...

DNA修饰的免疫染色：共聚焦图像的计算分析

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。...

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

本报告的目的是描述在发育中和有丝分裂后的小鼠视网膜中对表观遗传标志物5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）进行可靠免疫组织化学检测的实验方案。...

小鼠发育期及有丝分裂后视网膜中5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶的免疫组织化学检测

甲基化RNA免疫沉淀实验是一种基于抗体的方法，用于富集甲基化的RNA片段。结合深度测序技术，可鉴定携带m5C修饰的转录本。...

用于研究拟南芥中 m5C 修饰的甲基化 RNA 免疫沉淀实验

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

本文介绍了一种在完整斑马鱼胚胎中对正常和异常胞嘧啶甲基化进行快速、高效时空监测的实验方案。...

完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

了解利用免疫荧光染色和DNA点印迹法检测小鼠神经干细胞及脑组织中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的实验方案。该方法可揭示神经元分化过程中表观遗传修饰的动态变化，为神经发育与疾病研究提供可靠工具。

小鼠神经干细胞及脑组织中5-羟甲基胞嘧啶的检测

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