Name: 用于筛选小分子抑制剂的NADH耦合ATPase分析的半高通量自适应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解NADH偶联ATP酶检测方法用于半高通量筛选小分子肌球蛋白抑制剂。该384孔板技术适用于多种ADP生成酶，为开发非肌肉肌球蛋白II抑制剂治疗甲基苯丙胺使用障碍提供可靠方案。

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本工作由美国国家神经疾病与卒中研究所和国家药物滥用研究所资助，项目编号NS096833（CAM）。

1. 储备溶液与试剂的配制
<ol>
	<li>通过将结晶 DTT 溶解于蒸馏水中，配制终浓度为 1000 mM 的二硫苏糖醇（DTT）储备液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>通过将结晶 ATP 溶解于蒸馏水中，配制终浓度为 100 mM 的 ATP 储备液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制含 70 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）、10 mM MgCl2、0.9 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸（EGTA）和 3 mM NaN3 的 10× NADH 缓冲液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。4 °C 保存。</li>
	<li>配制含 10 mM MOPS 和 0.1 mM EGTA 的 1× 肌球蛋白缓冲液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。4 °C 保存。使用前加入牛血清白蛋白（BSA）和 DTT，使其终浓度分别为 0.1%（w/v%）和 1 mM。</li>
	<li>配制含 4 mM MOPS、0.1 mM EGTA、2 mM MgCl2 和 3 mM NaN3 的 1× 肌动蛋白缓冲液。用 1 M NaOH 溶液调节 pH 至 7.0。4 °C 保存。使用前加入牛血清白蛋白（BSA）和 DTT，使其终浓度分别为 0.1%（w/v%）和 1 mM。</li>
	<li>将结晶 NADH 溶解于 10× NADH 缓冲液中，配制终浓度为 5.5 mM 的 NADH 储备液。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>将结晶 PEP 溶解于 10× NADH 缓冲液中，配制终浓度为 50 mM 的 PEP 储备液。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>将冻干的 LDH 粉末溶解于甘油与 10× NADH 缓冲液（50%:50%）的混合液中，配制终浓度为 2000 U/mL 的 LDH 储备液。离心去除未溶解的蛋白质（7,197 × g，20 °C，10 分钟）。小心将上清液转移至洁净的离心管中。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>将冻干的 PK 粉末溶解于甘油与 10× NADH 缓冲液（50%:50%）的混合液中，配制终浓度为 10000 U/mL 的 PK 储备液。离心去除未溶解的蛋白质（7,197 × g，20 °C，10 分钟）。小心将上清液转移至洁净的离心管中。分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>向冻干的心肌和骨骼肌肌球蛋白 II 样品中加入 100 µL 蒸馏水，重悬获得浓度为 10 mg/mL 的储备液，对应的肌球蛋白浓度（单体）分别约为 ~37.9 µM 和 ~40.8 µM。更多细节请参见制造商说明书。</li>
	<li>按照 Pardee 和 Spudich25 的方法，从兔肌丙酮粉制备 F-肌动蛋白。</li>
</ol>
2. 测定ATP酶活性及小分子抑制剂的抑制作用
<ol>
	<li>制备化合物板。
	<ol>
		<li>将目标化合物溶解于高质量的二甲基亚砜（DMSO）中。</li>
		<li>从DMSO中10 mM的化合物浓度开始，进行十五步连续1:2稀释。</li>
		<li>将样品以三个复孔为一组转移至384孔聚丙烯板中（12.5 µL 使用多通道移液器进行加样（每孔加样量相同）。每个化合物使用化合物板上的两行（而非三列），以尽量减少边缘效应可能影响的孔数。每个化合物的第二行最后三个孔用作阴性对照（仅含DMSO）。不要使用板上的第一行和最后一行进行化合物稀释。</li>
		<li>将纯DMSO转移至第一行各孔中（用于NADH校准）。</li>
		<li>将最后一行用作阳性对照。 
		注意： 用于在DMSO中浓度为4 mM的-aminoblebbistatin被用于此处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 4500 µL 的 20 µM 每次实验使用384孔黑色壁聚苯乙烯微孔板，将肌动蛋白储备液用肌动蛋白缓冲液稀释，配制稀释的肌动蛋白溶液。使用5 mL移液器反复吹打30次，充分混匀溶液，以剪切肌动蛋白纤维，降低溶液黏度和不均一性。离心溶液以去除可能存在的沉淀蛋白（7,197 × g, 20 °C，10 分钟）。小心地将上清液转移至干净的离心管中。</li>
	<li>配制含有乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸激酶（PK）的预混液（“酶混合液”）。每块检测板中，混合以下组分： 171.4 µL LDH 溶液 171.4 µL PK溶液的 3189.3 µL 或 3252.9 µL 分别在15 mL圆锥形离心管中加入肌球蛋白缓冲液，用于心肌或骨骼肌肌球蛋白II的实验。此时切勿加入任何肌球蛋白，以避免聚集和沉淀。</li>
	<li>配制含有所有底物的预混液（“底物混合液”）。每块板分别混合 162.1 µL ATP 162.1 µL 磷酸烯醇式丙酮酸和 324.1 µL 在15 mL圆锥形离心管中加入NADH溶液。此时切勿加入肌动蛋白，以避免发生聚集和沉淀。</li>
	<li>从起始浓度开始对 NADH 进行七步连续 1:2 稀释以用于校准 250 µM.
	<ol>
		<li>混合 12.3 µL NADH 储备液 257.7 µL 1.5 mL 微型离心管中的肌球蛋白缓冲液</li>
		<li>等分试样 135 µL 将肌球蛋白缓冲液分装至七个 1.5 mL 微型离心管中。</li>
		<li>转移 135 µL 从第一管中吸取溶液加入第二管，用移液器吹打混匀。重复此操作直至第7管th 管</li>
		<li>将最后一支试管作为空白对照（仅含缓冲液），不加NADH。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用八通道移液器，转移 20 µL 将NADH校准溶液以三复孔形式加入检测板的第一行。</li>
	<li>添加 68 µL 心脏或 4.2 µL 向酶混合液中加入骨骼肌肌球蛋白II。短暂涡旋。</li>
	<li>除第一行外，分配 8.4 µL 使用自动分配器将制备好的肌球蛋白-酶混合液加入检测板的每个孔中。</li>
	<li>使用配备100 nL针头工具头的自动化液体处理系统，将化合物板中的溶液各100 nL转移至含有酶混合液的检测板中。</li>
	<li>使用微量板振荡器在室温下以1200 rpm的速度振荡反应板1分钟。</li>
	<li>添加 4,052 µL 将离心后的肌动蛋白溶液加入底物混合物中，短暂涡旋。</li>
	<li>分配 11.6 µL 使用自动分配器将肌动蛋白-底物混合物加入检测板的每孔中（首行除外），以启动酶促反应。</li>
	<li>使用微量板振荡器在室温下以1200 rpm的速度振荡反应板1分钟。</li>
	<li>将检测板在101 × g条件下离心 g 30 秒。</li>
	<li>确保酶标仪内部温度已稳定在 25 ˚C。将酶标板放入仪器中，再振荡 30 秒。此振荡步骤对于使各孔中液体表面形状保持一致至关重要，同时可使酶标板充分达到检测温度。</li>
	<li>以45秒为间隔，扫描记录NADH荧光信号30分钟。使用380 nm（带宽10 nm）的激发滤光片、470 nm（带宽24 nm）的发射滤光片，并配合425 nm截止的二向色镜。测量时选择高浓度模式。在开始检测前，优化闪光次数、检测器增益、酶标板规格和测量高度。 
	注意：最终测定条件为 300 nM 心肌/20 nM 骨骼肌肌球蛋白 II， 10 µM 肌动蛋白，40 U/mL 乳酸脱氢酶，200 U/mL 丙酮酸激酶 220 µM NADH、1 mM PEP、1 mM ATP，溶于含10 mM MOPS（pH = 7.0）、2 mM MgCl的缓冲液中2，0.15 mM EGTA，0.1 mg/mL BSA，0.5% (v/v) DMSO 和 1 mM DTT。总体积为 20 µL/well最高终浓度化合物为 50 µM. 20 µM para含0.5% DMSO的-aminoblebbistatin作为阳性对照，仅含0.5% DMSO作为阴性对照。所有测量均设三个重复。</li>
</ol>
3. 分析数据
<ol>
	<li>绘制每个孔的荧光强度随时间变化的曲线。</li>
	<li>进行简单的线性回归，以确定每个孔荧光响应的斜率和截距。斜率与ATP（NADH）消耗速率成正比，而截距与测量开始时（t = 0 s）的NADH浓度成正比。</li>
	<li>通过将微孔板第一行各孔所得截距对NADH浓度作图，构建NADH的校准曲线。确保截距与NADH浓度呈线性关系。 
	注意：与在 t ≈ 0 s 时原始荧光强度读数的平均值相比，截距能更可靠地估计 t = 0 s 时的真实荧光强度。</li>
	<li>进行简单的线性回归，以获得NADH校准曲线的斜率和截距。 
	注意：截距表示无NADH存在时的荧光背景信号，而斜率对应于该特定实验中1 M NADH溶液外推/理论荧光强度。</li>
	<li>将其余各孔荧光响应的斜率除以NADH校准曲线的斜率，从而将荧光变化转换为ATP消耗速率。</li>
	<li>将ATP消耗速率对抑制剂浓度作图。</li>
	<li>为确定抑制常数，使用适当的统计软件将剂量-反应数据拟合至以下二次方程，该方程对应于简单的1:1结合平衡模型： 
	<img alt="配体-蛋白质相互作用的结合亲和力方程；数学表达式；科学分析" src="/files/ftp_upload/60017/60017eq01.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> 
	其中 Y 表示ATP消耗速率，Ymin 表示无抑制剂时的ATP消耗速率，Ymax 表示100%抑制时的理论ATP消耗速率，KI 表示抑制常数，[E]t 和 [I]t 分别表示酶（肌球蛋白）和抑制剂的总浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li>
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<li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实验方案中的关键步骤
通过仅使用阴性对照（无抑制剂的ATP酶反应）运行多块微孔板来优化板布局。仔细检查反应速率结果中的模式，例如，这些模式可能源于边缘效应和/或亲水表面涂层的不均匀性。 &#34;非结合性&#34; 平皿。如果观察到某种模式，应更换平皿类型和/或调整平皿布局以尽量减少干扰因素。例如，一条典型的剂量-反应曲线（16个浓度，每个浓度3个复孔，共48个数据点）可在384孔板上按三列或两行排列。这两种排列方式分别可能导致6个和4个数据点受到边缘效应的影响。因此，始终优先选择行向排列。
修改与故障排除
请注意，反应全程的荧光信号变化必须呈线性。在反应最初几分钟内，由于温度变化，或在最后几分钟内，由于接近平衡状态，可能会出现非线性现象。如果存在非线性，可调整反应参数（例如稀释肌球蛋白、改变检测温度），或仅对数据的线性部分进行分析。
如果抑制剂与A...

肌球蛋白是一类能将化学能转化为机械能的分子马达，可水解三磷酸腺苷（ATP），从而在真核细胞的肌动蛋白细胞骨架丝上产生定向运动1,2。它们在结构和动力学上已适应多种细胞内功能，例如细胞器运输、肌肉收缩或细胞骨架张力的产生1,2。人类基因组中存在约40个肌球蛋白基因，归属于约12个不同的肌球蛋白类别，共同构成肌球蛋白超家族3,4。不同类别的肌球蛋白成员在多种疾病中发挥着重要作用，包括多种癌症、神经系统疾病、骨骼肌病以及肥厚型心肌病5,6。鉴于这些分子马达在生理和病理过程中具有广泛的功能，它们正日益被视为多种疾病的潜在药物靶点7。近年来，在发现新的肌球蛋白抑制剂8,9,10和激活剂11，以及优化已有化合物性能方面12,13,14,15，已取得显著进展。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）偶联的ATP酶检测法长期以来被用于测定多种酶的ATP酶活性，例如肌质网Ca2+泵ATP酶16、DNA修复ATP酶Rad5417、AAA+ ATP酶p9718以及微管马达蛋白驱动蛋白（kinesin）19。该检测方法利用一个ATP再生循环：ATP酶反应生成的二磷酸腺苷（ADP）由丙酮酸激酶（PK）催化重新生成ATP，同时伴随一分子磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸；随后，丙酮酸在乳酸脱氢酶（LDH）作用下被还原为乳酸，此过程同时将一分子NADH氧化为NAD。因此，NADH浓度随时间的减少量等于ATP的水解速率。只要PEP充足，ATP再生循环可使ATP浓度保持接近恒定，同时维持ADP浓度在较低水平。这使得反应进程呈线性，便于确定初始反应速率，并有助于避免ADP引起产物抑制19。尽管NADH偶联的ATP酶检测法已被适配至96孔板格式20，但较高的反应体积（约150 µL）导致试剂消耗量大，成本较高，因而不太适用于对大量化合物进行快速筛选。其他替代方法，例如依赖于检测ATP酶催化产生磷酸根的孔雀绿（malachite green）检测法19,21，已被证明更适用于微型化和高通量筛选22,23,24。然而，终点法检测更容易受到多种人为假象的影响（下文将讨论），若缺乏全程反应动力学曲线，这些假象可能难以被发现。
本文优化了与NADH偶联的ATP酶检测方法，适用于小分子抑制剂的半高通量筛选。以骨骼肌和心肌肌球蛋白II以及肌球蛋白抑制剂blebbistatin8、para-aminoblebbistatin13和para-nitroblebbistatin12为例，展示了该检测方法的效能，其检测读数依赖于NADH的荧光信号。本实验方案可适用于针对任何产生ADP的酶的筛选研究。

<table><tbody><tr><td>384孔低裙边黑色平底聚苯乙烯NBS微孔板</td><td>康宁</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>ATP（腺苷-5′-三磷酸）&amp;prime;三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Aurora FRD-IB 分配器</td><td>Aurora Discovery, Inc.</td><td>00017425</td><td></td></tr><tr><td>Biomek NXP 多通道实验室自动化工作站</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A31841</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>定制合成</td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白，无蛋白酶）</td><td>Akron Biotech</td><td>AK1391&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R，制冷型，配备 FA-35-6-30 转子</td><td>Eppendorf</td><td>022620663</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430，非制冷型，配转子 A-2-MTP</td><td>Eppendorf</td><td>022620568</td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DTT（DL-二硫苏糖醇）</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip 多通道移液器；384 格式；8 通道</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4672010</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip 多通道移液器；96孔板格式；8通道</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4672080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）&amp;prime;，N&amp;prime;四乙酸</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 2104 多功能酶标仪</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>LDH（兔肌肉L-乳酸脱氢酶）</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;六水合氯化镁 (Magnesium chloride hexahydrate)</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp; 12620-926&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>384孔微孔板，聚丙烯材质，小体积，深孔，本色</td><td>Greiner Bio-One</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>MOPS（3-(N-吗啉代)丙磺酸）</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白马达蛋白（全长）（牛心肌）</td><td>细胞骨架&amp;nbsp;</td><td>MY03</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白马达蛋白（全长）（兔骨骼肌）</td><td>细胞骨架&amp;nbsp;</td><td>MY02</td><td></td></tr><tr><td>NADH&amp;beta;-还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; （叠氮化钠）</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>NaOH（氢氧化钠）</td><td>&amp;nbsp;Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>CFP 470/24 nm 光学滤光片（发射）</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5850</td><td>条形码 240</td></tr><tr><td>光学滤光片 Fura2 380/10nm（激发）</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5390</td><td>条形码 112</td></tr><tr><td>光学模块：β-内酰胺酶</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-4270</td><td>条形码 418</td></tr><tr><td>OriginPro 2017 软件</td><td>OriginLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-氨基布雷比斯塔汀</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>定制合成</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;段落&lt;/em&gt;-硝基布比他汀</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>定制合成</td></tr><tr><td>磷酸烯醇式丙酮酸单钾盐（Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt）</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>PK（兔肌丙酮酸激酶）</td><td>Sigma</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>兔肌丙酮粉</td><td>Pel Freez Biologicals</td><td>41995-2</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于筛选小分子抑制剂的nadh偶联atp酶检测半高通量改良方法

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATP酶利用储存在三磷酸腺苷中的自由能，在体内催化多种不会自发进行的吸能生化过程。这些蛋白质对于细胞生命活动的几乎所有方面都至关重要，包括代谢、细胞分裂、对环境变化的响应以及运动。本文所述方案描述了一种与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）偶联的ATP酶检测方法，已适用于小分子ATP酶抑制剂的半高通量筛选。作为一种原理验证，该检测方法已应用于心脏和骨骼肌肌球蛋白II——两种以肌动蛋白为基础的分子马达ATP酶。在该检测中，ATP的水解通过酶促反应与NADH的氧化相偶联。首先，ATP酶生成的ADP由丙酮酸激酶（PK）再生为ATP，同时PK催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸。随后，丙酮酸在乳酸脱氢酶（LDH）作用下被还原为乳酸，同时LDH催化NADH的氧化。因此，ATP浓度的降低与NADH浓度的降低直接相关，后者可通过NADH固有荧光的变化进行监测。只要反应体系中存在足够的PEP，ADP浓度将保持极低水平，从而避免ATP酶被其自身产物抑制。此外，ATP浓度基本保持恒定，从而获得线性的反应进程曲线。荧光信号被连续监测，便于对数据质量进行直观评估，并有助于排除潜在的干扰因素（例如由化合物沉淀或温度变化引起的假象）。

用于筛选实验的典型板布局图如图1所示。第一行和最后一行分别保留用于NADH校准和阳性对照（20 µM para-氨基布比斯汀，0.5% DMSO）。其余行（B至O）用于测试化合物的抑制活性。在此，从DMSO中10 mM的化合物浓度开始，进行15步连续1:2稀释，并将稀释液从化合物板转移至检测板，使检测板上的最高终浓度化合物浓度为50 µM（含0.5% DMSO）。每两个行用于获取一个化合物的剂量-反应曲线（每个化合物48个数据点）。请注意，板布局图可根据特定研究目标重新设计。例如，若目标是获得大量化合物的单点筛选数据，则可在单个384孔板上测试112种化合物，同时使用相同的阳性对照和NADH校准布局（每种化合物设三个重复）。建议每种化合物（或每个浓度）至少保留3个数据点，并避免将某一种化合物仅布置在板边缘的孔中，因为这些数据点可能受边缘效应影响。为评估边缘效应的影响程度，应首先运行一个仅含阴性对照的完整板。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

已将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）偶联的ATP酶检测法改进用于小分子肌球蛋白抑制剂的半高通量筛选。该动力学检测采用384孔微孔板格式进行，每孔总反应体积仅为20 µL。该平台几乎可适用于所有产生ADP的酶。

一种用于筛选小分子抑制剂的NADH偶联ATP酶检测半高通量改良方法

ATP酶利用储存在三磷酸腺苷中的自由能，在体内催化多种原本无法自发进行的吸能生化过程，这些过程将……

本方案适用于多种旨在开发ATP酶抑制剂的筛选项目，这些抑制剂可作为基础研究的探针，也可用于潜在的临床化合物。该方法已针对半高通量筛选应用进行了优化，同时设计上避免了多种常见的干扰因素，且无需处理危险物质。在我们的实验室中，我们一直利用该检测方法开发新型且特异性的非肌球蛋白II抑制剂，用于治疗甲基苯丙胺使用障碍。理论上，该方法可轻松应用于任何产生ATP的酶。直观演示有助于阐明所有关键的技术细节。首先，通过将浓缩的肌动蛋白储备液用肌动蛋白缓冲液稀释，为每块384孔黑色聚苯乙烯微孔板配制4份500微升的20微摩尔稀释肌动蛋白溶液。通过上下吹打30次充分混匀溶液，以打断肌动蛋白纤维，降低溶液黏度和不均一性。随后离心溶液，以去除任何沉淀的蛋白质。小心地将上清液转移至一个干净的离心管中。为每块检测板配制主酶混合液：在15毫升锥形离心管中加入3,252.9 µL用于骨骼肌肌球蛋白II检测的肌球蛋白缓冲液、171.4 µL乳酸脱氢酶（LDH）溶液和171.4 µL丙酮酸激酶（PK）溶液。为每块板配制主底物混合液：在15毫升锥形离心管中加入162.1 µL ATP、162.1 µL磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和324.1 µL NADH溶液。此时不要加入肌动蛋白，以避免聚集和沉淀。为制备用于校准的七步连续一比二稀释的NADH溶液，请准备八个1.5毫升微量离心管。在第一个管中，将12.3微升NADH储备液与257.7微升肌球蛋白缓冲液混合，配制成250微摩尔的溶液。然后将135 µL肌球蛋白缓冲液分装至其余七个试管中。从第一支试管中移取135 µL溶液至第二支试管，通过移液混匀。重复此步骤直至第七支试管。使用最后一支试管作为空白对照，仅加入缓冲液而不含NADH。在化合物板上应始终包含阳性和阴性对照，在检测板上则需设置NADH梯度稀释用于校准。这些对照在数据分析过程中对识别假象至关重要。使用八通道移液器，将20微升NADH校准溶液以三复孔形式加入检测板的第一行。然后向酶混合液中加入4.2微升骨骼肌肌球蛋白II。短暂涡旋混匀。在分装前立即向酶混合液中加入肌球蛋白。稀释后的肌球蛋白溶液长时间孵育可能导致因沉淀以及非特异性结合至塑料表面而丧失活性。将制备好的肌球蛋白酶混合液加入自动分液器的其中一个样品容器中。在96孔板中，除第一行外，向检测板的每个孔中加入8.4 µL肌球蛋白酶混合液。然后将检测板和化合物板放置在配备100纳升针头工具的自动液体处理系统的耗材定位器上。接着在软件中运行相应方法，将100纳升溶液从制备好的化合物板转移至检测板。接下来，将检测板置于微量板振荡器上，在室温下以1,200 rpm振荡一分钟。向底物混合液中加入4,052微升离心后的肌动蛋白溶液，并短暂涡旋混匀。为启动酶促反应，使用自动分液器向检测板的每一孔中加入11.6微升肌动蛋白底物混合液（第一行各孔除外）。在微量板振荡器上，于室温下以1,200 rpm的速度振荡反应板1分钟。将反应板以101 ×g离心30秒。检测时采用380纳米激发滤光片（带宽10纳米）、470纳米发射滤光片（带宽24纳米），并配合425纳米截止二向色镜进行测定。在运行检测之前，优化闪光次数、检测器增益、板尺寸和测量高度。以高浓度模式运行测量。确保酶标仪内部温度已稳定在 25 摄氏度。将酶标板放入酶标仪中，再振荡30秒，使各孔中液体表面形状一致，并使酶标板达到检测温度。每隔45秒扫描一次酶标板，连续记录30分钟的NADH荧光信号。根据导出的数据，绘制每个孔的荧光强度随时间变化的曲线。进行简单线性回归，以确定每个孔荧光响应的斜率和截距。斜率与NADH消耗速率成正比，可作为ATP消耗速率的良好近似值；截距与测量开始时的NADH浓度成正比。然后，通过将获得的酶标板第一行的截距值对NADH浓度作图，绘制NADH的标准曲线。与初始时刻原始荧光强度读数的平均值相比，截距值能更可靠地估计初始时刻的真实荧光强度。采用简单线性回归法，计算NADH标准曲线的斜率和截距。此处，截距表示无NADH存在时的荧光背景信号，而斜率对应于1摩尔NADH溶液推算出的理论荧光强度。要将荧光变化转换为ATP消耗速率，需将其他孔中获得的荧光响应斜率除以NADH校准曲线的斜率。接下来，将ATP消耗速率对抑制剂浓度作图。为了确定抑制常数，可使用任何能够进行非线性曲线拟合的适当统计软件，例如 Origin 2017。选择非线性曲线拟合，将剂量-反应数据拟合至对应于简单一对一结合平衡模型的二次方程。Y 表示 ATP 消耗速率。Y-最小值是指在无抑制剂存在时的ATP消耗速率。Y-最大值是指在100%抑制条件下的理论ATP消耗速率。t 和 t 分别为肌球蛋白酶和抑制剂的总浓度。KI 是抑制常数。本研究中，无论使用何种肌球蛋白或是否存在抑制剂，骨骼肌和心肌肌球蛋白 II ATP酶反应均表现出线性的荧光强度变化轨迹。基础状态及肌动蛋白激活的ATP酶速率均与骨骼肌或心肌肌球蛋白 II 的浓度呈线性依赖关系。筛选窗口系数或Z因子为0.78，表明该检测方法可靠，且阳性与阴性对照组之间分离效果良好。在等于或低于其报道的溶解度值时，Blebbistatin、对氨基Blebbistatin（para-Aminoblebbistatin）和对硝基Blebbistatin（para-Nitroblebbistatin）均表现出规律的剂量-反应曲线。通过将代表简单平衡结合模型的二次方程拟合至实验数据，确定了对心肌和骨骼肌肌球蛋白II的抑制常数。在使用骨骼肌肌球蛋白II进行的ATP酶实验中，Blebbistatin获得的荧光强度轨迹显示，信号随抑制剂浓度增加而呈正常线性下降。然而，在高于blebbistatin溶解度的情况下，观察到信号意外增强，这很可能归因于强荧光性blebbistatin晶体的形成。对于para-Nitroblebbistatin，在原始荧光强度曲线正常的情况下，超过其溶解度时所得反应速率因沉淀产生而偏离已确定的剂量-反应曲线。通过该方法，我们已开发出新型、高效且特异性的肌球蛋白抑制剂，这些抑制剂未来可能作为基础研究中的科研工具，或直接作为候选分子用于后续开发。始终建议使用不同的ATP酶或其他针对目标酶的特异性功能检测方法，以区分真实阳性结果与假阳性结果。所有蛋白质均可结合塑料表面，这一问题可能对实验结果产生显著影响，特别是当蛋白质浓度较低时。应始终避免不必要的液体操作，并使用非吸附性离心管。传统的ATP酶检测方法通常需要使用硫酸、有毒物质或放射性材料。相比之下，NADH偶联ATP酶检测仅需使用无毒或毒性极低的试剂。

a-semi-high-throughput-adaptation-nadh-coupled-atpase-assay-for

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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