使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化

定量多路复用共免疫沉淀（QMI）使用户能够同时测量预定义的蛋白质相互作用网络中的数百个二元相互作用。通过在同一个酸盐中同时执行多个共体，生物信息学技术可以检查共同关联组如何以协调的方式变化。开发该检测非常耗时，但一旦 QMI 面板在手网络规模中，就可以在相对简单的通宵检测中收集有关信号转导系统的数据。

QMI 要求将不同的样品和试剂精确移液到 96 个孔板中。在设置和运行每个检测时，应仔细注意，以防止错误。对于样品制备和免疫沉淀，首先将样品用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在合适的洗涤剂中去除，在冰上孵育15分钟。

在孵育结束时，将样品旋转以去除膜和碎屑，并在上清液上进行 BCA 测定，根据标准协议确定蛋白质浓度。使蛋白质浓度正常化后，准备一个磁珠主混合物，每井每类包含大约250个磁珠。使用磁分离在 Fly P 缓冲液中清洗磁珠混合两次，然后将磁珠重新悬浮在每个样品的 20 微升 Fly P 缓冲液中。

经过彻底的移液后，将20微升珠分到每个样品的一个冰冷微离心管中，并将同等体积的糖酸盐与正常化蛋白质浓度添加到每个管中，用于免疫沉淀。然后将每个赖酸盐样品分成一个管，每个板运行和免疫沉淀样品在旋转器上四摄氏度过夜保护免受光。第二天早上，使用磁珠架从第一组管子中去除落酸，每次洗涤时在500微升的冰冷飞P缓冲液中洗涤珠子两次。

计算再增量后，在计算量中重新分配免疫沉淀物的冰冷飞P缓冲液。通过轻轻移液彻底重新悬浮磁珠，并将每井 25 微升珠点分配到冰上平底 96 井板中。在不同的96井板中，通过刺激探针抗体稀释两倍的工作浓度。

使用多通道移液器将每个探针抗体稀释的 25 微升分配到包含检测板的磁珠的适当孔中，并在水平板摇床上高速摇动，以混合和重新悬浮磁珠。混合后，在4摄氏度下降低一小时的孵育速度，防止光线。在孵化结束时，在四摄氏度的磁板垫圈上用新鲜飞P缓冲液清洗板三次。

上次洗涤后，在飞P缓冲液中重新用50微升的链球菌PE稀释1至200。摇动混合物并重新暂停珠子，然后将板在4摄氏度下孵育30分钟，防止光线。在孵育结束时，在4摄氏度的磁板垫圈上用飞P缓冲器清洗板三次，并在125微升的飞P缓冲器中重新悬浮珠子。

在 900 次旋转时摇动板一分钟，以彻底重新释放磁珠，然后将板装入回流流量圆度计中。在流式细胞仪软件中，选择"高RP1目标"设置、每个区域1000个点珠的停止条件以及80微升的采样量。中途暂停运行，并重新暂停珠子，以防止沉降。

在运行结束时，导出 XML 格式的数据文件。若要执行 ANC 分析，请填写 ANC 输入文件以反映实验设计的详细信息并运行程序，该程序将 CSV 文件写入活动目录。以命中结尾的文件。

csv 将报告在至少四个实验复制中，在对照和实验条件之间在 0.05 的假阳性水平下明显不同的蛋白质关联。对于加权相关网络分析，粘贴 Matlab 以 mfi 结尾的数据文件输出的列标题。csv 进入新电子表格的第一列，并添加实验编号实验列和实验治疗实验治疗列以及要分析的任何其他变量。

将此文件另存为特征。csv 和打开 R 工作室。将工作目录设置为包含 mfi 的文件夹。

csv 和特征。csv 文件，突出显示代码部分，并点击命令 Enter 以运行 R 命令，如注释的命令文件中所示。与每个实验特性显著相关的加权相关网络分析模块将作为图形文件输出，每个模块的每个交互的相关性将输出为CSV文件。

对于 ANC 输出文件中的每一次交互，请确定 CNA 是否也具有该交互意义，并创建一个新列，指示每个 ANC 命中是否也是 CNA 命中。转换值以记录两个折数更改，并计算所有 ANC 联合 CNA 命中的平均值。最后，制作一个新的电子表格，每个 ANC 联合 CNA 在一列中列出其免疫沉淀目标，其探测目标在第二列中，并在第三列中显示其折叠变化值。

将此文件作为网络导入 Cytoscape 以创建节点边缘图。两种独立统计方法确定的高置信蛋白相互作用，使用开源软件 Cytoscape 将可视化为节点边缘图，或使用补充材料中包含的 R 代码和分析说明作为热图。在整个协议中，用户需要小心切化移液器，保持细致的记录，并保持样品始终保持冷。

我们使用QMI来了解信号转导通路如何区分不同的输入类型，并集成来自多个受体的信息。