Name: 使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 学习使用定量多路复用共免疫沉淀技术，通过生物信息学方法分析蛋白质相互作用网络动态变化。该技术可在96孔板中同时检测数百种二元相互作用，无需基因工程标签，适用于神经科学和细胞生物学研究。

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作者希望感谢 Tessa Davis 在 QMI 检测方法开发中的重要贡献，并感谢 Smith 实验室和 Schrum 实验室现任及前任成员提供的技术指导和学术支持。本研究由美国国立精神卫生研究院（NIMH）资助，项目编号为 R01 MH113545 和 R00 MH102244。

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<li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722(2012).</li>
<li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22BioRXiv%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

QMI 检测需要在抗体组合开发、仪器设备和试剂方面投入大量资源，但一旦建立该检测方法，即可获取高维度数据，用于观察蛋白质相互作用网络在实验可控刺激下的响应情况。从技术上讲，QMI 要求精确的移液操作以及对样本和抗体孔位的仔细追踪。仔细标记检测板非常有帮助，同时建议在纸上绘制详细的孔位模板，并在后续数据分析时保留使用。始终保持微球和裂解液处于低温状态至关重要，包括在流式细胞仪微孔板载架中也应如此（定制制冷操作说明见图 S1），这一点再怎么强调也不为过。蛋白质相互作用在室温下会迅速解离，早期尝试使用未经改造的室温流式细胞仪时，结果仅鉴定出许多对温度敏感的相互作用，而未能检测到随预期刺激发生变化的相互作用。
QMI 是一种基于抗体的检测方法，因此抗体的初始选择至关重要。应尽可能使用单克隆或重组抗体，以减少结果的变异性。多克隆抗体存在批间差异，但针对短表位的肽段来源多克隆抗体在时间上相对稳定。通过一次性购买大量抗体可最大限度减少批间漂移；这种方法还支持定制无载体蛋白的抗体，从而避免使用 Melon Gel 和离心柱进行抗体纯化，以及由此带来的抗体损失。</...

动态的蛋白质-蛋白质相互作用构成了分子信号级联和运动结构，这些是大多数细胞生理功能的分子基础1。这些过程通常被描述为基于单一输入在稳态之间切换的线性信号通路，但实验和建模数据明确表明，它们是以整合网络的方式运作的2,3,4。以G蛋白为例，不同的受体通常能够激活同一种G蛋白，而单个受体也可以激活多种类型的G蛋白5,6。为了使数量相对有限的G蛋白类别能够特异性地调控大量细胞功能（如突触传递、激素调节和细胞迁移），细胞必须对这些信号进行整合与区分4,5。已有证据表明，这种信号特异性——不仅限于G蛋白，也包括其他信号分子——主要来源于精细调控的蛋白质-蛋白质相互作用及其时间动态特性1,3,4,5,6,7。由于信号网络由具有多个输入、输出和反馈回路的动态蛋白质复合物组成，单一扰动就可能改变细胞生理整体的稳态平衡4,7。目前普遍认为，应从网络视角来研究信号传导，以更深入理解多种输入信号的整合如何调控健康与疾病状态下的特定细胞功能7,8,9,10,11,12,13。基于这一认识，定量多重免疫沉淀技术（Quantitative Multiplex Immunoprecipitation, QMI）被开发出来，用于获取关于动态蛋白质相互作用网络中折叠变化的中等通量定量数据。
QMI 是一种基于抗体的检测方法，其中细胞裂解液与一组免疫沉淀抗体共同孵育，这些抗体共价连接在含有不同比例荧光染料的磁珠上。将特异性抗体连接至不同类别的磁珠，可实现从同一样本裂解液中同时进行多个靶蛋白的共免疫沉淀。在免疫沉淀（IP）之后，磁珠与第二种带有荧光标记的探针抗体（或生物素标记的抗体联合荧光标记的链霉亲和素）进行孵育。通过流式细胞术检测每对免疫沉淀抗体与探针抗体所识别蛋白之间的共关联关系，即 PiSCES（通过暴露的表面表位检测到的共享复合物中的蛋白），并可在不同样本条件下进行定量比较14。 图1 中的示意图展示了进行 QMI 检测的各个步骤，包括磁珠上由荧光标记探针抗体标记的免疫沉淀蛋白复合物的示意图（图1C）。
定量微阵列免疫沉淀（QMI）的灵敏度取决于裂解液中的蛋白浓度与用于免疫沉淀的磁珠数量之间的比例关系，而要达到检测10%变化幅度的分辨率，相较于其他共免疫沉淀方法，QMI仅需极少量的起始材料14,15。例如，QMI所需的起始材料量与夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）相当，但单次QMI检测可同时分析多个分子相互作用。已有研究使用来自4 mm皮肤活检样本分离的1–5 × 105个原代T细胞、小鼠前额叶皮层3 mm冠状切片制备的P2突触体，或3 × 106个培养的小鼠原代皮层神经元，成功完成了包含20个免疫沉淀反应和20个探针靶标的QMI实验14,16,17。这种高灵敏度使QMI特别适用于临床样本等来源有限的细胞或组织的分析。
定量显微成像技术（QMI）可适用于任何先前定义的蛋白质相互作用网络（前提是存在相应的抗体），迄今为止已用于分析T细胞抗原受体（TCR）信号体以及神经元谷氨酸能突触中的一组特定蛋白质17,18。在T细胞受体信号传导研究中，QMI最初被用于识别刺激诱导的PiSCES变化，随后用于区分自身免疫患者与对照组，检测内源性自身免疫信号，并最终提出一个涉及疾病相关相互作用子网络失衡的假说14。最近，相同的QMI检测面板被用于确定胸腺细胞选择由TCR相关蛋白质信号的定量差异而非定性差异所决定19。在神经元中，QMI被用于描述不同输入信号类型下蛋白质相互作用网络的输入特异性重排，这一发现支持了突触可塑性领域新近提出的模型17。此外，该突触QMI检测面板还被用于识别七种自闭症小鼠模型之间的差异，根据其PiSCES生物特征将这些模型聚类为亚组，并准确推测出其中一种模型中先前未被识别的共同分子缺陷16。类似的方法可用于筛查可能对不同药物治疗产生响应的其他亚组，或为特定响应亚组分配合适的药物。除基础科学研究外，QMI在疾病诊断、患者亚型分类以及药物开发方面均具有潜在应用价值。
为了构建QMI抗体组合，初步的抗体筛选和选择方案详见下文第1部分。一旦确定了抗体组合，第2部分将描述将选定抗体与磁珠偶联用于免疫沉淀（IP），以及对选定的探针抗体进行生物素标记的方案。第3部分描述了在细胞或组织裂解液中进行QMI检测的实验流程。最后，由于单次实验可产生约5 × 105个独立数据点，第4部分提供了辅助数据处理、分析和可视化的操作说明及计算机代码。第2至第4部分所述工作流程的概览见图1。

<table><tbody><tr><td>96孔平底板</td><td>Bio Rad</td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>VWR</td><td>82006-704</td><td></td></tr><tr><td>Bioplex 200系统（带HTF）</td><td>Bio Rad</td><td>171000205</td><td>经改装以实现部分冷藏，详见图S1</td></tr><tr><td>Bio-Plex Pro洗涤站</td><td>Bio Rad</td><td>30034376</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>C37481</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39256</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex微球</td><td>Luminex</td><td>MC12xxx-01</td><td>xxx为3位数微球区域编号</td></tr><tr><td>Melon Gel IgG离心纯化试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>45206</td><td>用于抗体纯化</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>微孔板密封膜（非无菌）</td><td>USA Scientific</td><td>2920-0000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合液#2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>三明治制备冰箱</td><td>Norlake</td><td>SMP 36 15</td><td>用于Bioplex 200系统的定制冷藏</td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-PE</td><td>BioLegend</td><td>405204</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39269</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr></tbody></table>

使用多重共免疫沉淀法量化蛋白质相互作用网络动态

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

动态的蛋白质-蛋白质相互作用调控着细胞行为，从细胞运动到DNA复制再到信号转导均受其控制。然而，在蛋白质相互作用网络中监测多个蛋白质之间的动态相互作用在技术上具有挑战性。本文介绍一种定量多重免疫沉淀（QMI）实验方案，该方法基于对通过暴露表面表位检测到的共享复合物中蛋白质（PiSCES）的相对荧光测量，实现对蛋白质相互作用变化倍数的定量评估。在QMI中，来自细胞裂解液的蛋白质复合物被免疫沉淀至微球上，随后用针对另一蛋白质的标记抗体进行探测，以定量PiSCES的丰度。不同的免疫沉淀抗体被偶联至不同光谱特性的磁珠（MagBead），从而使流式细胞仪能够区分多个并行的免疫沉淀反应，并同时量化每种反应所结合的探针抗体的量。QMI无需基因标记，且相较于其他免疫沉淀方法仅需极少量生物样本。QMI可适用于任何已知的相互作用蛋白组合，目前已用于表征T细胞和神经元谷氨酸突触中的信号网络。相关研究结果已催生新的科学假说，并具有潜在的诊断与治疗应用价值。本实验方案详细说明了从初始抗体组合筛选到实验操作及数据分析的完整QMI流程。QMI实验的初步建立包括对抗体进行筛选以构建抗体组合，并通过实验确定合适的裂解缓冲液。后续试剂制备包括将免疫沉淀抗体共价偶联至磁珠，以及对探针抗体进行生物素化，以便其可通过链霉亲和素偶联的荧光染料进行标记。实验操作时，将裂解液与磁珠混合孵育过夜，随后将磁珠分装，分别与不同的生物素化探针抗体孵育，再加入荧光染料标记，最后通过流式细胞术读取信号。通过两种统计学检验方法识别在不同实验条件下存在显著差异的PiSCES，并利用热图或节点-边线图对结果进行可视化展示。

抗体筛选 
图 2B 展示了对 Connexin36 蛋白进行筛选的结果。大多数 IP 探针（IP_probe）组合在 IgG 对照组中未产生信号。使用单克隆抗体 1E5 进行免疫沉淀（IP），并用 1E5 或多克隆抗体 6200 作为探针时，与 IgG 对照组相比，微珠分布出现向右偏移。此处选择 IP 使用 1E5、探针使用 6200poly，以避免将同一抗体同时用于 IP 和探针，这既能降低非特异性蛋白被两种独立抗体识别的可能性，也能通过不同表位提高检测到共结合相互作用的概率。最佳选择是 IP 与探针组合的平均荧光强度（MFI）至少比 IgG 对照组高出 1–2 个对数级；但若无其他可用组合，也可考虑使用 MFI 较弱但仍能稳定区别于对照组的抗体对。图 2C 展示了 1E5-6200poly 组合的特异性验证实验结果。转染 Connexin36 质粒的 293 细胞裂解液导致微珠分布向右偏移约 1.5 个对数...

定量多重免疫沉淀（QMI）利用流式细胞术，可灵敏地检测两个样本之间特定蛋白质-蛋白质相互作用丰度的差异。QMI仅需少量生物材料，无需基因工程标签，且可适用于任何已知的蛋白质相互作用网络。

动态的蛋白质-蛋白质相互作用调控细胞行为，从细胞运动到DNA复制再到信号转导。然而，监测这些动态的……

定量多重共免疫沉淀（QMI）技术使研究人员能够在预定义的蛋白质相互作用网络中同时测量数百种二元相互作用。通过在同一体系裂解液中同时进行多次共免疫沉淀实验，再结合生物信息学方法，即可分析多组蛋白质共关联变化的协调模式。该检测方法在开发阶段耗时较长，但一旦构建完成QMI检测面板，便可在相对简单的过夜实验中获取网络规模的信号转导系统数据。QMI 需要将不同的样品和试剂准确地移液至 96 孔板中。在建立和运行每个检测时，应仔细记录以防止错误。进行样品制备和免疫沉淀时，首先在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的合适去垢剂中裂解样品，并在冰上孵育 15 分钟。孵育结束后，离心样品以去除膜成分和碎片，然后对上清液进行BCA蛋白定量检测，按照标准操作流程测定蛋白浓度。在将蛋白浓度归一化后，配制磁珠主混合液，每孔含各类磁珠约250个。使用磁力分离法用Fly P缓冲液洗涤磁珠混合物两次，随后将磁珠重悬于每份样品20 µL的Fly P缓冲液中。充分吹打混匀后，将20微升珠子分装至每个样品对应的预冷微量离心管中，并向每管加入等体积、经蛋白浓度归一化的裂解液，用于免疫沉淀。随后，将每份裂解液样品分至每个实验所用的平板对应的管中，并在4°C、避光条件下于旋转仪上孵育过夜。次日早晨，使用磁力架从第一组管中移除裂解液，并用500微升预冷的Fly P缓冲液洗涤珠子两次，每次洗涤均使用500微升。计算重悬体积后，将免疫沉淀物重悬于相应体积的冰上预冷的 Fly P 缓冲液中。通过轻柔吹打充分重悬磁珠，并将 25 微升磁珠悬液分装至冰上的平底 96 孔板中，每孔 25 微升。在另一个 96 孔板中，将稀释后的探针抗体稀释至两倍工作浓度。使用多通道移液器将每种探针抗体稀释液各25微升加入含有磁珠的检测板的相应孔中，并在水平板式振荡器上高速振荡以混匀并重悬磁珠。混匀后，降低振荡速度，在4°C避光条件下孵育1小时。孵育结束后，在4°C条件下，使用磁板洗涤仪每次加入新鲜的Fly P缓冲液洗涤3次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于50微升Fly P缓冲液中，其中加入链霉亲和素-PE（按1:200稀释）。混匀后轻轻振荡，使磁珠充分重悬，然后将酶标板置于4°C避光孵育30分钟。孵育结束后，在4°C条件下使用磁性板洗涤仪用Fly P缓冲液洗涤3次，并将磁珠重悬于125微升Fly P缓冲液中。以每分钟900转的速度振荡平板1分钟，充分重悬磁珠，然后将平板载入带制冷功能的流式细胞仪。在流式细胞仪软件中，选择“High RP1 Target”设置，停止条件为每个区域1,000个微球，上样体积为80微升。运行至一半时暂停，重新混悬微球以防止沉降。运行结束后，将数据文件导出为 XML 格式。为了进行 ANC 分析，需填写 ANC 输入文件，以反映实验设计的详细信息，然后运行程序，程序会将一个 CSV 文件写入当前活动目录中。该文件以 hits 结尾。csv 将报告在对照组和实验组之间，在四次实验重复中至少有三次出现显著差异（假阳性水平为 0.05）的蛋白质共关联结果。对于加权相关网络分析，将 Matlab 输出的数据文件中以 mfi.csv 结尾的列标题复制到新电子表格的第一列，并添加“Experiment”列用于表示实验编号，“Treatment”列用于表示实验处理，以及其他需要分析的变量列。将此文件保存为 traits.csv 并打开 R Studio。将工作目录设置为包含 mfi 的文件夹。csv 和 traits.csv 文件，选中代码的相应部分，然后按 Command+Enter 运行注释中指示的 R 命令。与各实验性状显著相关的加权相关网络分析模块将以图形文件形式输出，每个相互作用与各模块的相关性将以 CSV 文件形式输出。对于 ANC 输出文件中的每个相互作用，判断该相互作用在 CNA 中是否也具有显著性，并创建一个新列，用于指示每个 ANC 显著结果是否同时也是 CNA 显著结果。将数值转换为 log2 倍数变化值，并计算所有 ANC 与 CNA 共有显著结果的平均值。最后，创建一个新的电子表格，其中每一行列出 ANC 与 CNA 共有的显著结果，第一列为免疫沉淀靶标，第二列为探针靶标，第三列为倍数变化值。将此文件作为网络导入 Cytoscape，以生成节点-边关系图。通过两种独立的统计方法鉴定出的高置信度蛋白质相互作用，可使用开源软件 Cytoscape 可视化为节点-边关系图，或使用补充材料中提供的 R 代码及分析说明生成热图。在整个实验流程中，操作人员需注意准确移液、详细记录实验过程，并始终确保样品保持低温。我们已利用量子磁感应（QMI）来理解信号转导通路如何区分不同类型的输入，并整合来自多个受体的信息。

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科研

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生物化学

使用多路复用共免疫沉淀对蛋白质相互作用网络动力学进行量化

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。...

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

使用SILAC-免疫共沉淀定量蛋白质组学鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用伙伴

蛋白质-蛋白质相互作用可发生在细胞的细胞核和细胞质中。为了研究这些相互作用，通常采用传统的共免疫沉淀法和现代的邻近连接技术。在本研究中，我们比较了这两种方法，以可视化NF90-RBM3相互作用在细胞核和细胞质中的分布情况。...

通过免疫共沉淀法在核组分和胞质组分中可视化蛋白质-蛋白质相互作用 原位 邻近连接实验

细胞间连接是乳腺在特定发育阶段发挥功能和发育所必需的结构。本文提供了一种利用小鼠乳腺组织研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）及共定位的详细实验方案。这些技术可用于探究不同发育阶段下细胞间连接结构之间物理关联的动态变化。...

小鼠乳腺组织中缝隙连接、紧密连接和黏附连接组分间蛋白质相互作用及共定位分析

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。...

无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

我们介绍一种用于定量蛋白质组学数据分析和可视化网络分析的系统生物学工具...

JUMPn：一种用于蛋白质组学中蛋白质共表达聚类与网络分析的简化应用程序

本文介绍一种利用一组相容性载体共表达不同标签蛋白的细菌共表达方法，随后结合常规的下拉技术，用于研究无法自行组装的蛋白复合物 体外.

细菌细胞中共表达偶联下拉实验作为高效检测困难蛋白质-蛋白质相互作用的工具

本方案将质谱光度法与一种新型微流控系统相结合，用于研究低亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法基于对溶液中高浓度复合物的快速稀释，从而实现对低亲和力的测量，并拓展了质谱光度法的应用范围。...

通过将微流控技术与质量光度法结合分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

蛋白质-蛋白质相互作用对于阐明靶蛋白的功能至关重要，而免疫共沉淀（co-IP）可轻松验证蛋白质相互作用（PPI）。我们将编码表位标签蛋白的质粒瞬时转染至HEK-293细胞中，并建立了一种免疫沉淀方法，以简便地验证两种靶蛋白之间的结合。...

使用抗表位标签亲和凝胶进行免疫沉淀以研究蛋白质-蛋白质相互作用

本文介绍了一种利用化学探针和质谱技术从原代细胞和组织中捕获并鉴定疾病特异性蛋白质-蛋白质相互作用的实验方案。通过专用的基于网络的分析平台对获得的相互作用数据集进行分析，以揭示与疾病相关的动态网络功能障碍及通路改变。...

绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

学习使用定量多路复用共免疫沉淀技术，通过生物信息学方法分析蛋白质相互作用网络动态变化。该技术可在96孔板中同时检测数百种二元相互作用，无需基因工程标签，适用于神经科学和细胞生物学研究。

使用多重共免疫沉淀法量化蛋白质相互作用网络动态

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