基于增强型绿色荧光蛋白的原代神经元 neurite 生长研究方法

转染效率低是确定蛋白质如何在原代神经元中重新激活神经突生长的主要障碍。本方案通过共转染EGFP来识别成功转染的细胞，从而克服这一问题。EGFP与目的蛋白的高共转染率确保了实验的准确性。

因此，现在需要进行免疫荧光染色。由于神经突起的生长发生在神经再生过程中，该方法可用于鉴定脑外伤或神经退行性疾病中修复受损神经网络的新靶点。在开始实验前，将无菌的18毫米圆形盖玻片放入12孔组织培养板的每个孔中，并在湿润的37°C培养箱中，用每毫升5微克的多聚-D-赖氨酸溶液对每张盖玻片进行包被，孵育至少1小时。

孵育结束后，吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌水冲洗盖玻片。在胚胎发育第18天，将取自定时妊娠的Sprague Dawley大鼠的子宫置于一个10厘米的培养皿中，用小型解剖剪剪开子宫和羊膜囊。用剪刀去除胎盘，并用镊子将整个胚胎转移至另一含有预冷PBS葡萄糖溶液的10厘米培养皿中。

使用剪刀沿颅骨的矢状缝剪开，用小型扁平刮匙将胚胎脑转移至一个新的含有新鲜冰冻 PBS 葡萄糖的 10 厘米培养皿中。在解剖显微镜下，使用两把 5 号镊子分离大脑半球与小脑及脑干，并去除脑膜。随后从大脑半球中分离出皮层，并将皮层置于含有新鲜冰冻 PBS 葡萄糖的 15 毫升离心管中。

进行原代皮质神经元培养时，在II级生物安全柜中，将皮质组织置于4摄氏度条件下静置5分钟，使其自然沉降，随后用0.05%胰蛋白酶EDTA替换PBS葡萄糖溶液。轻轻敲击混匀，并将组织置于37摄氏度水浴中孵育10分钟，每隔2分钟再次轻轻敲击一次。孵育结束后，加入4毫升维持培养基以终止消化反应，并使用1毫升移液器通过轻柔吹打对组织进行机械解离。

通过离心沉淀细胞，并将沉淀物重悬于1毫升维持培养基中进行第二次离心。将第二次离心后形成的沉淀物重悬于1毫升新鲜维持培养基中，计数后以每平方厘米6.5×10⁴个活细胞的浓度，将分离的神经元接种于12孔板中，每孔加入1毫升维持培养基。在37°C、5% CO₂条件下培养两天后，分别在两个1.5毫升离心管中将EGFP和目的蛋白质粒DNA与转染试剂稀释，然后将两者混合。

通过将转染混合物加入孔中，对细胞进行EGFP质粒转染。转染24小时后，用37摄氏度的PBS洗涤细胞，并在室温避光条件下用PBS中的4%多聚甲醛固定细胞10分钟。孵育结束后，用新鲜PBS洗涤固定后的细胞，每次洗涤重复三次，每次使用新鲜PBS。每个样本取一张显微镜玻片，每张玻片上加入少量荧光封片介质。

然后小心地将带有样本的包被盖玻片转移至封片剂上，使样本面朝向载玻片。为观察神经突生长，选择落射荧光显微镜的40倍物镜，每转染样本至少选取40个完整的EGFP阳性神经元，点击开始采集图像。所有神经突成像完成后，在ImageJ软件中使用NeuronJ插件打开所采集的图像，并测量每个神经元从胞体到生长锥顶端的最长神经突长度。

然后使用软件分析所获得的数据，以确定靶向蛋白对神经突生长的影响。细胞松弛素D以剂量依赖性方式抑制神经突延伸，而经神经生长因子处理的神经元中神经突外生得到增强。此外，与未转染的神经元相比，神经元生长衔接蛋白FE65可显著促进神经突外生，刺激作用达两倍。

尽管转染效率较低，免疫荧光分析显示，在两天的细胞培养中，超过80%的细胞能够成功共转染EGFP和FE65。转染后6小时可检测到EGFP表达，而FE65在12小时首次被检测到，两种信号在转染后最多可持续检测达七天。使用不同量的FE65质粒DNA转染原代大鼠皮层神经元，结果显示在0至0.5微克FE65质粒范围内，神经突延伸呈现剂量依赖性增加。

然而，在转染了0.5微克或1微克质粒的神经元中，未观察到生长方面存在显著差异。在尝试该方案时，重要的是从胚胎脑中分离出适当的区域。该技术也可应用于人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元的神经生长研究，这类神经元是再生医学中有价值的工具。