Name: 增强的绿色荧光蛋白测定，用于研究原神经元的神经质生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习利用增强型绿色荧光蛋白共转染技术，在大鼠胚胎皮层神经元中研究神经突生长。该方法显著提高转染效率，有助于识别脑损伤和神经退行性疾病中恢复神经元网络的新靶点。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了香港研究资助局、香港健康与医学研究基金、香港中文大学直接资助计划、联合书院捐赠基金以及TUYF慈善信托基金的资助。

所有操作均遵循香港中文大学动物实验伦理委员会的伦理标准。
1. 盖玻片的准备
<ol>
	<li>将一个无菌的18 mm圆形盖玻片放入12孔细胞培养板的每个孔中。</li>
	<li>在湿润的37 °C培养箱中，用5 µg/mL的多聚-D-赖氨酸溶液覆盖盖玻片，孵育至少1小时。</li>
	<li>吸除细胞培养板中的多聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌水将已包被的盖玻片冲洗一次。</li>
</ol>
2. 大鼠胚胎神经元解剖
<ol>
	<li>通过颈椎脱位或 CO2 窒息法处死妊娠 18 天（E18）的 SD 大鼠。 
	注意：请查阅当地关于妊娠大鼠处死的相关规定。</li>
	<li>使用解剖剪打开妊娠大鼠的腹腔，并将子宫转移至一个 10 cm 的培养皿中。</li>
	<li>用小型解剖剪小心地打开子宫和羊膜囊，用小型解剖剪去除大鼠胚胎的胎盘。用一对小型镊子将整个胚胎转移至含有预冷的葡萄糖磷酸盐缓冲液（PBS-葡萄糖，含 10 mM 磷酸钠、2.68 mM 氯化钾、140 mM 氯化钠和 3 g/L 葡萄糖）的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>沿颅骨矢状缝剪开，并用一对小型解剖剪小心地打开颅骨。用小型平头刮匙将胚胎脑组织转移至含有冰冻 PBS-葡萄糖的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用两把 #5 镊子将两个大脑半球与小脑和脑干分离。 
	注意：有关大鼠脑结构，请参见参考文献12。</li>
	<li>使用 #5 镊子去除脑膜。</li>
	<li>用两把直头 #5 镊子从大脑半球中分离出皮层组织。</li>
	<li>将分离出的皮层组织转移至装有冰冻 PBS-葡萄糖的 15 mL 离心管中。</li>
</ol>
3. 原代皮层神经元培养
注意：步骤 3 和步骤 4 中的所有操作均须在 II 级生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>将分离的皮层在4 °C下静置5分钟以重力沉降，并吸除PBS-葡萄糖溶液。</li>
	<li>向分离的皮层中加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，轻轻敲击混匀，并将组织置于37 °C水浴中孵育10 min，以进行酶消化。每隔2 min轻轻敲击离心管以混匀。</li>
	<li>向组织/胰蛋白酶混合物中加入 4 mL 维持培养基（例如，Neurobasal 培养基）。 
	注意： 本方案中使用的所有维持培养基均添加了青霉素-链霉素和B-27添加剂。13.</li>
	<li>使用1 mL移液器通过吹打轻轻解离组织。</li>
	<li>通过200 x g离心力离心收集解离的细胞 g 5 分钟。吸除上清液。</li>
	<li>重复步骤 3.5 至 3.7，共两次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1 mL维持培养基中。</li>
	<li>将10 µL 0.4% 台盼蓝溶液加入10 µL细胞悬液中，用于血细胞计数板计数活细胞。</li>
	<li>以每平方厘米65,000个的密度接种神经元2 （活细胞）以每孔1 mL维持培养基接种于12孔板中。</li>
</ol>
4. 细胞转染与固定
<ol>
	<li>在体外培养第2天（DIV2），使用1 µL转染试剂（例如Lipofectamine 2000），将0.5 µg EGFP质粒（pEGFP-C1）与或不与0.5 µg目的蛋白（POI）一同转染至神经元中。请遵循制造商的操作说明。 
	注意： 哺乳动物表达质粒需使用无内毒素质粒提取试剂盒制备。转染后6小时可进行化学物质/分子处理（本研究中使用细胞松弛素D（Cyto D）和神经生长因子（NGF））。</li>
	<li>转染24小时后吸除培养基，并用37 °C的PBS（10 mM磷酸钠，2.68 mM氯化钾，140 mM氯化钠）洗涤转染细胞一次。</li>
	<li>在室温避光条件下，用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞10分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤固定后的细胞三次。</li>
	<li>在显微镜载玻片上滴加少量荧光封片剂。小心地将12孔板中的盖玻片转移至封片剂上，使样本面朝向载玻片。 
	注意： 若使用水性封片剂，需用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
</ol>
5. 神经突生长的测量
<ol>
	<li>使用落射荧光显微镜时，采用 40 倍物镜进行图像采集。</li>
	<li>每次转染后，至少采集 40 个具有 EGFP 信号的完整神经元的图像。</li>
	<li>在 ImageJ 软件中打开所采集的图像，并使用 NeuronJ 插件11，测量每个成像神经元从胞体到生长锥顶端的最长神经突的长度。</li>
	<li>分析软件获得的数据，以确定靶向蛋白对神经突向外生长的影响。</li>
</ol>

<ol><li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system%3A+Lessons+from+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li>
<li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li>
<li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Chemical+Genomics%22%5BJournal%5D)">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li>
<li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li>
<li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li>
<li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+the+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain%3A+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li>
<li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth%3A+roles+of+microfilaments+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li>
<li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li>
<li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li>
<li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18(2010).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation%2FReoxygenation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li>
<li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).</li>
<li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+advanced+glycation+end+products+%28RAGE%29--soluble+form+%28sRAGE%29+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Investigation%22%5BJournal%5D)">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li>
<li>Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRadbruch%2C+A+%22Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%22">Flow Cytometry and Cell Sorting</a>. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).</li>
<li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li>
<li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899(2013).</li>
<li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+%28hiPSC%29-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li>
</ol>

作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。

如前所述，PC12细胞及其亚克隆被广泛用于研究神经突延伸，因为它们具有优异的转染效率2,3。相比之下，原代神经元的转染率较低，这成为通过转染研究神经突生长调控因子的主要障碍7。在此，我们描述了一种用于定量分析原代神经元中神经突生长的简便方案。尽管总体转染效率较低，但超过80%的已转染神经元成功共转染了两种蛋白：FE65和EGFP（图2A）。因此，通过分析EGFP标记的神经元，可精确确定FE65对神经突生长的影响（图2B）。
所述基于EGFP的方法的另一个优势是可省去免疫荧光染色步骤。在研究神经突延伸时，通常采用神经元特异性III类β-微管蛋白（Tuj 1）的免疫荧光染色作为形态学标志物18</sup...

神经突，包括轴突和树突，是神经元的突起结构，参与神经网络的建立。神经突的动态生长对神经发育至关重要。然而，其背后的调控机制仍不明确。特别是，在多种神经退行性疾病以及脑损伤后，常可观察到神经突的损伤1。因此，研究假定分子在各种神经突生长调控通路中的作用，将有助于加深我们对该过程的理解，还可能揭示多种神经系统疾病的新型治疗靶点。神经元细胞系是研究神经元过程（包括神经突生长）的有价值模型，因其易于操作和转染2,3。然而，已有报道指出，某些常用细胞系会发生遗传漂变，可能导致其生理反应出现差异4。此外，神经元细胞系与原代神经元之间的蛋白质表达存在差异。例如，PC12是一种源自大鼠肾上腺的神经元细胞系，广泛用于神经突生长的研究2,3，但其不表达NMDA受体5。此外，有研究提出，与原代神经元相比，小鼠神经母细胞瘤细胞系neuro-2a对神经毒素的反应性较低，原因在于其缺乏某些膜受体和离子通道的表达6。因此，原代神经元是研究神经突生长更为理想且具代表性的模型。然而，原代神经元的应用受限于其较低的转染效率7。
本文描述了一种将目的蛋白（POI）与EGFP共转染至原代大鼠皮层神经元的方法。EGFP作为形态学标记物，用于鉴定成功转染的神经元，并可用于神经突起的测量。我们通过使用已报道可调节神经突生长的化合物/分子对该方法进行了验证。此外，还利用了已被证明能够促进神经突生长的神经元衔接蛋白FE65来展示该方法的应用8,9。本实验方案包括：（1）从胚胎第18天（E18）的大鼠胚胎中分离原代皮层神经元；（2）将EGFP和目的蛋白（本研究中为FE65）共同转染至神经元；（3）利用图像处理软件ImageJ及其NeuronJ插件对神经元进行成像与分析10,11。

<table><tbody><tr><td>#5 镊子</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 圆形盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>使用前灭菌</td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素 D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>溶于 DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀，10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀，12.5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S 天然小鼠蛋白</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent 通用镊，10 mm，直头</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>请参见参考文献 8 和 15</td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

基于增强型绿色荧光蛋白的原代神经元 neurite 生长研究方法

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

神经突生长是神经系统发育过程中神经回路形成的基本事件。严重的神经突损伤和突触功能障碍发生在多种神经退行性疾病及与年龄相关的退行性病变中。研究调控神经突生长的机制，不仅有助于深入理解脑发育过程，也将为这些神经系统疾病提供重要线索。由于转染效率较低，目前在原代哺乳动物神经元中研究特定蛋白质对神经突生长的影响仍具挑战性。本文介绍一种简单的方法，通过将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与目的蛋白（POI）共转染至原代大鼠皮层神经元，以研究神经突生长。该方法可通过EGFP信号识别成功转染POI的神经元，从而精确评估POI对神经突生长的影响。这种基于EGFP的检测方法为研究调控神经突生长的信号通路提供了一种便捷的途径。

为了验证该方法，我们使用了细胞松弛素D（Cyto D）和神经生长因子（NGF），二者分别被证实可抑制和促进神经突生长14,15,16。将转染了EGFP的神经元经Cyto D或NGF处理后，测量其神经突长度。EGFP转染神经元的效率为2.7%（共计数1,068个神经元）。如图1A所示，Cyto D以剂量依赖的方式抑制神经突延伸。相反，经NGF处理的神经元中神经突生长得到显著增强（图1B）。
接下来，我们通过转染神经元衔接蛋白 FE65 来评估该系统的实用性，已有研究表明 FE65 可促...

在本报告中，我们描述了一种简单的方法，通过将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与目的蛋白共转染，以研究胚胎大鼠皮层神经元的神经突生长。

神经突起生长是神经系统发育过程中神经回路形成的基本事件。严重的神经突起损伤和突触损伤……

转染效率低是确定蛋白质如何在原代神经元中重新激活神经突生长的主要障碍。本方案通过共转染EGFP来识别成功转染的细胞，从而克服这一问题。EGFP与目的蛋白的高共转染率确保了实验的准确性。因此，现在需要进行免疫荧光染色。由于神经突起的生长发生在神经再生过程中，该方法可用于鉴定脑外伤或神经退行性疾病中修复受损神经网络的新靶点。在开始实验前，将无菌的18毫米圆形盖玻片放入12孔组织培养板的每个孔中，并在湿润的37°C培养箱中，用每毫升5微克的多聚-D-赖氨酸溶液对每张盖玻片进行包被，孵育至少1小时。孵育结束后，吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用无菌水冲洗盖玻片。在胚胎发育第18天，将取自定时妊娠的Sprague Dawley大鼠的子宫置于一个10厘米的培养皿中，用小型解剖剪剪开子宫和羊膜囊。用剪刀去除胎盘，并用镊子将整个胚胎转移至另一含有预冷PBS葡萄糖溶液的10厘米培养皿中。使用剪刀沿颅骨的矢状缝剪开，用小型扁平刮匙将胚胎脑转移至一个新的含有新鲜冰冻 PBS 葡萄糖的 10 厘米培养皿中。在解剖显微镜下，使用两把 5 号镊子分离大脑半球与小脑及脑干，并去除脑膜。随后从大脑半球中分离出皮层，并将皮层置于含有新鲜冰冻 PBS 葡萄糖的 15 毫升离心管中。进行原代皮质神经元培养时，在II级生物安全柜中，将皮质组织置于4摄氏度条件下静置5分钟，使其自然沉降，随后用0.05%胰蛋白酶EDTA替换PBS葡萄糖溶液。轻轻敲击混匀，并将组织置于37摄氏度水浴中孵育10分钟，每隔2分钟再次轻轻敲击一次。孵育结束后，加入4毫升维持培养基以终止消化反应，并使用1毫升移液器通过轻柔吹打对组织进行机械解离。通过离心沉淀细胞，并将沉淀物重悬于1毫升维持培养基中进行第二次离心。将第二次离心后形成的沉淀物重悬于1毫升新鲜维持培养基中，计数后以每平方厘米6.5×10⁴个活细胞的浓度，将分离的神经元接种于12孔板中，每孔加入1毫升维持培养基。在37°C、5% CO₂条件下培养两天后，分别在两个1.5毫升离心管中将EGFP和目的蛋白质粒DNA与转染试剂稀释，然后将两者混合。通过将转染混合物加入孔中，对细胞进行EGFP质粒转染。转染24小时后，用37摄氏度的PBS洗涤细胞，并在室温避光条件下用PBS中的4%多聚甲醛固定细胞10分钟。孵育结束后，用新鲜PBS洗涤固定后的细胞，每次洗涤重复三次，每次使用新鲜PBS。每个样本取一张显微镜玻片，每张玻片上加入少量荧光封片介质。然后小心地将带有样本的包被盖玻片转移至封片剂上，使样本面朝向载玻片。为观察神经突生长，选择落射荧光显微镜的40倍物镜，每转染样本至少选取40个完整的EGFP阳性神经元，点击开始采集图像。所有神经突成像完成后，在ImageJ软件中使用NeuronJ插件打开所采集的图像，并测量每个神经元从胞体到生长锥顶端的最长神经突长度。然后使用软件分析所获得的数据，以确定靶向蛋白对神经突生长的影响。细胞松弛素D以剂量依赖性方式抑制神经突延伸，而经神经生长因子处理的神经元中神经突外生得到增强。此外，与未转染的神经元相比，神经元生长衔接蛋白FE65可显著促进神经突外生，刺激作用达两倍。尽管转染效率较低，免疫荧光分析显示，在两天的细胞培养中，超过80%的细胞能够成功共转染EGFP和FE65。转染后6小时可检测到EGFP表达，而FE65在12小时首次被检测到，两种信号在转染后最多可持续检测达七天。使用不同量的FE65质粒DNA转染原代大鼠皮层神经元，结果显示在0至0.5微克FE65质粒范围内，神经突延伸呈现剂量依赖性增加。然而，在转染了0.5微克或1微克质粒的神经元中，未观察到生长方面存在显著差异。在尝试该方案时，重要的是从胚胎脑中分离出适当的区域。该技术也可应用于人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元的神经生长研究，这类神经元是再生医学中有价值的工具。

an-enhanced-green-fluorescence-protein-based-assay-for-studying

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

增强的绿色荧光蛋白测定，用于研究原神经元的神经质生长

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

FRAP 已被用于定量培养细胞中绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白的移动性。我们通过分析光漂白后荧光恢复的百分比，来检测 GFP 的可移动组分与不可移动组分。在本研究中，FRAP...

培养的海马神经元树突棘中荧光标记蛋白的光漂白后荧光恢复（FRAP）

在本视频中，我们介绍了一种基于发光法的检测方法，用于评估促进神经突生长的小分子化合物对人源神经前体细胞（hNPC）分化而来的神经元存活率的神经毒性。该检测通过测定细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平——细胞活力的指标——来评价受试化合物处理后的神经毒性效应。...

基于发光法的检测方法用于评估受试化合物对神经元的神经毒性

在本视频中，我们展示了一种基于EGFP的免疫荧光检测方法，用于评估目的蛋白对原代皮层神经元 neurite 生长的影响。原代神经元被转染了荧光蛋白EGFP和目的蛋白，随后进行免疫检测，以研究目的蛋白对 neurite...

免疫荧光检测法评估靶蛋白对神经突生长的影响

神经可塑性是胃肠道（GI）中日益受到关注但尚不充分理解的特征。在此，以人类胰腺疾病为例，我们介绍了一种 体外...

模拟胰腺神经可塑性：体外双神经元可塑性检测

神经元形态发生和迁移是大脑正常发育过程中的关键事件。本文介绍了在培养的小脑颗粒神经元及发育中的小脑中进行遗传学操作的方法，用于评估神经元的形态特征和迁移特性。...

小脑颗粒神经元的遗传操作 体外 和 体内 研究神经元形态与迁移

我们描述了一种用于培养神经元中突触小泡（SV）循环的光学检测方法。将该方案与双重转染技术结合，可同时表达突触前标记物和目的蛋白，从而定位突触前位点及其突触小泡循环能力，并确定目的蛋白的作用。...

一种用于检测过表达突触前蛋白的培养神经元中突触小泡循环的光学检测方法

本文所述方案介绍了一种用于小分子化合物神经突生长实验及神经毒性评估的方法。...

人神经前体细胞来源神经元的神经突生长检测与神经毒性评估

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

利用转基因荧光小鼠，本文详细描述了在活体动物中评估完整坐骨神经内运动和感觉轴突中信号内体和线粒体的体内轴突运输的实验方案。...

拓展工具包 在体 内 轴突运输成像

学习利用增强型绿色荧光蛋白共转染技术，在大鼠胚胎皮层神经元中研究神经突生长。该方法显著提高转染效率，有助于识别脑损伤和神经退行性疾病中恢复神经元网络的新靶点。

基于增强型绿色荧光蛋白的原代神经元 neurite 生长研究方法

探索更多视频