Name: 色质域新形成研究方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 了解利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在小鼠胚胎干细胞中动态追踪PRC2介导的染色质域形成的方法。该系统可实时暂停分析，为研究基因调控和细胞生物学提供灵活框架。

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感谢 L. Vales、D. Ozata 和 H. Mou 博士对稿件的审阅。D.R. 实验室由霍华德·休斯医学研究所和美国国立卫生研究院（R01CA199652 和 R01NS100897）提供资助。

诱导型EED拯救mESC的生成
1. 细胞培养
<ol>
	<li>使用饲养层细胞无关的C57BL/6小鼠胚胎干细胞（mESCs），该细胞稳定整合了CreERT2转基因，可在给予4-羟基他莫昔芬（4-OHT）后转位至细胞核13。</li>
	<li>将mESCs培养于常规ESC培养基14,15中，培养基中添加1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、1 μM ERK抑制剂PD0325901和3 μM GSK3抑制剂CHIR99021。常规ESC培养基成分为：含15%胎牛血清（FBS）、2 mM&#160;L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素和0.1 mM 2-巯基乙醇的Knockout DMEM。</li>
	<li>使用经0.1%明胶溶液包被的培养板培养mESCs。</li>
</ol>
2. 生成克隆性EED基因敲除（KO）小鼠胚胎干细胞
<ol>
	<li>使用 Benchling 中的 CRISPR 设计工具设计靶向删除 mESC 中 EED 内源性拷贝第 10 外显子和第 11 外显子的向导 RNA（gRNA）16。EED-KO-gRNA-1 靶向位于第 10 外显子上游的内含子，EED-KO-gRNA-2 靶向位于第 11 外显子下游的内含子。同时使用这两种 gRNA 可通过非同源末端连接（NHEJ）机制删除第 10 和第 11 外显子。</li>
	<li>根据 Ran 等人，2013 年的方法将 gRNA 克隆至 pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）载体中17。</li>
	<li>在 6 孔板中，使用转染试剂按照制造商说明，将每种 EED-KO-gRNA-1 和 EED-KO-gRNA-2 各 1 μg 转染至 2 × 105 个 mESC 中（见材料表）。转染后 24 小时更换培养基。</li>
	<li>转染后两天，使用荧光激活细胞分选（FACS）分离 GFP 阳性细胞。预计转染效率约为 10–30%。分选约 5 × 105 个细胞以获得足够数量的 GFP 阳性细胞用于铺板。</li>
	<li>将分离得到的 GFP 阳性 mESC 接种至预先用 0.1% 明胶包被的 15 cm 培养皿中（每皿 10–20 × 103 个细胞），用于挑取克隆。</li>
	<li>在 ESC 培养基中培养细胞约一周，直至可见单个克隆形成。每两天更换一次培养基。</li>
	<li>使用 20 μL 移液枪头挑取不少于 48 个克隆。用枪头刮取克隆的同时将其吸入枪头内。不要将克隆消化为单细胞。将克隆转移至含有 accutase（20 μL）的 96 孔板中。</li>
	<li>将克隆在 37 °C 下孵育 10 分钟，直至所有细胞完全解离。</li>
	<li>使用多通道移液器向每个孔中加入 200 μL ESC 培养基。</li>
	<li>充分混匀后，使用多通道移液器将细胞分别接种至两个独立的 96 孔板中。</li>
	<li>使用其中一个 96 孔板进行基因型鉴定，另一个继续培养直至完成基因型分析。按照制造商说明使用 DNA 提取液从 96 孔板中提取 DNA。</li>
	<li>使用跨越缺失区域的基因型鉴定引物Gnt_EED-KO-up和Gnt_EED-KO_down，并按照制造商说明使用 Taq DNA 聚合酶进行基因型 PCR。 
	注：也可使用其他类型的 DNA 聚合酶进行基因型鉴定，但 Taq DNA 聚合酶具有便利性，因其有色反应缓冲液可使 PCR 产物直接上样进行凝胶电泳。
	<ol>
		<li>在纯合缺失细胞中观察到比野生型（WT）分子量更低的 DNA 条带。 
		注：为获得 PRC2 缺失细胞，必须实现第 10 和第 11 外显子的纯合缺失，以破坏并降解 EED——PRC2 核心复合物的关键亚基13。CRISPR 靶向效率约为 10%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别通过 Sanger 测序和 Western 印迹验证 EED 第 10 和第 11 外显子的缺失以及 EED 蛋白的丢失。</li>
	<li>使用针对 H3K27me2/me3 和 EED 的抗体，通过 ChIP-seq 检测 EED 敲除细胞中染色质上 EED 及 H3K27me2/me3 的耗竭情况。ChIP-seq 实验请参照 Oksuz 等人，2017 年提供的方案15。</li>
</ol>
3. 构建可诱导表达Cre-ERT2的EED基因敲除小鼠胚胎干细胞
<ol>
	<li>使用 Benchling 中的 CRISPR 设计工具16（参见材料表），设计 gRNA（EED-gRNA-可诱导型），以在 EED 基因第 9 外显子后的内含子区域内引入切割位点。</li>
	<li>根据 Ran 等人（2013 年）17 的说明，将 gRNA 克隆至 pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）载体中。</li>
	<li>设计一个供体质粒 DNA，其包含 EED 基因第 9 外显子之后的 cDNA 序列，以及位于 T2A-GFP 序列上游的 C 末端 Flag-HA 标签，所有元件相对于内源基因序列呈反向排列。
	<ol>
		<li>在表达盒两侧添加剪接受体（splice-acceptor）和多聚腺苷酸化信号序列，并将这些元件置于异源反向 loxP 位点（lox66 和 lox71）之间18。</li>
		<li>每端包含至少 500 bp 的同源臂。将供体质粒分为两个 gBlocks 基因片段（见 gBlock-1、gBlock-2-WT &#34;https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" 和 gBlock-2-cage-mutant &#34;https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM&#34;），并按照制造商说明，通过 Gibson 克隆法将其组装至 PCR Blunt 载体中。 
		注：gBlock-2 包含 EED 蛋白“笼状”结构域中的一个芳香族残基（Y365），该残基对 H3K27me3 的结合至关重要12。gBlock-2-WT 包含野生型残基，而 gBlock-2-cage-mutant 包含 EED 的笼状结构域突变体（Y365A），无法结合 H3K27me3。为方便起见，可诱导的野生型 EED 回补记为i-WT-r，可诱导的笼状突变型 EED 回补记为i-MT-r。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 6 孔板中，使用转染试剂将 2 × 105 个 mESC 细胞共转染 1 μg gRNA（EED-gRNA-可诱导型）和 1 μg 供体质粒（i-WT-r 或 i-MT-r），并通过 FACS 分选 GFP 阳性细胞。</li>
	<li>参照步骤 2.3–2.11，分离可用于基因型鉴定的单克隆细胞，以确认成功靶向整合。</li>
	<li>使用跨越插入片段的基因型鉴定引物Inducible_Genotype-FW-1和Inducible_Genotype-REV-1，采用 Taq DNA 聚合酶进行基因型 PCR 鉴定。 
	注：CRISPR 的靶向效率约为 10%。
	<ol>
		<li>使用位于同源臂外侧的引物Inducible_Genotype-FW-2和Inducible_Genotype-REV-2进行 PCR，以确认表达盒的正确整合。 
		注：为实现 EED 的有效回补，必须完成表达盒的纯合整合。需注意，纯合整合的细胞将产生一条较大的 DNA 扩增产物，而野生型 EED 则产生较短的扩增产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 Sanger 测序确认表达盒的整合。</li>
	<li>通过 Western blot 检测在给予 4-OHT 后，表达盒是否发生翻转，以及 EED 和其他 PRC2 核心组分（如 EZH2 和 SUZ12）是否表达。</li>
	<li>通过流式细胞术检测 T2A-GFP 的表达情况及翻转效率。需注意，GFP 的表达表明表达盒已完成翻转且 EED 已表达。</li>
</ol>
4. 染色质上 PRC2 活性成核及扩散的后续过程
<ol>
	<li>通过流式细胞术确认i-WT-r和i-MT-r mESCs不存在GFP渗漏表达。若存在GFP渗漏表达，则在开始实验前通过FACS分离GFP阴性细胞。</li>
	<li>将i-WT-r和i-MT-r mESCs扩增至五块15 cm培养皿（每皿约5×10⁶个细胞）6 每孔细胞数。</li>
	<li>通过添加0.5 μM 4-OHT诱导表达野生型（WT）或笼状突变型EED，处理时间为0 h、12 h、24 h、36 h和8天（每种条件使用一个15 cm培养皿）。对于超过12 h的处理，在12 h后更换培养基。利用GFP通过流式细胞分选（FACS）分离成功发生重组的细胞。调整各处理组的处理时间，使所有条件在同一时间点收集样本。</li>
	<li>对 H3K27me2 和 H3K27me3 进行 ChIP-seq，以研究其在重新表达野生型或笼状突变型 EED 后向染色质的时序性沉积。采用包含文库构建的 ChIP-seq 方案，具体步骤详见 Oksuz et al., 201715.</li>
	<li>在每个样本中使用外源性对照，以实现不同时间点之间的定量比较19.
	<ol>
		<li>作为内参对照，使用染色质来自 果蝇 黑腹果蝇 （以与mESC来源的染色质1:50的比例）以及 果蝇 每份样品中加入特异性H2Av抗体（根据制造商说明，每4 μg黑腹果蝇染色质加入1 μL H2Av抗体）。</li>
		<li>制备染色质 果蝇 以类似于Oksuz等人2017年详细描述的从小鼠胚胎干细胞（mESCs）中分离的方法15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Bowtie 2 将 ChIP-seq 的测序读段比对至 mm10 基因组，参数采用默认设置20.</li>
	<li>将小鼠 ChIP-seq 读段数据归一化至外源添加的参照序列 果蝇 读段数21. 使用以下公式计算加标内参归一化因子：1 × 106/unique 果蝇 读数计数。预期获得约 1 x 106 果蝇 读数计数和 20 x 106 每次实验的小鼠读段数
	<ol>
		<li>不包括 黑腹果蝇 测序输入样本时的染色质</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 基因组覆盖度 使用 bedtools 中的工具将 bam 文件转换为 bedgraph22接下来，使用 bedgraph 文件转换为 bigwig 文件 bedGraphToBigWig 美国加州大学圣克鲁兹分校（USCS）的工具23,24请参见以下脚本： 
	基因型=&#34;mm10基因组路径&#34; 
	chr=&#34;mm10 染色体大小路径&#34; 
	inp_bam=&#34;输入 BAM 文件的路径 &#34; 
	倍增=&#34;计算加标内参归一化因子&#34; 
	bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen &#62; output.bedGraph 
	sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph &#62; output_sorted.bedGraph 
	bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw</li>
	<li>通过将 bigwig 文件上传至 UCSC 基因组浏览器来可视化 ChIP-seq 读段密度24.</li>
</ol>
5. 监测mESCs细胞核中H3K27me3焦点的出现与生长
<ol>
	<li>将 1×104 个 mESC 接种至预先用 0.1% 明胶包被的 8 孔腔室载玻片中。</li>
	<li>次日，开始连续加入 4-OHT（0.5 μM）进行诱导，以收集在指定时间点（0 h、12 h、24 h 和 36 h）表达 EED 的细胞。对于超过 12 h 的处理，在 12 h 后更换培养基。</li>
	<li>用含 4% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）在室温（RT）下固定 mESC 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS/0.25% Triton X-100 在室温下透化细胞 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS/5% 驴血清/0.1% Triton X-100（封闭缓冲液）在室温下封闭细胞 30 分钟。</li>
	<li>用封闭缓冲液将 H3K27me3 一抗按 1:500 稀释，并加入细胞中。</li>
	<li>在 4 °C 下与一抗孵育过夜。</li>
	<li>次日，用 PBS/0.1% Triton X-100 洗涤 3 次。</li>
	<li>用封闭缓冲液将二抗（Alexa Fluor 595）按 1:1000 稀释，并加入细胞中。
	<ol>
		<li>由于 Alexa Fluor 标记的二抗对光敏感，后续所有孵育步骤均需避光进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下孵育二抗 2 小时。</li>
	<li>用 PBS/0.1% Triton X-100 洗涤 3 次。</li>
	<li>用 PBS/0.1% Triton X-100 将 DAPI（1 mg/mL）按 1:4000 稀释，并加入细胞中。</li>
	<li>在室温下用 DAPI 孵育细胞 10 分钟。</li>
	<li>用 Aqua Mount 封片。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜在 63 倍放大下对细胞成像。</li>
	<li>使用 ImageJ 的 Fiji 分发版25对图像进行处理并伪彩着色。&#160;</li>
</ol>

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</ol>

D.R. 是 Constellation Pharmaceuticals 和 Fulcrum Therapeutics 的联合创始人。作者声明不存在利益冲突。

要深入理解特定染色质结构域形成过程中的分子机制，一种有效的方法是首先破坏该结构域，随后在细胞内追踪其重建的动态过程。在重建过程中，可随时暂停该过程，以详细分析正在进行的分子事件。以往关于染色质结构域的研究无法解析此类动态事件，因其通常在稳态条件下进行（例如，比较野生型与基因敲除型）。本文介绍了一种用于评估染色质结构域动态形成过程的系统，重点揭示了细胞内由PRC2介导的抑制性结构域的招募及其扩散过程。
对于该诱导系统而言，最关键的步骤是精确设计DNA构建体，以便在目标蛋白（或RNA）从细胞中被删除后重新表达。可根据下游应用，在这些构建体中引入各种突变、标签和荧光标记。例如，为了监测活细胞中染色质结构域形成的初始事件，可不使用位于GFP之前、用于将其与目标蛋白分离的自剪切T2A肽，而是构建多种荧光融合蛋白，用于高分辨率成像和/或单颗粒示踪实验。
尽管该方法可以通过多种方式进行修改以研究染色质结构域的形成过程，但仍存在一些局限性。首先，该方法需要一种携带 Cre-ERT2 基因的细胞系。其次，必须进行优化以确定 4-OHT 处理后的...

真核生物基因组具有高度有序的结构，染色质可及性的变化直接调控基因转录1。基因组包含不同类型的染色质结构域，这些结构域与转录活性和复制时序相关2,3。这些染色质结构域的大小从几千碱基对（kb）到超过100 kb不等，其特征是富集特定的组蛋白修饰4。核心科学问题在于：这些结构域是如何形成的？它们又是如何被维持和传递的？
在众多已被深入研究的染色质结构域中，多梳抑制复合物2（Polycomb repressive complex 2, PRC2）在其中发挥关键作用。PRC2是一种多亚基复合物，由多梳蛋白家族（Polycomb Group, PcG）中的一组蛋白质组成5,6，可催化组蛋白H3第27位赖氨酸的单、双和三甲基化修饰（H3K27me1/me2/me3）7,8,9,10。H3K27me2和H3K27me3与抑制性染色质状态相关，而H3K27me1的功能尚不明确6,11。PRC2的核心组分之一——胚胎外胚层发育蛋白（embryonic ectoderm development, EED）——可通过其芳香笼结构域特异性结合PRC2催化的终产物H3K27me3，从而引起PRC2的变构激活12,13。PRC2的酶活性在发育过程中维持细胞身份至关重要，因为若本不应在特定谱系中表达的发育相关基因发生异常表达，将对细胞命运产生不利影响5,6。因此，阐明PRC2在哺乳动物中促进抑制性染色质结构域形成的分子机制，对于理解细胞身份的建立与维持具有根本性的重要意义。
以往所有用于研究染色质结构域形成的实验系统，包括由PRC2介导的染色质结构域，均在稳态条件下进行，无法追踪细胞中染色质结构域形成的动态过程。本文介绍了一种详细的实验方案，用于构建可诱导的细胞系统，以监测染色质结构域的初始招募及其扩展过程。具体而言，我们聚焦于追踪由H3K27me2/3组成的PRC2介导的抑制性染色质结构域的形成。该系统能够捕捉染色质结构域形成的分子机制细节，并可进一步拓展用于研究其他类型的染色质结构域，例如广泛研究的含有H2AK119ub或H3K9me的结构域。结合基因组学与成像技术，该方法有望成功解答染色质生物学中的多个关键科学问题。

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-羟基他莫昔芬（5 mg）</td><td>Sigma</td><td>H7904-5MG</td><td>用于诱导 EED 表达</td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液（10×10 ml）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>用于免疫荧光</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>2% 明胶溶液</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ml</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Innovative Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>用于免疫荧光</td></tr><tr><td>Aqua-Mount 封片介质</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>用于免疫荧光</td></tr><tr><td>CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>用于免疫荧光</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）- 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>用于免疫荧光</td></tr><tr><td>ERK 抑制剂 PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>ESGRO 重组小鼠 LIF 蛋白</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>干细胞级 FBS</td><td>Atlanta</td><td>S10250</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>Gibson 组装主混合液</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>用于供体质粒克隆</td></tr><tr><td>GSK3 抑制剂 CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9728S</td><td>ChIP-seq 用抗体</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Cell Signaling</td><td>9733S</td><td>ChIP-seq 用抗体</td></tr><tr><td>组蛋白 H2Av 抗体（多克隆抗体）</td><td>Active motif</td><td>39715</td><td>ChIP-seq 内参对照</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA 聚合酶</td><td>Bioline</td><td>BIO-21079</td><td>用于基因分型 PCR</td></tr><tr><td>正常驴血清（10 mL）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>用于免疫荧光</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma/Roche</td><td>P0781</td><td>用于小鼠胚胎干细胞（mESCs）培养</td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>用于 gRNA 克隆</td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 提取溶液</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>用于基因分型 PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt PCR 克隆试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>用于供体质粒克隆</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;引物/gBlocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>序列：ctctggctactgtcaactag。gRNA 配对用于在 C57BL/6 ESCs 中敲除 EED，以构建 i-WT-r 和 i-MT-r 系统。</td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>序列：TAGGCTATGACGCAGCTCAG。gRNA 配对用于在 C57BL/6 ESCs 中敲除 EED，以构建 i-WT-r 和 i-MT-r 系统。</td></tr><tr><td>EED-gRNA-inducible</td><td></td><td></td><td>序列：atggcaccccgaaattagaa。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-WT-r 系统。</td></tr><tr><td>i-WT-r 供体质粒</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-WT-r 系统。</td></tr><tr><td>EED-gRNA-inducible</td><td></td><td></td><td>序列：atggcaccccgaaattagaa。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-WT-r 系统。</td></tr><tr><td>i-MT-r 供体质粒</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM。gRNA 和供体质粒用于在 EED-KO 背景下构建 i-MT-r 系统。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;基因分型引物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>序列：ctgtaggctgccatctgtga。野生型等位基因将产生 1.9 kb 的扩增产物，敲除等位基因将产生 200 bp 的扩增产物。</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>序列：agccagggctacacagagaa。野生型等位基因将产生 1.9 kb 的扩增产物，敲除等位基因将产生 200 bp 的扩增产物。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>序列：tgcagtgaaacaaatttggaa。当插入表达盒后，引物将扩增出 1863 bp 产物；野生型等位基因将扩增出约 200 bp 的产物。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>序列：gagaggggtggcactgtaaa。当插入表达盒后，引物将扩增出 1863 bp 产物；野生型等位基因将扩增出约 200 bp 的产物。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>序列：ccccctctttctccttttct。当插入表达盒后，引物将扩增出 3200 bp 产物；野生型等位基因将扩增出 1560 bp 的产物。</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>序列：atgcctgggtgaatgaaaaa。当插入表达盒后，引物将扩增出 3200 bp 产物；野生型等位基因将扩增出 1560 bp 的产物。</td></tr></tbody></table>

一种研究方法 从头合成 染色质结构域的形成

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

染色质结构域的组织与结构在不同细胞谱系中具有独特性。其异常调控可能导致细胞身份的丧失和/或疾病的发生。尽管已付出巨大努力，但目前对染色质结构域形成及其传播机制的理解仍然有限。以往对染色质结构域的研究多在稳态条件下进行，难以追踪其建立初期的动态事件。本文介绍一种可诱导重建染色质结构域的方法，并可随时间进程追踪其重新形成的过程。该方法最初应用于PRC2介导的抑制性染色质结构域形成的案例，但也可轻松拓展至其他类型的染色质结构域。将本方法与基因组学或成像技术进行修饰或联合使用，将为深入研究染色质结构域的建立过程提供极为宝贵的工具。我们相信，该方法将彻底革新我们对染色质结构域如何形成及其相互作用机制的理解。

条件性拯救系统的通用示意图 
图1展示了在内源性EED基因座表达野生型（WT）或笼状突变型（Y365A）EED以条件性拯救EED基因敲除（KO）细胞的靶向策略。在敲除EED（PRC2的一个核心亚基，对维持其稳定性和酶活性至关重要）后，将一个位于EED基因第9个外显子下游内含子区域的表达盒插入基因组（图1）。该表达盒包含EED基因剩余的3' cDNA序列，其方向与内源性基因序列相反。表达盒两侧为异源反向loxP位点（lox66和lox71）18。细胞持续培养直至H3K27me2/3完全消失。通过添加4-羟基他莫昔芬（4-OHT）激活Cre重组酶的表达后，该表达盒发生倒位，使得第9个外显子通过剪接受体序列与表达盒发生剪接（图1）。利用该系统，EED基因敲除细胞可被表达C端Flag-HA标签的野生型或笼状突变型EED所拯救。其下游的T2A-GFP元件可作为标记，用于筛选成功发生倒...

该方法旨在追踪细胞系中由PRC2介导的染色质结构域的形成过程，并且可适用于许多其他系统。

染色质结构域的组织和结构具有细胞谱系特异性。其调控异常可能导致细胞身份的丧失……

我们概述了一种用于评估染色质结构域动态形成的系统。该系统可用于追踪细胞中由PRC2介导的染色质结构域的招募与扩散过程。此过程可在任意时间暂停，以便分析正在进行中的事件。该系统可用于监测任何特定细胞过程中的动态变化，因此不仅限于追踪染色质结构域的形成。首先使用CRISPR设计工具设计向导RNA，以在小鼠胚胎干细胞中对胚胎外胚层发育基因（EED）的内源性拷贝的第10和第11个外显子进行删除。然后根据论文中的说明将向导RNA克隆至CRISPR/Cas9质粒中。在六孔板中，使用转染试剂按照制造商说明书，将200,000个鼠胚胎干细胞（mESCs）与1微克每种向导RNA共转染。转染后24小时更换培养基。转染两天后，通过FACS分离GFP阳性细胞。转染效率范围约为10%至30%，因此需分选约500,000个细胞，以获得足够数量的GFP阳性细胞用于铺板。将分离得到的GFP阳性细胞接种至预先用0.1%明胶包被的15厘米培养皿中，用于挑取克隆。在ESC培养基中培养细胞约一周，直至可见单个克隆形成，并确保每两天更换一次培养基。使用20微升移液枪头吸取菌落，通过在菌落表面刮取的方式至少挑取48个菌落。在不将菌落分散为单细胞的前提下，将其转移至含有Accutase的96孔板中。于37摄氏度孵育菌落10分钟，以解离细胞。然后使用多通道移液器向每个孔中加入 200 µL ESC 培养基。充分混匀，并将细胞接种至两个独立的 96 孔板中。其中一个 96 孔板用于基因分型，另一个继续培养直至完成基因分型。使用商业试剂并按照制造商说明从培养板中提取DNA。采用跨越缺失位点的基因分型引物，利用Taq DNA聚合酶进行基因分型PCR。在纯合缺失细胞中，相对于野生型细胞，可观察到分子量较低的DNA扩增产物。使用CRISPR设计工具设计引导RNA，以在EED基因第9外显子后的内含子中引入切割位点，并根据文献说明将其克隆至CRISPR/Cas9质粒中。设计供体模板DNA，该模板包含第9外显子之后的EED cDNA序列，以及位于T2A-GFP序列上游的C端Flag-HA标签，整个序列相对于内源基因序列呈反向排列。在表达盒两侧分别添加剪接受体序列和多聚腺苷酸化序列，并将其置于异源反向排列的loxP位点之间，同时在两端各包含至少500个碱基对的同源臂。将供体质粒分成两段gBlocks基因片段，按照生产商说明书，使用Gibson克隆法将其连接至PCR Blunt载体中。在六孔板中，用一微克向导RNA和一微克供体质粒共转染200,000个mESC。随后通过FACS分选GFP阳性细胞。根据手稿说明分离单克隆用于基因分型。使用流式细胞术确认小鼠胚胎干细胞（mESCs）无绿色荧光蛋白（GFP）渗漏表达；若存在渗漏，则在实验开始前通过荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP阴性细胞。将细胞扩增至五块15厘米培养皿中，并通过添加5 µM 4-羟基他莫昔芬诱导野生型或笼状突变型EED的表达，诱导时间分别为0小时至8天的五个不同时间段。对于持续时间超过12小时的处理，需在12小时后更换培养基。通过GFP荧光信号利用FACS分离成功发生重组的细胞，并对H3K27me2和H3K27me3进行ChIP-seq分析，以研究其在野生型或笼状突变型EED重新表达后向染色质的时序性沉积。为验证可诱导的野生型挽救和可诱导的突变型挽救系统，在使用4-羟基他莫昔芬处理诱导野生型或笼状突变型EED表达后，对全细胞提取物进行蛋白质印迹（western blot）分析。采用流式细胞术分析在4-羟基他莫昔芬处理前后i-WT-r细胞中T2A-GFP表达效率，以确认反转录盒成功翻转。在重新表达野生型或笼状突变型EED后，进行H3K27me3的ChIP-seq分析。在野生型EED表达后12小时，H3K27me3在离散的成核位点出现，随后在24小时时出现在距离初始成核位点较远的区域。ChIP-seq 还被用于追踪 H3K27me2 的时序性沉积，其出现早于 H3K27me3 的沉积。H3K27me3 焦点及其扩展也通过荧光显微镜得以可视化。在野生型 EED 表达 12 小时后，已可观察到 H3K27me3 焦点形成的证据。这些焦点在24小时时数量和大小增加，并最终在36小时时扩散至细胞核的广大区域。DNA载体的精确设计对于构建理想的可诱导挽救系统至关重要。该方法可在小鼠中实现对蛋白质突变的时间特异性和空间特异性调控。通过这种方法，可以确定突变在特定组织或发育特定阶段的影响。目前我们正在利用该系统监测另一种染色质结构域——多梳抑制复合物1的动态建立过程。

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科研

JoVE Journal

Genetics

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一种研究方法从头合成染色质结构域的形成

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