色质域新形成研究方法

我们概述了一个系统，以评估染色质域的动态形成。我们利用这个系统跟踪在细胞中招募和传播 PRC2 中分染色质域。可随时暂停该过程以分析当前事件。

该系统可以用于监控任何给定细胞过程的动态变化，因此不限于跟踪染色质域的形成。首先设计指南RNA，使用CRISPR设计工具删除小鼠胚胎干细胞中的胚胎外生胚芽发育（EED）的外生拷贝10和11。根据手稿指示将指南 RNA 克隆到 CRISPR/Cas9 质粒中。

在六井板格式中，根据制造商的说明，转染20万只小鼠胚胎干细胞（或mESCs）与每个引导RNA的1微克使用转染试剂。转染后 24 小时更换介质。转染两天后，使用FACS分离GFP阳性细胞。

转染效率范围从10%到30%不等，因此对大约50万个细胞进行排序，以捕获足够的GFP阳性细胞进行电镀。将分离的 GFP 阳性细胞板板镀入 15 厘米的板中，这些板预涂有 0.1% 的明胶，用于聚落采摘。在ESC介质中生长细胞约一周，直到单个菌落可见，确保每两天更换一次介质。

使用 20 微升移液器尖端在吸气时刮过菌落，至少选择 48 个菌落。在不将菌落分解成单细胞的情况下，将其转移到含有高分酶的96井板中。在37摄氏度下孵育菌点10分钟，分离细胞。

然后通过多通道移液器将 200 微升 ESC 介质添加到每井中。混合好，将电池板分成两个独立的96孔板。使用其中一个板进行基因分型，并保持另一个生长，直到基因分型结束。

使用商业试剂和制造商的指示从板中提取脱氧核糖核酸。使用跨越删除站点的基因分型底转，使用 Taq DNA 聚合酶执行基因分型 PCR。观察与野生型细胞相对同源缺失的细胞中分子量较低的DNA产品。

设计指南RNA使用CRISPR设计工具在EED的外向9之后引入内继的切口，并按照手稿指示克隆到CRISPR/Cas9质粒中。设计一个供体模板DNA，包括 exon 9 之后的 EED cDNA 序列和 T2A-GFP 序列上游的 C-终端标志-HA 标记，所有参数均与内源基因序列相反。用拼接接受器和聚亚二聚亚化序列在异质倒置 loxP 位点之间，从两端至少包含 500 个同源臂碱基对。

将捐赠者模板拆分为 gBlocks 基因片段的两部分，然后按照制造商的指示使用吉布森克隆将它们组装成 PCR Blunt 载体。在六井板格式中，具有一微克的引导RNA和一微克的供体模板，可转染20万个MC。然后使用 FACS 分离 GFP 阳性细胞。

根据手稿方向分离用于基因分型的单个菌落。使用流细胞学确认mESC没有GP的泄漏表达，如果它们有，在开始实验之前通过FACS分离GFA阴性细胞。将细胞扩大为5个15厘米的板块，通过施用5微摩尔4-羟基-莫西芬，在5个不同的时间持续时间内从零小时到8天来诱导野生型或笼状突变EED的表达。

12 小时后更换介质，进行持续时间超过该时间的治疗。使用GFP分离FACS成功重组的细胞，对H3K27me2和H3K27me3执行ChIP-seq，以调查其与染色质的沉积，以响应野生型或笼状突变EED的重新表达。为了验证可诱导野生型救援和诱导突变体救援系统，在诱导野生型或笼状突变EED后，对整体提取物进行了4-羟基-莫西芬治疗。

利用流细胞学分析确认4-WT-r细胞T2A-GFP表达在4-羟基-莫西芬治疗后的效率，证明倒置盒的成功翻转。H3K27me3的ChIP-seq是在野生型或笼状突变EED的重新表达后进行的。H3K27me3的出现是在离散核位野生型EED表达后12小时观察到的，然后在远离初始成核点的区域24小时观察到的。

ChIP-seq还用于跟踪H3K27me2的时态沉积，该沉积似乎先于H3K27me3沉积。H3K27me3 foci 及其生长也通过荧光显微镜进行可视化。经过12小时的野生型EED表达，有H3K27me3 foci形成的证据。

这些物质的数量和大小增加了24小时，最终扩散到核的大区域36小时。DNA构造的精确设计对于生成所需的可致性救援系统具有十分重要的作用。该方法可对小鼠蛋白质突变进行时间和特殊控制。

这样，就可以确定突变在特定组织中或特定发育阶段的影响。我们目前使用这个系统来监控另一个染色质域，Polycomb压制复合物1的动态建立。