Name: 人类S100A12及其用于免疫细胞刺激的Ion诱导寡聚物的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习人类钙结合蛋白S100A12及其离子诱导寡聚物的纯化方法，用于免疫学研究。该技术可获得高产量、高纯度且无内毒素的蛋白质，适用于单核细胞刺激实验和下游功能分析。

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本研究获得了明斯特大学医学院院内创新医学研究项目（Muenster University medical faculty intramural innovative medical research program，项目编号 KE121201，授予 C.K.）和德国研究基金会（DFG，项目编号 Fo354/3-1，授予 D.F.）的资助。

注意：缓冲液和储备溶液的配制请参见补充表1。
1. 蛋白质表达在 E. coli
<ol>
	<li>克隆
	<ol>
		<li>将无标签的人源 S100A12（NCBI 参考序列：NP_005612.1）克隆至原核表达载体 pET11b 中。将构建好的质粒转化至大肠杆菌 E. coli BL21(DE3) 中以进行蛋白表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养
	<ol>
		<li>取单菌落接种于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 5 mL 生长培养基（LB 液体培养基）中，置于 14 mL 圆底试管中，37 °C、220 rpm 振荡培养过夜。将 2−4 mL 过夜培养物转接至 2 L 锥形瓶中的 400 mL 生长培养基中，37 °C、220 rpm 振荡培养。 
		注意：主培养物的初始密度应为 600 nm 处光密度（OD600）= 0.1。</li>
		<li>在培养过程中监测 OD600。当 OD600 达到 0.5−0.6 时，加入 1 M 异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 1 mM，以诱导蛋白表达。继续在 37 °C、220 rpm 条件下培养 4 小时。 
		注意：通常在 37 °C 培养 1.5−2.5 小时后可达到 OD600 = 0.6。</li>
		<li>配制 50 mL 超声破碎缓冲液：将 50 mM Tris、50 mM NaCl 和 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶于 40 mL 去离子水中，用 HCl 调节 pH 至 8.0，定容至 50 mL。加入蛋白酶抑制剂（每 50 mL 溶液加 1 片），并将缓冲液预冷至 4 °C。</li>
		<li>将细菌培养物转移至合适的离心管中，在 4 °C 条件下以 3,200 x g 离心 30 分钟收集菌体。弃去上清，将沉淀用 25 mL 冰冷的超声破碎缓冲液重悬。此后所有操作均需将样品置于冰上。 
		注意：重悬的菌体可短期保存于 -20 °C，长期保存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声破碎/裂解
	<ol>
		<li>在冰上对菌液进行超声处理，共 6 个循环，每个循环 30 秒。每次超声后将样品静置 30−60 秒，以防止样品过热。</li>
		<li>将菌体悬液转移至预冷的 50 mL 高速离心管中，于 4 °C 以 15,000 x g 在固定角转子中离心 30 分钟。将含有可溶性胞质蛋白的澄清裂解液小心倾入新的 50 mL 管中，弃去沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质纯化
<ol>
	<li>阴离子交换色谱
	<ol>
		<li>透析
		<ol>
			<li>通过将20 mM Tris、1 mM EDTA和1 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）溶解于去离子水中，并用HCl调节pH至8.5，配制阴离子交换色谱（AIEX）缓冲液A。用于透析时准备2 × 5 L，用于色谱时准备2 × 1 L的AIEX缓冲液A。 
			注意：透析液体积应约为样品体积的100倍。所有用于色谱的缓冲液均需过滤（0.45 µm或更小孔径）并脱气（例如通过超声浴或真空脱气）。</li>
			<li>将透析袋（分子量截留值[MWCO]：3.5 kDa）剪成适当长度，并预留额外空间以容纳空气，确保样品在旋转搅拌子上方保持浮起。 
			注意：甘油可保护透析膜，但在使用前必须去除。</li>
			<li>为降低步骤1.3.2中澄清蛋白溶液的黏度，用25 mL AIEX缓冲液A稀释该溶液，以便后续上样至色谱柱。将第一个封口夹固定在透析袋一端，将样品装入膜内，并在距透析袋顶端至少1&#160;cm处安装第二个封口夹。</li>
			<li>将装有AIEX缓冲液A的5 L容器置于搅拌台上，加入搅拌子及装有蛋白溶液的透析膜。调节转速使样品旋转，同时避免与旋转的搅拌子发生碰撞。在4 °C下透析12–24小时，然后更换为新鲜预冷的AIEX缓冲液A，并继续透析至少4小时以上。将透析后的蛋白溶液转移至50 mL离心管中，并通过0.45 µm滤器过滤。 
			注意：可进行储存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>色谱</li>
		<li>启动液相色谱系统（FPLC），进行常规维护，连接AIEX缓冲液A和AIEX缓冲液B（含1 M NaCl的AIEX缓冲液A）以及装有阴离子交换树脂的色谱柱。色谱通用参数详见表1。 
		注意：缓冲液、色谱柱和FPLC设备应在运行前平衡至相同温度（参见表1、表2、表3、表4和表5中的色谱参数）。</li>
		<li>用AIEX缓冲液A平衡色谱柱，随后将样品上样至柱上，并采用从0%到100%高盐缓冲液（AIEX B）的线性梯度洗脱蛋白。详细方法流程参见表2。</li>
		<li>在洗脱过程中收集每管2 mL的组分，并取每管10 µL进行考马斯亮蓝染色的15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺&#160;凝胶&#160;电泳（SDS-PAGE）分析。合并含有S100A12蛋白的组分用于后续透析。 
		注意：S100A12的分子量为10,575 Da。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钙依赖性疏水相互作用色谱（HIC）
	<ol>
		<li>透析
		<ol>
			<li>按照第2.1.1节所述方法，将蛋白溶液对20 mM Tris、140 mM NaCl、pH 7.5的缓冲液进行透析。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>色谱
		<ol>
			<li>通过将20 mM Tris、140 mM NaCl和25 mM CaCl2溶解于去离子水中，配制1 L HIC缓冲液A，并调节pH至7.5。对于HIC缓冲液B，溶解20 mM Tris、140 mM NaCl和50 mM EDTA，调节pH至7.0，并对两种缓冲液进行过滤和脱气处理。向样品中加入CaCl2至终浓度为25 mM，并通过0.45 µm滤器过滤。将HIC缓冲液和样品平衡至4 °C（柱温）。</li>
			<li>启动液相色谱系统并进行常规维护，连接HIC缓冲液A和B以及色谱柱。其他色谱参数详见表3。</li>
			<li>平衡色谱柱后上样，并延长“洗涤未结合样品”阶段，直至紫外信号恢复至基线水平，然后使用含钙螯合剂的缓冲液（EDTA）开始洗脱。详细方法流程参见表4。 
			注意：既往实验表明，过量钙离子似乎有利于S100A12与色谱树脂的结合。</li>
			<li>收集2 mL的峰组分，并取每管10 µL进行考马斯亮蓝染色的15% SDS-PAGE分析。合并纯化的S100A12组分，并按照第2.1.1节所述方法对HEPES缓冲盐水（HBS；20 mM HEPES、140 mM NaCl、pH 7.0）进行透析。 
			注意：单体S100A12的消光系数为2980 M-1 cm-1。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 内毒素的检测与去除
<ol>
	<li>内毒素检测
	<ol>
		<li>为确定内毒素污染情况，使用基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的荧光内毒素检测试剂盒（材料表），检测步骤 2.2.2.4 中稀释后的蛋白浓度（例如，用 HBS 稀释 1:10 和 1:100）。按照试剂盒制造商提供的操作说明进行该检测。 
		注意：应使用超纯去离子水新鲜配制 HBS 溶液，以避免缓冲液引入（新的）内毒素污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除内毒素并浓缩蛋白
	<ol>
		<li>将 15 mL 样品加入 50 kDa 离心过滤装置中，在 3,200 × g、10 °C 条件下离心约 10 分钟。将滤过液转移至新的容器中（置于冰上），并根据需要多次重复加样和离心 50 kDa 滤管。每次操作后，用 HBS 清洗滤膜两次，以尽可能回收蛋白。</li>
		<li>使用 3 kDa 离心过滤装置浓缩含 S100A12 的滤过液，直至体积减少至初始上样体积的五分之一至十分之一（在 3,200 × g、10 °C 条件下离心约 30 分钟）。根据需要多次重复加样，每次加样后冲洗滤膜，并将浓缩液转移至新管中。弃去滤过液。再按照上述方法通过 50 kDa 滤膜过滤一次。 
		注意：此过程中蛋白损失较显著（可达 50%），但最终获得的蛋白样品中脂多糖（LPS）已完全去除。该方法从 400 mL 培养液中可获得约 10−15 mg 蛋白。</li>
		<li>用无内毒素的 HBS 将蛋白溶液调节至 1 mg/mL，并按照步骤 3.1.1 所述方法测定 LPS 含量。若蛋白溶液仍未达到无 LPS 标准（&#60;0.1 EU/mL），则使用内毒素去除树脂清除残留污染。 
		注意：当蛋白浓度为 1 mg/mL 时，0.1 EU/mL 的 LPS 污染相当于约 0.01 pg LPS/µg 蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 化学交联与寡聚体分离
<ol>
	<li>化学交联
	<ol>
		<li>使用超纯去离子水配制高纯度（无内毒素）的 1 M CaCl2 和 100 mM ZnCl2 储存液（材料表）。在下一步中使用新鲜配制的该缓冲液。</li>
		<li>将 10 mL 纯化的无内毒素 S100A12（浓度为 1 mg/mL，溶于 HBS 中）在室温（RT）下孵育 30 分钟，分别加入 25 mM CaCl2 以形成二聚体/四聚体，或加入 25 mM CaCl2 和 1 mM ZnCl2 以形成六聚体/四聚体 S100A12 寡聚物。</li>
		<li>在使用前立即用 500 µL 无内毒素水溶解 8 mg BS3 制备交联剂（每 10 mL 加离子蛋白溶液使用 8 mg 交联剂，终浓度为 1.4 mM）。通过移液混合交联剂与样品，并在室温下继续孵育 30 分钟。加入 1 M Tris-HCl（pH 7.5）至终浓度 50 mM 以终止反应，随后经 0.45 µm 滤膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尺寸排阻色谱
	<ol>
		<li>将交联后的样品平衡至 12−15 °C（柱温），启动液相色谱系统并进行常规维护。连接柱缓冲液（HBS）和尺寸排阻色谱柱。详细信息参见 表 5。</li>
		<li>用 HBS 平衡色谱柱，上样并收集洗脱峰组分（1−2 mL）。在 4−20% 梯度 SDS-PAGE 上分析这些组分，并合并含有目标蛋白复合物主要条带的组分。 
		注意：BS3 等 NHS 酯试剂在水溶液中会发生水解，导致在 280 nm 处产生强吸收。未结合的交联剂（分子量：572 g/mol）在运行末期洗脱，形成明显的吸收峰。</li>
		<li>使用截留分子量为 10 kDa（二聚体）、30 kDa（四聚体）或 50 kDa（六聚体）的离心过滤装置浓缩溶液。按照第 3.1 节所述方法测定内毒素污染水平。如有必要，根据生产商推荐的方法使用内毒素去除树脂去除残留脂多糖（LPS）（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 单核细胞的功能检测
<ol>
	<li>单核细胞的制备
	<ol>
		<li>通过密度梯度离心法，随后使用磁珠分离试剂盒（材料表）对人血沉棕黄层中的单核细胞进行分离和富集。 
		注意：本方案每份血沉棕黄层可获得约 5−7 × 107 个单核细胞，纯度为 83−95%。由于细胞数量及其反应性高度依赖于供体，可能需要扩大实验规模（根据所需细胞数量而定）。</li>
		<li>进行密度离心时，将分离液（密度 = 1.077 g/mL）平衡至室温，并将 20 mL 转移至 50 mL 离心管中（每份血沉棕黄层使用 2 支管）。用 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）稀释人血沉棕黄层中的血液至总体积 60 mL，然后小心地将 30 mL 该混合液叠加于分离液上层。在室温下以 550 × g 离心 35 分钟。关闭离心机刹车。</li>
		<li>离心后，单个核外周血细胞（PBMCs）位于分离液上层。将这些细胞转移至新的 50 mL 离心管中，用 HBSS 补充至 50 mL，然后以 170 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，并用移液器将细胞沉淀重悬于少量 HBSS 中。</li>
		<li>将管内液体补至 50 mL，以 290 × g 离心 10 分钟。再次吸除上清液，将细胞重悬于 HBSS（50 mL）中，再以 170 × g 离心 10 分钟。计数细胞，并用细胞分离缓冲液（材料表）将细胞重悬至浓度为 5 × 107 个细胞/mL。 
		注意：洗涤细胞时可使用磷酸盐缓冲液（PBS）替代 HBSS。</li>
		<li>从 PBMCs 中分离单核细胞时，使用磁性阴性细胞分离试剂盒，并按照制造商的说明操作。计数单核细胞，并将其重悬于单核细胞培养基（RPMI 1640，15% 热灭活胎牛血清 [FCS]，4 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL 青霉素/链霉素）中，浓度为 2 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>培养单核细胞时，使用适用于悬浮细胞的疏水性、透气膜包被培养皿（例如 100 mm）（材料表）。用紫外光照射约 30 分钟对培养板进行灭菌。将细胞转移至这些培养板中，在 37 °C、5% CO2 条件下静置过夜。 
		注意：每块包被培养皿使用 15−25 mL 细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单核细胞刺激
	<ol>
		<li>S100A12（野生型）刺激 
		注意：为区分未经处理的 S100A12（来自第 2.2.2 节的终产物）与交联蛋白，下文中将 S100A12 称为“野生型”。
		<ol>
			<li>将静置后的细胞转移至 50 mL 离心管中，以 350 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于刺激培养基（RPMI 1640，5% 热灭活 FCS，4 mM L-谷氨酰胺，100 U/mL 青霉素/链霉素）中，浓度为 2 × 106 个细胞/mL。</li>
			<li>进行刺激时，使用 24 孔悬浮培养板，每孔加入 250 µL 细胞悬液（0.5 × 106 个细胞/孔）。向目标孔中加入 50 µg/mL 多粘菌素 B，随后加入不同浓度的 LPS（25、50、100 和 200 pg/mL）或野生型 S100A12（10、20、40、60 µg/mL）。此外，还可将未经处理或经热变性处理（99 °C，10 分钟）的蛋白以不同浓度加入细胞中。 
			注意：短暂加热可使 S100A12 蛋白变性，但对 LPS 几乎无影响。</li>
			<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时。将每孔的细胞悬液转移至 1.5 mL 反应管中收集细胞，以 500 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新管中，使用人 TNFα ELISA 试剂盒（按照制造商推荐方法）检测不同稀释度（如 1:2、1:5、1:10）下的 TNFα 释放量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>S100A12 寡聚体刺激
		<ol>
			<li>如上所述，在 24 孔悬浮培养板中制备并接种单核细胞。通过加入第 4.2.3 步获得的 S100A12 寡聚体，以不同摩尔浓度（125 nM、250 nM、500 nM、1000 nM）刺激细胞。 
			注意：为比较不同寡聚体刺激单核细胞的能力，寡聚体以相近的摩尔浓度施加于细胞。</li>
			<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时，收集细胞，并如上所述检测上清液中的 TNFα 释放量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本方案中，我们描述了人源S100A12蛋白的无标签细菌表达、纯化，以及分离为不同离子诱导的寡聚体以用于免疫细胞刺激。与已发表的关于S100A12蛋白纯化的文献相比8,23,24，高浓度CaCl₂的使用2 据我们所知，使用25 mM CaCl₂进行疏水相互作用层析的方法是独特的。尽管已有若干采用1至5 mM浓度的方案能够获得纯化的蛋白质，但我们采用25 mM CaCl₂的策略所获得的蛋白产量显著更高。2 相反，这可能归因于蛋白质与柱材料相互作用的层级关系：S100A12 能够直接与柱材料结合，但过量的 Ca2+ 也可能促进S100A12二聚体与已结合在层析柱上的蛋白质之间的间接结合8因此，高 Ca2+ 浓度可能扩大可用于S100A12纯化的表面。疏水相互作用色谱（HIC）中S100A12的洗脱（采用线性梯度）呈现一个早...

S100A12 是一种钙结合蛋白，主要由人粒细胞产生。在（系统性）炎症期间，该蛋白表达上调，其血清水平尤其可用于评估系统性幼年特发性关节炎（sJIA）、家族性地中海热（FMF）或川崎病（KD）等（自身）炎症性疾病的疾病活动度及对治疗的反应。根据模式识别受体（PRRs）（如Toll样受体（TLRs））的不同，固有免疫系统可被病原体相关分子模式（PAMPs）（如脂多糖（LPS））或损伤相关分子模式（DAMPs；也称为“警报素”）所激活。DAMPs 是内源性分子，例如细胞蛋白、脂质或核酸1。钙卫蛋白家族成员 S100A8/A9 和 S100A12 的 DAMP 功能已有充分描述2，这些蛋白还被报道可作为二价金属离子螯合的抗菌肽发挥作用3,4,5,6。与其他 S100 家族成员类似，S100A12 可根据可用的离子强度形成不同的同源多聚体，而 S100A12 寡聚化对 PRR 相互作用（特别是 TLR4）的影响在最近之前尚不清楚。
该蛋白的单体形式（92个氨基酸，10.2 kDa）由两个通过柔性连接区相连的EF-手型螺旋-环-螺旋结构组成。C端EF-手包含经典的Ca2+结合基序，而N端EF-手则具有S100蛋白特异性的延长环结构（“假EF-手”），并表现出降低的Ca2+亲和力。S100A12与Ca2+的结合可诱导该蛋白C末端发生显著的构象变化，导致每个单体暴露出一个疏水区域，从而形成二聚化界面。因此，在生理条件下，S100A12形成的最小四级结构是一个非共价结合的二聚体（约21 kDa），其中单体呈反向平行排列。当形成二聚体时，S100A12被报道能够以高亲和力螯合Zn2+以及其他二价金属离子，例如Cu2+7。这些离子由一个亚基中的H15和D25以及反向平行的另一个亚基中的H85和H89通过配位作用结合于S100A12二聚体界面8,9,10。尽管早期研究提出Zn2+结合的S100A12可能诱导蛋白组装成同源四聚体（44 kDa）并导致Ca2+亲和力升高11,12，但近期的金属滴定研究表明S100A12结合Ca2+后会增强其对Zn2+的亲和力6。一旦S100A12的EF-手完全被Ca2+占据，额外的Ca2+被认为会结合在二聚体之间，从而触发六聚体的形成（约63 kDa）。六聚体的四级结构明显不同于四聚体，据推测四聚体界面被破坏，形成新的二聚体-二聚体界面，从而促进六聚体的组装10。S100A12几乎专一性地在人粒细胞中表达，约占所有胞质蛋白的5%13。在发挥DAMP功能时，S100A12历史上被描述为晚期糖基化终产物受体（RAGE）的多配体激动剂，曾被称为细胞外新发现的RAGE结合蛋白（EN-RAGE）14。尽管我们早前报道过S100A12在生化水平上可结合RAGE和TLR415，但最近我们证明人单核细胞对S100A12的刺激响应依赖于TLR416。这一过程需要S100A12组装成由Ca2+/Zn2+诱导形成的六聚体四级结构16。
本文描述了一种用于纯化重组人源S100A12蛋白及其离子诱导寡聚体以进行免疫细胞刺激的实验流程16,17。该方法基于两步层析策略，首先采用阴离子交换柱分离并浓缩目标蛋白，同时去除大量污染物（例如内毒素/脂多糖）18。离子交换层析介质依据蛋白质表面净电荷的差异实现分离。对于S100A12等酸性蛋白（等电点为5.81），在pH 8.5条件下使用强阴离子交换树脂可实现良好的分离效果。结合在树脂上的蛋白质通过高盐缓冲液梯度洗脱。随着离子强度的增加，洗脱缓冲液中的阴离子与蛋白质竞争树脂表面的电荷位点，不同蛋白质根据其净电荷大小依次被洗脱。因此，本文所述缓冲体系可用于分离和富集过表达的S100A12蛋白。由于脂多糖分子含有带负电荷的基团，它们也能结合到阴离子交换树脂上，但因其具有更高的净负电荷，会在高盐梯度洗脱的后期被洗出。纯化流程的第二步为精纯步骤，利用S100A12的钙离子结合能力，通过疏水相互作用层析柱去除残留杂质。S100A12结合钙离子后发生构象变化，暴露出蛋白表面的疏水区域，从而与树脂的疏水表面结合。当加入EDTA螯合钙离子后，该相互作用被逆转，蛋白被洗脱下来。在钙离子和锌离子等金属离子存在的情况下，S100A12可组装成同源寡聚体。为了研究不同寡聚体的结构与功能关系，我们使用化学交联剂稳定了二聚体、四聚体和六聚体形式的重组S100A12，并通过凝胶过滤层析柱将这些复合物分离开来。最后，为分析纯化后的蛋白及其离子诱导寡聚体的功能性和生物学活性，可比较S100A12与LPS刺激单核细胞后细胞因子的释放情况。
迄今为止，已有多种纯化S100A12的方法被报道。例如，Jackson等人19发表了一种通过阴离子交换柱和随后的尺寸排阻色谱进行纯化的方案。在尺寸排阻柱上进行的纯化精制步骤可获得良好的效果，但由于上样体积有限等原因，在放大生产方面灵活性较低。Kiss等人20发表的另一种方法则以Ni2+亲和柱纯化带标签蛋白作为第一步，随后通过酶切去除标签并进行进一步的纯化步骤。与前述研究19,20不同，本方案所制备的蛋白旨在用于免疫细胞实验。因此，来自细菌培养物的残留内毒素污染是一个挑战。尽管迄今为止已有多种内毒素去除方法被描述，但尚无一种通用方法可对所有蛋白溶液均实现同等高效的去内毒素效果21,22。
总之，我们的实验方案结合了在细菌系统中进行无标签表达的优势，以及高效的内毒素去除和高产量纯化蛋白的特点。

<table><tbody><tr><td>pET11b 载体</td><td>Novagen</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>BL21(DE3) 感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>新英格兰生物实验室（New England Biolabs）</td><td>C2527</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>100 倍非必需氨基酸</td><td>默克（Merck）</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25% 盐酸</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;minus;20% Mini-PROTEAN TGX 蛋白凝胶</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3（双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯）- 50 mg</td><td>赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific）</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R250 脱色液</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R250 染色液</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人单核细胞富集试剂盒</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>磁性阴性细胞分离试剂盒</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>内毒素检测试剂盒</td></tr><tr><td>无内毒素超纯水</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>TMS-011-A</td><td>用于配制无内毒素缓冲液的超纯水</td></tr><tr><td>EndoTrap red</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>内毒素去除树脂</td></tr><tr><td>FBS（热灭活）</td><td>吉布科（Gibco）</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙，无镁</td><td>赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific）</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes（高纯度，经内毒素检测）</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>人 TNF-α - OptEia ELISA 试剂盒</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基-&amp;szlig;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷）</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>默克（Merck）</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; O55:B5 的脂多糖</td><td>默克（Merck）</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll，人源</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td>分离液（密度梯度离心）</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>默克（Merck）</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>苯基 Sepharose 高性能树脂</td><td>GE 医疗（GE Healthcare）</td><td>17-1082-01</td><td>疏水相互作用层析用树脂</td></tr><tr><td>多粘菌素 B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>罗氏（Roche）</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose 快速流树脂</td><td>GE 医疗（GE Healthcare）</td><td>17-0510-01</td><td>阴离子交换层析用树脂</td></tr><tr><td>RoboSep 缓冲液</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>细胞分离缓冲液（第 5.1.4 节）</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>默克（Merck）</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>默克（Merck）</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 圆底管</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 L 锥形瓶</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 孔悬浮培养板</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 L 量杯</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>康宁（Corning）</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 高速离心管</td><td>艾本德（Eppendorf）</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤单元，截留分子量 3 kDa</td><td>默克（Merck）</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤单元，截留分子量 50 kDa</td><td>默克（Merck）</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 mm）</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>透析袋夹</td><td>Spectrum</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 磁力架“Big Easy”</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>组分收集管（5 mL）</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Lumox 膜，25 &amp;micro;m，305 mm × 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>单核细胞培养板用膜</td></tr><tr><td>Spectra/Por 透析膜（3.5 kDa）</td><td>Spectrum</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 滤器单元</td><td>默克（Merck）</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA purifier UPC 10</td><td>GE 医疗（GE Healthcare）</td><td></td><td>FPLC 系统</td></tr><tr><td>组分收集器</td><td>GE 医疗（GE Healthcare）</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>离心机（配备 A-4-81 转子）</td><td>艾本德（Eppendorf）</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>固定角转子</td><td>艾本德（Eppendorf）</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra 电泳槽</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>荧光读板仪</td><td>Tecan</td><td>infinite M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

人s100a12蛋白及其离子诱导寡聚体的纯化及其在免疫细胞刺激中的应用

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

本方案描述了一种从大肠杆菌（Escherichia coli）培养物中纯化人钙结合蛋白 S100A12 及其离子诱导寡聚体并用于免疫细胞刺激的方法。该方案基于两步层析策略，包括在阴离子交换层析柱上进行蛋白质的初步纯化，随后在疏水相互作用层析柱上进行精细纯化。该策略可在可控成本下获得高纯度和高得率的 S100A12 蛋白。由于功能实验中免疫细胞对内毒素残留极为敏感，因此必须严格监测最终产物中的内毒素污染，并采取进一步清洁步骤以获得无内毒素蛋白。大部分内毒素污染可通过阴离子交换层析去除。为清除残留污染物，本方案还描述了使用离心过滤器进行去除的步骤。根据所处离子强度的不同，S100A12 可形成多种同源多聚体。为研究其结构与功能之间的关系，本方案进一步描述了对 S100A12 蛋白进行离子处理，继而采用化学交联法稳定其寡聚体结构，并通过尺寸排阻层析实现寡聚体的分离。最后，我们介绍了一种基于细胞的检测方法，用于验证纯化蛋白的生物学活性，并确认制备物中不含脂多糖（LPS）。

经过阴离子交换柱（AIEX）预纯化（图1A-C）以及随后的钙离子依赖性疏水相互作用层析（HIC）（图2A,B）后，获得了高纯度的蛋白（图2C）。此外，内毒素检测结果显示脂多糖（LPS）被成功去除。AIEX步骤后的LPS含量在1:10稀释条件下高于检测限，即高于500 EU/mL。经过50 kDa滤膜的第一次过滤后，LPS含量降低至1 EU/mL。随后使用3 kDa滤膜进行浓缩，并再次通过50 kDa滤膜过滤，最终测得的LPS污染水平为0.08 EU/mL。
作为额外对照，用人源野生型蛋白刺激人单核细胞（图3A,B）。多粘菌素B处理可消除脂多糖（LPS）刺激单核细胞所引起的TNFα释放，但对S100A12无此作用。另一方面，对LPS和S100A12...

本方案描述了一种用于纯化重组无标签钙结合蛋白S100A12及其离子诱导寡聚体的方法，以用于人单核细胞刺激实验。

人S100A12蛋白及其离子诱导寡聚体的纯化及其在免疫细胞刺激中的应用

在本实验方案中，我们描述了一种从大肠杆菌培养物中纯化人钙结合蛋白S100A12及其离子诱导寡聚体的方法，用于……

本方案描述了人钙结合蛋白 S100A12 的完整纯化流程，特别是针对其不同离子诱导形成的寡聚体，以满足后续研究的需求。通过该技术，我们能够获得高产量、高纯度且无内毒素的蛋白。化学交联结合凝胶过滤层析分离是一种可靠的方法，可用于制备同源寡聚蛋白，以进一步开展功能分析。我们的技术使我们能够研究S100A12作为模式识别受体配体的机制性特征，并利用这些信息理想地开发新的靶向干预手段并改进诊断检测方法。除了观看本视频外，我们还建议仔细阅读实验方案，因为其中描述的是一个复杂的多步骤流程。首先，将透析管剪成适当长度，约为30厘米，并预留足够的空间用于容纳空气。将膜浸泡在去离子水中15至30分钟，以去除甘油。为降低澄清蛋白溶液的黏度，用25毫升AIEX缓冲液A稀释该溶液。将第一个封口夹固定在管路上。将样品加入膜中，并在距管路顶端至少一厘米处安装第二个封口夹。在4°C的低温房间内，将装有AIEX缓冲液A的容器置于搅拌器上，加入搅拌子以及含有蛋白溶液的透析膜。调节转速，使样品旋转时不与旋转的搅拌子发生干扰。在4°C条件下透析12至24小时，然后更换为新鲜的预冷缓冲液A，继续透析至少额外4小时。将透析后的蛋白质溶液通过0.45微米滤器装置从透析管转移至50毫升离心管中。启动FPLC系统并进行常规维护。将阴离子交换缓冲液AIEX A和AIEX B连接至缓冲液阀，并将装有阴离子交换树脂的色谱柱连接至FPLC的色谱柱接口。相应调整常规色谱参数。在FPLC软件中启动AIEX程序，并选择缓冲液A的平衡体积。随后将样品加载到柱上，并用从0%至100%高盐缓冲液的线性梯度洗脱蛋白质。在洗脱过程中收集每管2毫升的组分。运行结束后分析洗脱组分。为此，将每份组分各取10 µL上样至考马斯亮蓝染色的15% SDS-PAGE凝胶，鉴定含有S100A12的组分。收集含S100A12的组分，用于透析至Tris缓冲盐溶液中。为了继续进行蛋白质纯化，在蛋白质透析后，向样品中加入氯化钙，使其终浓度为 25 毫摩尔，这将有助于在下一步中 S100A12 与树脂的结合。然后，使用孔径为 0.45 微米的滤器过滤样品。将疏水相互作用层析（HIC）缓冲液和样品平衡至 4 摄氏度。接下来，将疏水相互作用层析（HIC）缓冲液A和B以及层析柱连接至系统，并调整相关参数。开始运行方法，用1至2个柱体积的HIC缓冲液A平衡层析柱，上样并清洗未结合的样品，直至紫外信号重新回到基线水平。随后使用含有EDTA的钙螯合缓冲液开始洗脱。在洗脱过程中收集两毫升的峰流分。将每份流分取10微升，在考马斯亮蓝染色的15% SDS-PAGE上进行分析，鉴定出纯的S100A12流分。合并这些流分，并用HBS缓冲液进行透析。首先，将15毫升样品加入一个50千道尔顿的离心过滤装置中。在10摄氏度下以3200 × g离心约10分钟。将滤过液转移至预冷的新容器中，置于冰上。现在，使用 1 毫升 HBS 冲洗滤膜，并用于滤尖中浓缩液的稀释。再次离心，以在流穿液中回收尽可能多的蛋白质。为过滤溶液，根据需要重复上样和离心操作。接下来，为了浓缩含有 S100A12 的穿流液，将其加入一个 3 千道尔顿的离心过滤装置中，在 3200 × g、10 °C 条件下离心约 30 分钟。此时体积已减少至初始上样体积的 1/5 至 1/10。将浓缩后的溶液转移至新的离心管中。根据需要重复浓缩步骤。按照文稿所述，在化学交联后进行尺寸排阻色谱。用 HBS 平衡色谱柱，上样，并在运行过程中收集 1 至 2 毫升的峰馏分。在4%至20%梯度SDS-PAGE上分析这些组分后，合并含有目标蛋白质复合物主要条带的组分。然后按照之前的方法浓缩溶液。为通过密度梯度离心法从人血沉棕黄层中分离单核细胞，首先将分离液平衡至室温。将20毫升转移至15毫升离心管中，每份血沉棕黄层使用两支离心管。用HBSS将人血沉棕黄层血液稀释至总体积60毫升，并小心地将30毫升该混合液分层加至分离介质上方。在室温下以550 × g离心35分钟。关闭离心机的刹车。离心结束后，单个核外周血细胞会直接位于分离液的上层。用移液器将这些细胞转移至一个新的50毫升离心管中。用HBSS将离心管补至50毫升，以170 × g离心10分钟。吸除上清液，用少量HBSS通过移液将细胞沉淀重悬。然后，将离心管补至50毫升，以290 × g离心10分钟。再次吸弃上清液。将细胞重悬于 50 毫升 HBSS 中，以 170 × g 离心 10 分钟。吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 1 毫升分离缓冲液的小体积中，计数细胞，并加入缓冲液使细胞浓度达到每毫升 5 × 10⁷ 个细胞。从单个核外周血细胞中分离单核细胞时，使用磁性阴性细胞分离试剂盒，并按照制造商的说明书操作。使用自动细胞计数仪对单核细胞进行计数，并将其重悬于单核细胞培养基中，调整细胞浓度至每毫升2×10⁶个细胞。培养单核细胞时，使用适用于悬浮细胞的疏水性透气膜铺制细胞培养皿。将培养皿置于紫外光下照射约30分钟以进行灭菌。取15至25毫升细胞悬液转移至这些培养皿中，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下静置过夜。经过阴离子交换柱预纯化及随后的钙依赖性疏水相互作用层析后，获得了高纯度的蛋白质。作为额外的对照，用LPS刺激人单核细胞并产生野生型蛋白。蛋白质暴露于不同离子时，会导致形成不同的S100A12寡聚体。随着锌浓度的增加，在4%至20%考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE电泳分离后，S100A12会组装成四聚体和六聚体。在交联前加入过量离子时，会显著改变寡聚体的平衡状态。S100A12 在含有 25 毫摩尔钙离子或 25 毫摩尔钙离子加 1 毫摩尔锌离子的条件下进行交联。在含有 25 毫摩尔氯化钙和 1 毫摩尔氯化锌的 HBS 缓冲液中交联后，分离出六聚体和四聚体。在含有25毫摩尔氯化钙的HBS缓冲液中分离出四聚体和二聚体。经考马斯亮蓝染色的4%至15%梯度SDS-PAGE分离后，收集并浓缩的寡聚体示例显示存在二聚体、四聚体和六聚体。用六聚体S100A12刺激单核细胞可导致显著的TNFα释放。在去除内毒素后，后续寡聚体的制备和纯化过程中，避免重新引入污染至关重要。任何与S100A12寡聚化相关的工艺均可进行下游分析。同样，可对影响寡聚化过程本身的氨基酸和离子条件进行分析。 目前，我们正在利用根据所述方案分离的S100A12寡聚体，开发特异性肽配体和抗体，以阻断该蛋白通过TLF4的信号传导，并用于开发和改进诊断检测方法。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人类S100A12及其用于免疫细胞刺激的Ion诱导寡聚物的纯化

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S100A12的表达、纯化及其抗菌活性

MALT1 调控先天免疫，但其作用机制尚不明确。我们使用选择性 MALT1 副半胱天冬酶抑制剂 MLT-827，揭示了 MALT1 在 Toll 样受体或 C 型凝集素样受体下游的先天免疫信号通路中的作用，证明 MALT1 调控髓系细胞因子的产生，且该作用主要在 C...

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在BALB/c小鼠中诱导药物诱导型自身免疫性肝炎以研究其致病机制

本文提供了一种详细的方法，用于自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的纯化、复性及表征，以应用于疫苗开发。...

E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

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体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

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生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

学习人类钙结合蛋白S100A12及其离子诱导寡聚物的纯化方法，用于免疫学研究。该技术可获得高产量、高纯度且无内毒素的蛋白质，适用于单核细胞刺激实验和下游功能分析。

人S100A12蛋白及其离子诱导寡聚体的纯化及其在免疫细胞刺激中的应用

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