利用PRIMO微图案系统研究细胞对细胞外基质蛋白响应的光诱导蛋白质分子吸附

微图案技术是一种非常强大的工具，因为它能够研究细胞对生物化学和生物物理信号的响应，这些信号是细胞在活体生物中所遇到的。与其他方法相比，所述方法在图案生成方面更具灵活性。例如，它能够以高度可重复性生成多种蛋白质的梯度和微图案。

我们课题组不仅利用LIMAP研究神经元的路径寻找，还研究其他细胞如何响应影响细胞增殖、分化和迁移的信号。微图案技术被用于回答细胞生物学中的基本问题。所获得的知识可用于改进再生医学中的现有装置，例如外周神经损伤后的神经修复。

首先，在数字绘图软件中设计用于图案化的模板。选择长度为 1,824 像素、宽度为 1,140 像素的图像尺寸。完成模板设计后，将其保存为 8 位 TIFF 文件。

在进行图案化之前，使用等离子清洗机在1,000至1,300毫托的工艺压力和29.6瓦的功率下对表面进行清洁和活化处理，处理时间为1至5分钟。选用底部为玻璃的培养皿，其内孔直径为20毫米，玻璃厚度为0.16至0.19毫米。根据所测试条件的数量，选择六孔板或单孔板。

在无菌条件下裁剪PDMS模板，确保其能够贴合内层玻璃底小孔。使用无菌镊子移除内层微孔的填充物，并将模板粘附在玻璃孔上。用PBS配制0.1毫克/毫升的PLL-PEG溶液，并向每个微孔中加入20微升。

然后，将培养皿在室温下孵育一小时。孵育结束后，从每个孔中移除15 µL的PLL-PEG，并用20 µL的PBS洗涤五次，注意避免干燥。准备一个微孔用于创建参考图案：从单个孔中移除18 µL PBS，加入5 µL光引发剂，其余微孔中保留PBS。

然后，使用荧光标记笔标记一个空的内层玻璃小室。将小室置于物镜上方，调节物镜焦距，直至PRIMO标志和标语“take care of your cells”清晰对焦。随后，记录焦平面的Z位置。

为创建参考图案，通过相机利用透射光观察含光引发剂的微孔边缘，并从右侧菜单中选择 ROI 符号。选择 PRIMO 以上传所需的图案模板，该模板将作为设计单元投射到 ROI 上。导航至微孔的边缘区域，选择“锁定”，并调整焦距至校准的 Z 位置。

然后，选择“播放”以开始对参考图案进行光刻图案化。用 20 微升 PBS 溶液将参考图案微孔清洗三次，以去除光引发剂。接着，加入 20 微升荧光标记的细胞外基质（ECM）蛋白溶液。

将培养皿在室温下孵育10至20分钟，注意保护参照孔免受光照。孵育结束后，移除18 µL蛋白溶液，并用20 µL PBS洗涤孔内三次。使用落射荧光显微镜观察参照图案。

通过相机路径调节图案边缘的焦距，并根据最佳焦点记录Z轴位置。该位置将作为后续图案化处理的最佳激光焦点。在无菌条件下，从所有微孔中移除18微升PBS。

向每个孔中加入 5 µL 光引发剂，并通过上下吹打混匀。若在同一微孔中进行多种蛋白质的图案化，请同时上传所有所需的图案模板。然后，选择行数、列数和剂量。

将模板配置保存为软件中的文件。导航至生成参考图案的区域，并将焦距调整至最佳Z位置。然后，选择“播放”以启动光图案化。

随着光图案化完成，设计单元会从红色变为蓝色。用20微升PBS洗涤三次，以去除微孔中的光引发剂。最后一次洗涤后，从每个微孔中移除18微升PBS，并加入20微升ECM蛋白溶液。

将培养皿在室温下孵育20至30分钟，注意避光。接着，移除15微升ECM蛋白溶液，并用20微升PBS洗涤微孔三次。为防止交叉结合，在微孔中加入20微升PLL-PEG或BSA，并将培养皿在黑暗条件下于室温孵育一小时。

然后，移除15 µL封闭剂，并用20 µL PBS将所有微孔清洗三次。移除18 µL PBS，向每个微孔中加入5 µL光引发剂，确保光引发剂均匀覆盖整个微孔表面。导航至第一个微孔，并加载先前保存的模板配置。

然后，选择第二轮光图案化要构建的图案，注意取消选择第一轮中的图案。光图案化完成后，用 PBS 洗涤以去除 PLPP。接着，加入第二种细胞外基质蛋白溶液孵育 20 分钟，并用 20 µL PBS 洗涤微孔三次。

使用落射荧光显微镜观察并成像打印的图案。准备接种细胞时，向内层玻璃小室中加入一毫升含细胞的培养基，确保覆盖所有微孔。然后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。

为了确保生成的图案能够精确反映模板，需沿条带及其上方相应的背景区域进行荧光强度测量。可重复地获得宽度范围从20至2微米的明确定义的微图案，但在打印宽度为20微米或更宽的特征时，可观察到边缘效应。通过孵育不同浓度的蛋白质，或改变用于切割抗黏附膜的激光剂量，可获得明确定义的蛋白质浓度。

激光强度与模板的灰度级别成正比，从而产生紫外光照的梯度。沿梯度条带测得的荧光强度分布，在图案模板中以及在生成的梯度图案中均呈线性。该方案可用于在同一微孔中创建含多种蛋白质的微图案，例如由纤连蛋白水平条带和层粘连蛋白垂直条带构成的十字交叉图案。

但必须进行封闭步骤，以防止蛋白质发生交叉结合。所生成的交叉图案随后可用于神经细胞系、CAD细胞或原代神经元、大鼠DRG的细胞实验。在执行本方案时，需牢记最重要的几点：正确校准系统，确保在多次洗涤步骤中微孔不干燥，以及使用适当的参数进行蛋白质孵育和封闭。

细胞行为的分析通常涉及显微镜技术，例如荧光显微镜、延时成像和原子力显微镜（AFM）。进一步的表征还可包括其他生物化学方法，例如基因表达谱分析。