Name: 使用 PRIMO 微模式系统对蛋白质的光诱导分子吸附，研究细胞对细胞外基质蛋白的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 了解光诱导分子吸附技术如何创建细胞外基质蛋白微图案，用于研究神经元轴突生长和导向机制。该方法为神经再生医学中的神经修复策略提供了重要的实验基础。

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本工作由英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）、工程和物理科学研究理事会（EPSRC）、医学研究理事会（MRC）以及惠康信托基金（Wellcome Trust）资助。C.B. 实验室隶属于曼彻斯特大学惠康信托细胞-基质研究中心，该中心由惠康信托基金的核心资金支持（资助编号 088785/Z/09/Z）。作者感谢生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）向 C.M.、K.J.（项目编号 BB/M020630/1）和 P.A.（项目编号 BB/P000681/1）提供的经费支持，以及工程和物理科学研究理事会（EPSRC）和医学研究理事会（MRC）再生医学博士培训中心向 A.K.（项目编号 EP/L014904/1）提供的资助。作者感谢 Alvéole 公司的沟通协助及其售后支持团队。作者感谢曼彻斯特大学生物成像设施中心的 Peter March 和 Roger Meadows 在显微成像方面提供的帮助。本研究所使用的生物成像设施中心的显微镜由 BBSRC、惠康信托基金以及曼彻斯特大学战略基金的资助购得。

作者无任何利益冲突需要披露。

LIMAP（PRIMO）微图案化技术的优势及其与微接触印刷的比较 
尽管微接触印刷可能是生物领域中最常用的微图案化技术39，但越来越多的研究人员正在采用LIMAP技术40,41,42,43,44。本文介绍了一种使用PRIMO（一种 commercially available 的LIMAP系统）的实验方案。以下简要讨论微接触印刷与LIMAP光图案化技术的潜在优势与局限性。
微接触印刷需要使用光刻模板，该模板通过在玻璃或硅晶片上旋涂光刻胶（通常为SU-8）并用激光蚀刻出所需的微结构而制成。这些模板用作制造PDMS印章的模版45。将选择的蛋白质与印章孵育，使蛋白质吸附于其表面，然后将印章转移（压印）到细胞培养皿上。蛋白质在PDMS印章上的吸附过程依赖于蛋白质浓度、缓冲液和孵育时间。为了获得最佳结果，这些参数需在实验前进行优化测试46。
如果保存得当，母版可用于大量实验，持续数月甚至数年。然而，该技术的一个限制因素是，每次需要进行修改时都必须重新设计新的光刻母版。实验设计的变更可能导致新母版的制备耗时较长（长达数周），从而延误实验进程。相比之下，LIMAP光图案化技术无需物理母版，而是使用软件生成的图案模板，能够灵活地根据变化的研究需求调整微图案的几何形状。LIMAP还可用于在同一微图案内生成蛋白质浓度梯度（图8），而使用微接触印刷技术则难以以可重复的方式实现这一目标47。
此外，本研究中采用LIMAP技术实现的微图案分辨率为2 µm（图6B）。
接近该分辨率时，图案内部及图案之间的变异性增加。生成宽度在10 µm左右或更大的图案具有高度可重复性（图6G,H）。相反，使用微接触印刷技术难以稳定获得低于10 µm的分辨率，在转印微小特征时常常出现伪影（数据未显示）。
我们已证明，LIMAP 可用于在同一微孔内对多种蛋白质进行微米级图案化（图9），从而为实验引入更高层次的复杂性。尽管微接触印刷技术也可实现该目的，但以高精度对齐不同蛋白质在技术上具有较大挑战性。虽然使用 LIMAP 对多种蛋白质进行图案化看似直接简便，但需要指出的是，通过连续包被步骤可能导致蛋白质之间的交叉结合，尽管使用封闭试剂可降低该现象，却无法完全消除（图9）。
关于两种技术的成本，此处所述的LIMAP技术需要购买微图案化设备（PRIMO），该设备可安装在不同的荧光显微镜上，并需配备电动载物台。尽管初期投资成本较高，但长期来看，LIMAP仅需购买耗材（模板、PEG和PLPP），无需其他额外支出。或者，实验人员也可根据已发表的方案在实验室自行制备PDMS模板18,32。微接触印刷技术的最大成本可能来自新母版的制作，若实验需要设计新的图案，相关费用可能显著增加。
LIMAP 的一个缺点是该技术通量相对较低。与 LIMAP 所需的逐次激光微加工相比，微接触印刷可通过一次同步压印快速高效地生成大量微图案。例如，使用 PDMS 印章进行微接触印刷可在约 2 小时内制备 6 个带有微图案的玻璃盖玻片（不包括印章制备时间）；而使用 LIMAP 对类似面积（6 孔板）进行图案化则需要约 4 小时（不包括表面钝化步骤，参见步骤 5.12 中描述的图案模板配置，并见图 5B）。
LIMAP 技术的另一个限速因素是大面积图案化所需的长时间照射（使用 7.5 mW/mm2 激光时，每个设计单元需 30 秒）。在此类情况下，微接触印刷可能是更优选的方案。一种新近可用的光引发剂（PLPP 凝胶，材料表）应能显著缩短图案化所需时间，仅需几分钟即可在大面积（最大达 8 mm2）上生成数百个微图案。
在为细胞培养进行表面微图案化时，另一个需要考虑的重要因素是不同实验重复之间微图案的可重复性，并与微接触印刷技术所获得的变异性进行比较。例如，图7B,D 中所示的图表代表了三次独立实验重复的典型数据，结果非常相似（数据未显示）。根据我们的经验及以往发表的研究，使用微接触印刷技术很难达到此种水平的可重复性48,49,50,51,52。
与其他需要专门化学方法来设计光敏材料或使用通常生物相容性较差的光敏剂的光图案化技术相比3，LIMAP 中的光敏组分（PLPP）具有良好的生物相容性，并且细胞耐受性优异21；在我们的实验中，包括 CAD 细胞、背根神经节神经元（图 10）、成纤维细胞、上皮细胞以及黑色素瘤细胞在内的多种细胞均未表现出任何细胞毒性（数据未显示）。与其它光图案化技术相比，使用 PRIMO 进行 LIMAP 的另一优势在于无需使用光掩膜。与微接触印刷类似，每种期望的图案都需要重新设计和制备新的光掩膜。
上述提到的微接触印刷技术的所有局限性均指该技术的手动操作方式。然而，通过使用具有印模负载和压力控制功能的自动化设备，可以提高微接触印刷的通量和可重复性53。
使用 PRIMO 进行 LIMAP 实验的关键步骤及问题解决 
在本实验方案中常见的问题之一是微图案内出现较高水平的背景荧光。这通常是由于微孔体积较小，容易发生干燥所致。当出现这种情况时，PBS 晶体常会出现在细胞外基质（ECM）图案周围（图 11A）。
蛋白质孵育后洗涤步骤不足或效率低下，也可能导致背景荧光水平过高。尤其在使用浓度为 10 µg/mL（图 11B）或更高的蛋白质时，这一现象更为明显。通过增加 PBS 洗涤步骤，可减少背景中的过量蛋白质。
每次实验中均需测量并表征蛋白质背景信号，通过计算背景荧光强度（图6E），并从微图案信号强度中扣除该值（图6F-H 和 图7B,D）。过高的蛋白质背景可能影响CAD细胞的贴附与出芽，从而干扰实验结果的解读。
当用户经验有限时，在设计单元之间出现间隙是一个常见问题（图11B），这是由于图案之间重叠不足所致。在 Leonardo 软件中可调节两个参数来克服此问题：1）根据图案设计，可能需要设置列之间的负间距（步骤 5.7，参见 图5B,C）；或者，2）使用 Expert 菜单中的梯度选项来拼接各列。可通过使用紫外光固化胶（材料表）进行快速测试，以确定最佳的间距参数。测试时，在载玻片上滴加少量该胶，然后覆盖盖玻片形成薄膜。使用低激光剂量（30 mJ/mm2）按照目标图案模板对嵌入的紫外光固化胶进行光刻图案化。经紫外光照射的胶体区域将发生固化，在明场显微镜下可见。通过观察测试结果，评估所获得的图案内间距效果。在我们的神经元实验中，条带之间的间隙可能对细胞行为产生不利影响，导致生长动态发生变化（如生长速度减慢或路径被放弃）。
在 Leonardo 软件的最新更新版本中（截至发表时为 Leonardo 4.11），可上传先前设计的更大图案模板，其覆盖微孔表面的面积远大于当前每个设计单元的 0.1 mm2（使用 20 倍物镜时最大可达 8 mm2），从而无需再拼接多个较小的设计单元。在图案生成过程中，若未进行激光聚焦调整，可能导致边缘模糊不清（图 11C）。因此，在进行图案化之前，校准激光并执行参考图案步骤（见步骤 4）至关重要。条纹边界不清晰会导致条纹宽度出现变异，使轴突生长动态与条纹宽度之间的相关性难以分析。此外，轴突也倾向于偏离边缘扩散的条纹。当打印宽度为 10–20 µm 或更宽的条纹时，边缘不均一性同样可能出现，导致图案边缘区域的蛋白含量高于中央区域（图 6B,D）。这种边缘效应源于光图案化过程中光引发剂扩散不均。光裂解反应依赖于氧气，而氧气在边缘区域扩散更为显著。在光图案化过程中，可通过移液器在微孔内混合光引发剂以均一化其分布，从而减轻该边缘效应。此外，一种新上市的商用光引发剂（PLPP 凝胶）也可有效降低边缘效应（PRIMO 系统支持团队，个人交流）。
多种蛋白质的微打印可能导致交叉结合（图9A-D）。通过提高阻断效率，可在两种不同蛋白质孵育步骤之间占据非特异性结合位点，从而最大限度地减少交叉结合。蛋白质的交叉结合可能影响实验结果的可重复性，并可能导致对数据的误读，因为难以确定每种蛋白质对轴突生长动态及其他细胞行为的各自贡献。
结论 
我们希望本实验方案中提供的使用LIMAP的方法能够借助PRIMO系统促进蛋白微图案的制备。尽管本方案主要关注如何在二维玻璃表面可靠地生成微图案，但已有研究显示，LIMAP也可用于软质基底的微图案化54，以及用于三维培养的微结构表面42。这些微图案可作为一种多功能工具，用于研究细胞对其微环境变化的响应。

近年来，生物科学越来越多地利用材料科学所提供的技术进步。一个典型的例子是基底的微图形化技术，该技术可用于研究细胞增殖等细胞反应1,2，分化3,4,5,6细胞迁移7,8,9 和路径寻找10,11有多种技术可用于基底的微图形化，例如多光子激发光化学12原子力显微镜蘸笔纳米光刻13，针式和喷墨直接打印14电子束光刻15 或微流控技术16然而，生物学领域广泛使用的两种技术之一是微接触印刷17,18,19 或激光辅助图案化3 (图1激光辅助图案化技术在蛋白质和聚乙二醇（PEG）稳定性以及细胞在图案上的限定性方面，被认为比微接触印刷技术能提供更可靠的结果。20一种更为新颖的微图形化方法是利用光诱导蛋白质分子吸附技术21 (LIMAP, 图1D）使用市售系统（PRIMO， 材料表）。每种方法均有其优缺点，下文将简要描述。微接触印刷技术采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具（印模），其微结构特征由光刻母版制备而来。将印模与选定的蛋白质孵育，随后将蛋白质转移（印迹）至细胞培养基底上18 (图1A）。激光辅助图案化利用紫外光切割抗污膜22,23,24,25，暴露可随后用目标蛋白包被的区域（图1B）。虽然光刻图案化方法所达到的分辨率在微米量级25,26，这些技术大多需要使用光掩模，要么与样品直接接触，要么位于显微镜物镜的物平面内23,27,28在微接触印刷和光刻图案化中，掩模的使用可能成为限制因素；每种几何图案和尺寸都需要特定的掩模，而制备这些掩模可能成本高昂且耗时。相比之下，LIMAP 技术无需使用掩模。图1D）。使用PRIMO系统进行LIMAP在初期可能成本较高，因为它需要购置设备。然而，该系统采用开源软件来设计任意所需几何形状的图案，提供了更大的自由度，并允许开展更复杂的实验，包括使用蛋白质浓度梯度。PRIMO激光器由数字控制的微镜装置（DMD）控制和引导，可生成任意数量用户自定义几何形状的图案。LIMAP要求培养表面涂覆阻止细胞附着的分子，最常用的是聚乙二醇（PEG）。 &#34;防污&#34; 试剂；其可在玻璃或塑料表面形成致密的抗粘附膜29随后加入一种光引发剂，可通过光裂解机制高精度地去除PEG薄膜。30 通过DMD控制下的局部紫外光照射，去除特定区域的PEG，这些无PEG区域可吸附蛋白并涂覆于激光蚀刻的表面，从而形成微米级图案。通过调节激光功率，可从表面去除不同量的PEG，使用户能够生成蛋白浓度梯度。PEG去除与蛋白涂覆步骤可重复进行，以在同一微孔中构建包含两种或多种不同蛋白的图案。21生成的微图案为细胞提供了黏附表面，可用于研究细胞行为。在我们的研究中，利用微图案技术来研究神经细胞系（CAD（儿茶酚胺能分化）细胞）的神经突或轴突导向。31）或原代大鼠背根神经节（DRG）神经元。本文中，我们概述了一种LIMAP的逐步实验方案（图2) 使用市售的 PRIMO 系统及配套的 Leonardo 软件。我们展示了如何利用该系统生成具有特定几何形状和多种蛋白质的图案，并用于研究轴突导向。我们还讨论了可能出现的常见问题及其避免方法。

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 蛋白标记试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A10235</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>Alexa 647 蛋白标记试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A20173</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>CAD 细胞</td><td>ECACC</td><td>8100805</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>偶联的纤维蛋白原-488</td><td>Molecular Probes</td><td>F13191</td><td>工作浓度：10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜**</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti 倒置显微镜</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F4759</td><td>工作浓度：10 &amp;mu;g/ml&lt;br/&gt;（使用 Alexa 488 蛋白标记试剂盒标记后，见上文）&lt;br/&gt;（用 PBS 稀释）</td></tr><tr><td>Fiji-Image J</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.imagej.nih.gov&quot; target=&quot;_blank">www.imagej.nih.gov&lt;/a&gt;</td><td>版本 2.0.0-rc-54/1.51f</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>荧光高亮笔</td><td>Stabilo</td><td>Stabilo Boss Original</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>工作浓度：1M</td></tr><tr><td>Inkscape 软件</td><td>Inkscape</td><td>查看最新更新</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>层粘连蛋白-红色荧光罗丹明</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>LMN01</td><td>工作浓度：10 &amp;mu;g/ml&lt;br/&gt;（用 PBS 稀释）</td></tr><tr><td>Leonardo 软件</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>版本 4.11</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>工作浓度：1%</td></tr><tr><td>Micro-manager 软件</td><td>Open imaging</td><td>查看最新更新</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>电动 x/y 载物台</td><td>PRIOR Scientific</td><td>Proscan II</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements AR 4.60.00 64 位（含 Nikon 任务）</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>PBS（不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>工作浓度：1X</td></tr><tr><td>PDMS 模板</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>访问 &lt;a href=&quot;http://www.alveolelab.com&quot; target=&quot;_blank">www.alveolelab.com&lt;/a&gt;</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>PEG-SVA</td><td>Laysan bio, Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>工作浓度：50 mg/ml</td></tr><tr><td>鬼笔环肽 405</td><td>Abcam</td><td>ab176752</td><td>工作浓度：1:1000</td></tr><tr><td>光引发剂（PLPP）</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>Classic PLPP</td><td>工作浓度：14.5 mg/ml</td></tr><tr><td>光引发剂（PLPP 凝胶）</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>PLPP gel</td><td>工作浓度：4.76% 乙醇稀释液</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V)</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS（亦由 Alv&amp;eacute;ole 分销）</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.alveolelab.com&quot; target=&quot;_blank">www.alveolelab.com&lt;/a&gt;</td><td>工作浓度：0.1 mg/ml（用 PBS 稀释）</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html?ProdNo=P4707&amp;amp;Brand=SIGMA">P4707&lt;/a&gt;</td><td>工作浓度：0.01%</td></tr><tr><td>Primo 设备</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.alveolelab.com&quot; target=&quot;_blank">www.alveolelab.com&lt;/a&gt;</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Thermo Fisher</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122&lt;/a&gt;</td><td>工作浓度：1%</td></tr><tr><td>微管蛋白抗 α 抗体</td><td>Abcam</td><td>DM1A</td><td>工作浓度：1:1000&lt;br/&gt; CAD 细胞</td></tr><tr><td>微管蛋白抗 β3 抗体</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td>工作浓度：1:500&lt;br/&gt; DRG 神经元</td></tr><tr><td>紫外胶</td><td>Norland Products</td><td>NOA81</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>1 孔玻璃底培养皿</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>6 孔玻璃底培养皿</td><td>Cellvis</td><td>P06-20-1.5-N</td><td>工作浓度：N.A.</td></tr><tr><td>20x 物镜**</td><td>Nikon</td><td>无相差环（查阅最新目录）</td><td>工作浓度：N.A.&lt;br/&gt; **落射荧光显微镜：图像采集和图案生成在 Eclipse Ti 倒置显微镜（Nikon）上完成，该显微镜耦合 PRIMO 微图案化设备（Alv&amp;eacute;ole），使用 20x 物镜（0.75 S Plan Fluor（无相差环，Nikon））。使用 Nikon 专用的 GFP、mCherry 和 Cy5 滤光片组，荧光光源为 LED（Lumencor），尽管也可使用其他荧光光源和滤光片组。显微镜配备自动 x/y 载物台（PRIOR Scientific），用于多视野图案打印，并配有 Nikon Perfect Focus 以防止焦漂。图像由 Retiga R6（Q-Imaging）相机采集。</td></tr></tbody></table>

利用primo微图案系统研究细胞对细胞外基质蛋白响应的光诱导蛋白质分子吸附

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

细胞能够感知多种细胞外信号，包括细胞外基质的成分和几何结构，而细胞外基质是由细胞自身合成并不断重塑的。本文介绍了一种基于PRIMO系统、利用光诱导蛋白质分子吸附（LIMAP）技术进行图案化的方法，可用于制备单一种类或多种蛋白质组合的微图案化细胞外基质（ECM）基底。该方法能够以微米级分辨率打印ECM图案，并具有优异的可重复性。我们提供了一个逐步操作的实验方案，并展示了该方法如何应用于研究神经元路径导向过程。相较于现有的微打印技术，LIMAP在多组分图案化以及生成任意几何形状或梯度图案方面具有显著优势。该方案可轻松调整，用于研究几乎任何化学成分对细胞命运和细胞行为的影响。最后，我们讨论了实验中可能出现的常见问题及其避免方法。

我们的总体目标是理解细胞如何感知引导轴突定向生长的胞外信号。在此，我们描述了一种光诱导蛋白质吸附技术，该方法可用于生成特定的细胞外基质成分微图案，以研究调控轴突发育和路径选择的具体事件。

利用PRIMO微图案系统研究细胞对细胞外基质蛋白响应的光诱导蛋白质分子吸附

细胞能够感知多种细胞外信号，包括细胞外基质的成分和几何结构，而细胞外基质是由细胞合成并不断重塑的……

微图案化是一种非常强大的工具，因为它能够用于研究细胞对生物化学和生物物理信号的响应，这些信号是细胞在活体生物体内所接触到的。与其他方法相比，此处描述的方法在图案生成方面更具灵活性。例如，它能够以高度的可重复性产生梯度以及多种蛋白质的微图案。我们课题组不仅利用LIMAP研究神经元的路径寻找，还研究其他细胞如何响应影响细胞增殖、分化和迁移的信号。微图形化技术被用于回答细胞生物学中的基本问题。所获得的知识可用于改进再生医学中的现有装置，例如外周神经损伤后的神经修复。首先在数字绘图软件中设计用于图案化的模板。选择图像尺寸为长 1,824 像素、宽 1,140 像素。完成模板设计后，将其保存为 8 位 TIFF 文件。在进行图案化之前，使用等离子清洗机在1,000至1,300毫托的工艺压力和29.6瓦的功率下对表面进行清洁和活化处理，处理时间为1至5分钟。选用底部为玻璃的培养皿，其内孔直径为20毫米，玻璃厚度为0.16至0.19毫米。根据所测试条件的数量，选择六孔板或单孔板。在无菌条件下裁剪PDMS模板，确保其能够贴合内层玻璃底小孔。用无菌镊子移除内层微孔中的填充物，将模板粘附在玻璃孔底部。用PBS配制0.1毫克/毫升的PLL-PEG溶液，并向每个微孔中加入20微升。然后，将培养皿在室温下孵育一小时。孵育结束后，从每个孔中移除15 µL的PLL-PEG，并用20 µL的PBS洗涤五次，注意避免干燥。准备一个微孔用于创建参考图案：从单个孔中移除18 µL PBS，加入5 µL光引发剂，其余微孔中保留PBS。然后，使用荧光标记笔标记一个空的内层玻璃小室。将小室置于物镜上方，调节物镜焦距，直至PRIMO标志和标语“take care of your cells”清晰对焦。随后，记录焦平面的Z位置。为创建参考图案，通过相机利用透射光观察含光引发剂的微孔边缘，并从右侧菜单中选择 ROI 符号。选择 PRIMO 以上传所需的图案模板，该模板将作为设计单元投射到 ROI 上。导航至微孔的边缘区域，选择“锁定”，并调整焦距至校准的 Z 位置。然后，选择“播放”以开始对参考图案进行光刻图案化。用 20 微升 PBS 溶液将参考图案微孔清洗三次，以去除光引发剂。接着，加入 20 微升荧光标记的细胞外基质（ECM）蛋白溶液。将培养皿在室温下孵育10至20分钟，注意保护参照孔免受光照。孵育结束后，移除18 µL蛋白溶液，并用20 µL PBS洗涤孔内三次。使用落射荧光显微镜观察参照图案。通过相机路径调节图案边缘的焦距，并根据最佳焦点记录Z轴位置。该位置将作为后续图案化处理的最佳激光焦点。在无菌条件下，从所有微孔中移除18微升PBS。向每个孔中加入 5 µL 光引发剂，并通过上下吹打混匀。若在同一微孔中进行多种蛋白质的图案化，请同时上传所有所需的图案模板。然后，选择行数、列数和剂量。将模板配置保存为软件中的文件。导航至参考图案生成的区域，调节焦距至最佳Z位置，然后选择“播放”以启动光图案化。随着光图案化完成，设计单元会从红色变为蓝色。用20微升PBS洗涤三次，以去除微孔中的光引发剂。最后一次洗涤后，从每个微孔中移除18微升PBS，并加入20微升细胞外基质（ECM）蛋白溶液。将培养皿在室温下孵育 20 至 30 分钟，注意避光。接着，吸除 15 微升 ECM 蛋白溶液，并用 20 微升 PBS 洗涤微孔三次。为防止交叉结合，在微孔中加入 20 微升 PLL-PEG 或 BSA，然后将培养皿在避光条件下于室温孵育一小时。然后，移除15 µL封闭剂，并用20 µL PBS将所有微孔清洗三次。移除18 µL PBS，向每个微孔中加入5 µL光引发剂，确保光引发剂均匀覆盖整个微孔表面。导航至第一个微孔，并加载先前保存的模板配置。然后，选择第二轮光图案化要构建的图案，注意取消选择第一轮中的图案。光图案化完成后，用 PBS 洗涤以去除 PLPP。接着，加入第二种细胞外基质蛋白溶液孵育 20 分钟，并用 20 微升 PBS 洗涤微孔三次。使用落射荧光显微镜观察并成像所打印的图案。准备接种细胞时，向内层玻璃小室中加入一毫升含细胞的培养基，确保覆盖所有微孔。然后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。为了确保所生成的图案能够精确反映模板，需沿条带及其上方相应的背景区域进行荧光强度测量。可重复地获得宽度范围从20微米到2微米的明确定义的微图案，但在打印宽度为20微米或更宽的特征时，可观察到边缘效应。通过孵育不同浓度的蛋白质，或改变用于切割抗黏附膜的激光剂量，可获得明确定义的蛋白质浓度。激光强度与模板的灰度级别成正比，从而产生紫外光照的梯度。沿梯度条带测量的荧光强度分布，在图案模板中以及在生成的梯度图案中均呈线性。该方案可用于在同一微孔中创建含多种蛋白质的微图案，例如由纤连蛋白水平条带和层粘连蛋白垂直条带构成的十字交叉图案。但必须进行封闭步骤，以防止蛋白质发生交叉结合。所生成的交叉图案随后可用于神经细胞系、CAD细胞或原代神经元、大鼠DRG的细胞实验。在执行本方案时，需牢记最重要的几点：正确校准系统，确保在多次洗涤步骤中微孔不干燥，以及使用适当的参数进行蛋白质孵育和封闭。细胞行为的分析通常涉及显微镜技术，例如荧光显微镜、延时成像和原子力显微镜（AFM）。进一步的表征还可包括其他生物化学方法，例如基因表达谱分析。

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本文描述了一种在人工脂质膜上以高时空精度产生光调控且可逆的蛋白质图案的实验方案。该方法包括在模型膜上对固定化的蛋白质iLID（改进型光诱导二聚体）进行局部光激活，在蓝光照射下，iLID可与其伴侣蛋白Nano（野生型SspB）结合。...

模型膜上动态光诱导蛋白图案

了解光诱导分子吸附技术如何创建细胞外基质蛋白微图案，用于研究神经元轴突生长和导向机制。该方法为神经再生医学中的神经修复策略提供了重要的实验基础。

利用PRIMO微图案系统研究细胞对细胞外基质蛋白响应的光诱导蛋白质分子吸附

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