用于肝癌中SUMO蛋白组富集、分离、鉴定与表征的SUMO结合元件（SUBEs）工具

SUMO结合实体使得在体内分离内源性SUMO化蛋白成为可能。由于体内存在活性的SUMO特异性蛋白酶以及SUMO化蛋白所占比例较低，这一过程具有较大挑战性。利用SUMO结合实体分离SUMO化蛋白质组的优势在于，其可提高对SUMO底物的整体亲和力。

这是因为SUBEs常见于包含多个SIM串联重复序列的蛋白质中，从而能够特异性识别修饰蛋白上的SUMO分子。利用SUMO结合元件分离和表征肝癌中SUMO化蛋白质组是一种快速且灵敏的方法。该方法为深入了解SUMO化通路在肝癌中尚未明确的作用及其潜在的治疗应用提供了重要信息。

SUMO结合实体可用于分离和表征肝组织以外其他组织中的SUMO化蛋白质组，适用于人体样本、动物模型以及多种细胞模型。尽管该技术易于操作，但在同时分析多个样本时应谨慎对待，需注意实验过程中涉及的多个步骤对低温环境的要求。

因此，我们建议在启动本实验前仔细将离心管平衡调平。使用SUMO结合实体的可视化演示有助于推动该方案的革新，尤其是考虑到操作过程中微小部件的处理困难以及材料在实验流程中的损失问题。人肝癌细胞先前已通过将细胞以每皿120万至150万个细胞的密度接种于P100培养皿中进行制备，并在37°C条件下置于标准生长培养基中进行培养。

当准备使用细胞时，吸除培养板中的培养基，并用5毫米的无菌PBS洗涤细胞。将培养板置于冰上，加入500微升裂解缓冲液，缓冲液成分需根据文稿说明进行补充。然后用细胞刮棒轻轻将细胞从培养板底部刮入裂解液中。

或者，通过胰酶消化收集细胞，向培养板中加入一毫升胰酶-EDTA溶液，确保完全覆盖细胞。将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育五分钟，使细胞从培养板上脱落，随后加入两毫升预热的生长培养基以终止胰酶消化。在150 × g 条件下离心细胞10分钟，并吸除上清液。

然后用 PBS 洗涤细胞，并再次离心 10 分钟。吸除上清液，加入 500 微升裂解缓冲液。在 15000 ×g 及 4°C 条件下离心裂解后的细胞 10 分钟，然后将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。

当需要使用收获的小鼠肝脏时，将75毫克新鲜或液氮速冻的组织碎片在1毫升预冷的裂解缓冲液中进行匀浆。按照文章所述方法操作匀浆器。组织匀浆完成后，在4°C条件下以15000 × g离心10分钟。

将上清液转移至新的离心管中，并弃去沉淀。通过向70毫克谷胱甘肽琼脂糖珠中加入1毫升去离子水，并在4°C下重悬过夜，以进行预处理。珠子溶胀后，用10毫升去离子水或PBS洗涤三次，每次洗涤后以300 × g离心5分钟。

洗涤后，将珠子重悬于1毫升PBS中，为每份样品制备50%的悬液，其中含有100微克GST-SUBEs或GST对照蛋白，加入100微升谷胱甘肽珠悬液和500微升PBS。4摄氏度下旋转孵育混合物至少2小时，然后在300 × g下离心5分钟回收珠子，并将其重悬于PBS中。取先前制备的细胞裂解液的10%，用等体积的3X煮沸缓冲液稀释。

将450微升澄清裂解液加入100微升谷胱甘肽珠悬浮液中。在4°C下缓慢旋转孵育至少2小时。孵育结束后，在300 × g离心5分钟沉淀珠子，并收集上清液用于分析。

将总体积的10%转移至一个单独的离心管中，并加入等体积的3X煮沸缓冲液。用1毫升冰冷的含0.5%吐温20的PBS洗涤剩余样品三次，每次在300 × g、4°C条件下离心1分钟。小心吸除上清液，确保无液体残留。

然后用15微升3倍浓度的煮沸缓冲液和15微升裂解缓冲液洗脱样品。根据论文中的说明进行Western印迹分析。若进行质谱分析，使用Stage-Tip C18微柱对肽段进行脱盐处理，并在分析前将其重悬于0.1%甲酸溶液中。

将样品上样至液相色谱-质谱（LC-MS）系统，并进行三针重复分析。使用配套软件进行蛋白质鉴定和丰度计算。根据文章所述方法进行统计分析。

本实验方案已用于分离甘氨酸 N-甲基转移酶缺乏的小鼠中发生 SUMO 修饰的蛋白质，该缺乏可导致自发性肝癌的发生，同时包括其野生型同窝小鼠。对 SUBE 拉下实验的输入样本、穿流组分及结合组分进行了 Ponceau S 染色。利用 SUBE 捕获的 LKB1 的 Western 印迹分析显示，肝肿瘤中 LKB1 的 SUMO 化水平升高。

采用人肝癌细胞和非转化的肝上皮细胞来研究SUMO捕获系统（SUMO-trap）与天然SUMO化蛋白相互作用的能力。首先，使用常规蛋白质染色方法来显示被SUBE捕获的全部物质。随后质谱分析表明，在肝癌细胞的SUBE样本中富集了742种蛋白质，在非转化肝上皮细胞的SUBE样本中富集了577种蛋白质。

在使用SUBE进行实验时，重要的是将细胞和组织保持在冰上，并向裂解缓冲液中加入特定毫升数，以维持SUMO化蛋白的纯度。通过SUBE对SUMO化蛋白质组进行可视化后，我们可以利用Western印迹分析或质谱法对其进行表征。将SUBE应用于分离和表征肝癌组织及肝癌细胞中的SUMO化蛋白质组，为探索SUMO在肝癌中翻译后修饰的作用奠定了基础，可能提供潜在的治疗机制。