人体脂肪组织微片段化用于细胞表型分析与分泌组表征

利用该系统，我们可以获取亚毫米级的人类脂肪组织簇，其中再生细胞的整个微环境均保持完整。整个微血管系统也保持完整，因此可将此类微型器官用于体内移植、体外培养，以及细胞分离以进行进一步表征。该系统在科研实验室中应用的主要原理在于整个过程完全无需使用酶，因而能够在维持组织微结构的同时，快速高效地处理人类脂肪组织，并确保组织的微血管系统完全完整。

因此，我们可以直接研究一种已在临床实践中证明非常有效的细胞治疗产品。这种封闭式系统技术是一种易于使用的术中技术，可用于采集、处理并重新注射提纯的脂肪组织，可成功应用于整形外科、骨科、肛肠科以及妇科领域。该方法有助于进一步研究脂肪在组织再生中的作用。

该操作将由博士后研究员Bianca Vezzani和博士生Mario Gomez-Salazar演示。在无菌条件下，于获取组织后16小时内，将腹壁成形术样本置于手术布上，皮肤面朝上。使用一次性组织灌注套管，向皮下脂肪组织内注射50至100毫升、37°C的0.9%氯化钠溶液。

将一个10毫升带鲁尔锁的注射器连接到一次性吸脂套管上，抓住样本边缘附近的皮肤区域，小心地将套管插入脂肪组织中。套管进入组织后，抽出活塞，并在脂肪组织样本内径向移动套管。在进行吸脂操作时，必须稳固地处理脂肪组织。

如果收集的脂肪量不足，可考虑进行额外的生理盐水注射。当注射器充满脂肪抽吸物后，小心地将套管从组织中取出，并用新的空注射器替换已装满的注射器，直至总共收集60毫升抽吸物。进行脂肪抽吸物微片段化处理时，从包装中取出装置，并确认主机单元已连接至废液袋。

将废液收集袋放置于地面，并确保阀门已固定在处理装置的盖帽上。刺破收集袋的连接口，将输液管末端的穿刺针插入生理盐水袋中，并将生理盐水袋置于高于处理装置的位置。确认连接在管路电路上的全部五个夹钳均处于打开状态，将处理装置垂直放置，使生理盐水溶液充满处理装置，并确认液体流已到达废液袋。

轻轻摇动处理单元以去除可能存在的气泡，并将该单元垂直放置，蓝色帽端朝上。关闭靠近进样管路的夹子，将装有脂肪抽吸物的注射器连接到蓝色进样帽的自闭合阀门上，开始注入脂肪抽吸物。保持处理单元垂直状态，缓慢推动注射器推杆，直至所有脂肪抽吸物完全转移至单元内。

当全部脂质抽吸物注射完毕后，打开进液夹以恢复生理盐水流速，并用力振荡处理单元至少两分钟，同时定期检查生理盐水流入废液袋的情况。当处理单元内的生理盐水变为透明时，将处理单元放置为灰色帽朝上，并关闭位于蓝色和灰色帽附近排水管上的夹子。处理后的组织将漂浮在顶部。

接下来，用生理盐水溶液填充一支10毫升的鲁尔锁型注射器，并将该注射器连接到蓝色帽盖的加载阀上。将一支10毫升的空鲁尔锁型注射器（活塞完全插入）连接到灰色帽盖的阀门上。从蓝色帽盖处将生理盐水牢固地注入处理单元，同时观察连接在灰色阀门上的注射器是否随之逐渐充满经处理的组织。

当所有生理盐水注射完毕后，小心移除两支注射器，并重复生理盐水灌注，直至收集完全部处理后的组织。处理结束后，移除所有注射器，关闭所有夹子，取下生理盐水袋，并根据当地规程处置装置。当所有处理后的组织收集完毕后，将微片段化的脂肪组织转移至无菌容器中，并向容器中加入等体积的消化液。

将密封容器置于37摄氏度、120转/分钟的摇动水浴中，孵育45分钟，孵育结束时加入等体积的封闭液终止消化反应。依次过滤样品，先通过100微米细胞筛，再通过70微米细胞筛，然后将滤过的悬液在200 × g离心5分钟。将沉淀物重悬于约5毫升红细胞裂解缓冲液中，在室温下孵育15分钟。

用等体积的封闭液终止裂解，并通过40微米细胞筛过滤溶液。然后通过离心收集微片段化的脂肪组织细胞，并将沉淀重悬于新鲜封闭液中，涡旋混匀后进行细胞计数。在解离和抗体染色后，可将微片段化脂肪细胞上机流式细胞仪进行细胞分析和/或分选。

手动脂肪抽吸物的机械解离可产生微片段化脂肪组织，该组织由包绕着微血管网络的脂肪细胞聚集体构成。对冷冻固定的微片段化脂肪组织中包埋的明胶进行免疫荧光分析，可清晰显示其结构：内皮细胞标志物荆豆凝集素1受体（Ulex Europaeus Agglutinin 1 receptor）标记出主要由小毛细血管样结构组成的血管网络。值得注意的是，表达神经胶质抗原2（neuron-glial antigen 2）或血小板源性生长因子受体β（platelet-derived growth factor receptor beta）的周细胞呈正常分布，包绕于内皮细胞周围。

通过排除 CD31 阳性的内皮细胞和 CD45 阳性的造血细胞，可在脂肪组织（MAT）中鉴定出 CD146 阳性而 CD34 阴性的周细胞，以及 CD146 阴性而 CD34 阳性的外膜细胞。手动脂肪抽吸是该操作的关键步骤，必须在腹壁成形术后不超过 16 小时内以无菌条件进行。微片段化的脂肪组织可进一步通过免疫组织化学染色、体外培养或分泌组分析进行处理，以更深入地了解脂肪组织生物学特性。

该技术能够以类似小型类器官的形式，在天然的三维结构中研究多种组织，这些组织体积足够小，可移植到小鼠体内或进行长期培养。我们主要利用该系统对不同器官特异性的微环境进行实验性研究。我们的脂肪组织供体未被发现携带可传播的感染性疾病。

然而，在没有任何进一步筛查的情况下，所有人体组织都应被视为可能受到污染，并相应地进行处理。