生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

在诱导干细胞来源的心肌细胞时，可重复性是一个主要关注点。利用这些方法，可以从诱导性多能干细胞（iPS）高效地生成高纯度、高质量的心肌细胞，用于功能研究。该技术的主要优势在于，它是一种简单、可靠、经济高效且极为强大的方法，可用于获得纯化的高质量iPSC来源心肌细胞制备物。

进行细胞传代时，先用一毫升不含钙和镁的 PBS 清洗细胞，作用时间为七到十分钟，然后弃去 PBS，加入一毫升传代培养基。使用细胞刮轻轻刮下培养孔底部的细胞，并用无菌的两毫升玻璃移液管通过机械方式将脱落的细胞分散。在显微镜下观察到细胞以小细胞团的形式脱落时，加入传代培养基，按 1:6 的比例进行细胞传代。

接下来，从六孔板中吸除适用于人胚胎干细胞的基质。然后向每孔加入1毫升传代培养基和1毫升解离的细胞，并让细胞生长至达到70%至80%汇合度，随后开始心肌分化。在解离iPSC-CMs前至少30分钟，用70%乙醇擦拭单独的玻璃盖玻片，并将盖玻片放入无菌六孔板的各个孔中。

当盖玻片干燥后，将 250 至 300 微升人胚胎干细胞合格基质溶液直接加到每张盖玻片的中央，并将六孔板放入组织培养罩内。为解离经代谢筛选的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM），在每个孔中加入 1 毫升无菌的含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶，于 35 摄氏度孵育 5 分钟，并使用 1000 微升移液器进行机械性吹打，直至形成单细胞悬液。将细胞吸入无菌的 15 毫升锥形管中，并用每孔 2 毫升 RPMI 20 培养基洗涤每个孔。

然后将洗涤液加入离心管中，通过离心沉淀细胞。用适量培养基重悬细胞，使细胞浓度达到每250微升含3×10⁵个细胞。使用1000微升移液枪头充分吹打，使细胞解离至溶液呈现均匀状态。

然后用1000微升移液枪头吸取250微升细胞，缓慢将全部液体滴加至一张人胚胎干细胞专用基质包被的编码盖玻片上。所有细胞接种完成后，将培养板小心放入细胞培养箱中过夜。次日早晨，向每孔轻柔加入2毫升D7培养基。

当所选的iPSC-CMs培养至至少三个月时，在37摄氏度条件下用2微升Fura-2 AM处理细胞10分钟，并启动钙成像分析系统。开启ArcLamp，将泵的管路连接至相应的入口和出口，将刺激器的电子导线连接至记录舱，然后将记录舱放置于系统上。

用37摄氏度预热的Tyrode溶液填充穿过流体在线加热器的ProFusion管，并调整相机和框架光圈尺寸以最小化背景区域。将接种有iPSC-CMs的玻璃盖玻片固定到腔室中，然后轻轻在盖玻片上方直接加入500微升Tyrode溶液。以每分钟1.5毫升的流速开始向腔室灌注Tyrode溶液，并使用电刺激器以每4毫秒10伏特的1赫兹场刺激对iPSC-CMs进行起搏，持续3至5分钟。

当所有染料均已被洗脱出腔室后，调整观察视野至盖玻片的左上区域，并开始记录。在采集到连续稳定的5至10个峰信号后，点击暂停以暂时停止记录，移动显微镜载物台至盖玻片另一端相邻区域，然后继续记录。以相同方式在10分钟内扫描整个盖玻片上的钙瞬变信号后，根据制造商的说明，使用适当的荧光轨迹分析软件对数据进行分析。

本方案可生成高纯度的心肌细胞，这些细胞在培养过程中随时间推移逐渐获得心室样、成年型表型。通过心房和心室肌球蛋白轻链2（MLC2）亚型的免疫荧光染色评估，在诱导心脏分化第30天时，本方案产生的大多数细胞呈心房MLC2亚型阳性，而心室MLC2亚型在同一时间点表达量则较低。

随着培养时间的延长，可观察到向MLC2亚型的完全转换。这些结果也通过流式细胞术对表达心房和心室MLC2标志物的细胞百分比进行定量分析得以证实。在第90天，iPSC-CMs的钙振幅显著增加，与成年大鼠CMs中观察到的情况相似。

需要注意的是，在分化过程中，污染的非心肌细胞可能会影响人iPSC-CMs的功能成熟。此外，在记录iPSC-CMs的钙瞬变时，必须让细胞在37°C下持续刺激至少200秒以达到稳定状态，并将记录限制在特定时间窗口内，以确保结果的可重复性。请务必确认iPSCs呈现均一的形态，并在启动心肌分化前让细胞生长至70%至80%的融合度。

不成熟iPS来源的心肌细胞若纯度不高或质量不佳，可能表现出改变的功能特性，这些特性并不能反映真实表型，却可能被误判为疾病表型。因此，获得高纯度且高质量的心肌细胞对于获得一致且可重复的实验结果至关重要。