Name: 生成心室样HiPSC衍生的心肌细胞和用于钙处理特征的高质量细胞制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 了解从人诱导多能干细胞生成高纯度心肌细胞的方法，用于心脏疾病建模和药物筛选。该技术简单可靠，可获得具有心室样表型的优质细胞制剂。

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本研究由美国心脏协会（AHA）科学家发展基金 17SDG33700093（F.S.）；西奈山临床与转化研究职业发展 KL2 学者奖 KL2TR001435（F.S.）；美国国立卫生研究院（NIH）R00 HL116645 基金及 AHA 18TPA34170460（C.K.）资助。

本研究中使用成年大鼠心肌细胞的实验均按照西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。成年大鼠心肌细胞通过基于Langendorff的方法从小鼠Sprague Dawley大鼠心脏中分离，具体方法如前所述16。
1. 培养基的制备
<ol>
	<li>准备 hiPSC 培养基。
	<ol>
		<li>将添加剂和基础培养基平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 400 mL 基础培养基与 100 mL 添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 RPMI + B27 培养基。
	<ol>
		<li>将 B27 添加剂和基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备不含胰岛素的 RPMI + B27 培养基（RPMI + B27 (-) insulin）。
	<ol>
		<li>将不含胰岛素的 B27 添加剂和基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备筛选培养基（无葡萄糖 RPMI + B27 + 乳酸盐）。
	<ol>
		<li>将 B27 添加剂和基础培养基（无葡萄糖 RPMI 1640）平衡至室温（RT）。确保添加剂已完全解冻。取 490 mL 基础培养基与 10 mL 50 倍浓缩添加剂混合，加入用无菌水配制的 4 mM 乳酸钠，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤。4 °C 保存，使用前平衡至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 RPMI 20 培养基。
	<ol>
		<li>将基础培养基（RPMI 1640）平衡至室温（RT）。将胎牛血清（FBS）（终浓度 20%）与 RPMI 混合，使用 0.22 μm 真空驱动滤器过滤，4 °C 保存。使用前平衡至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过向 hiPSC 培养基中添加 Rho 相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂（终浓度 2 μM），制备传代培养基。</li>
	<li>通过向不含胰岛素的 RPMI + B27 培养基中添加 GSK-3 抑制剂 CHIR 99021（终浓度 10 μM），制备 D0 培养基。</li>
	<li>通过将不含胰岛素的 RPMI + B27 培养基与 IWR-1（终浓度 5 μM）混合，制备 D3 和 D4 培养基。 
	注：D1 和 D5 培养基由不含胰岛素的 RPMI + B27 组成；D7 培养基由 RPMI + B27 组成。</li>
	<li>制备封闭缓冲液（含 2% 牛血清白蛋白 [BSA]、2% FBS 和 0.05% NP-40 的磷酸盐缓冲液 [PBS]）：在 50 mL 锥形管中加入 1 g BSA、1 mL FBS、49 mL PBS 和 250 μL NP-40，搅拌至完全溶解。</li>
</ol>
2. 人胚胎干细胞（hESC）专用基质包被培养板和盖玻片的制备
注意：所有步骤均须在无菌的组织培养罩内进行。
<ol>
	<li>将hESC专用基质工作液在4 °C条件下冰上过夜解冻。参考产品说明书确定合适的分装体积，因为不同批次可能有所差异。将分装后的基质储存于-20 °C的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>为用于包被培养板或玻璃盖玻片，首先在4 °C条件下解冻一份hESC专用基质30分钟。</li>
	<li>将24 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）: 营养混合物F-12（DMEM/F:12）移入50 mL锥形管中。</li>
	<li>使用一支2 mL玻璃移液管混合冷的DMEM/F:12培养基，以使移液管表面冷却。</li>
	<li>使用同一支移液管吸取约500−700 μL冷的DMEM/F:12，并在离心管内与hESC专用基质分装液充分混合。</li>
	<li>充分混匀后，将混合液转移至含有冷DMEM/F:12的50 mL锥形管中，再次混匀。</li>
	<li>对于标准6孔板，每孔加入1 mL上述混合液，确保完全覆盖孔底。将培养板置于超净台内室温（RT）环境中静置至少30分钟。如需储存，可在包被后立即置于4 °C保存最多1周，使用前于室温平衡30分钟。</li>
	<li>使用前，吸除基质溶液，并替换为适当的培养基。立即使用。</li>
	<li>将玻璃盖玻片存放于无菌环境中（例如，置于无菌细胞培养超净台内）。</li>
	<li>包被前，用70%乙醇逐个擦拭每片盖玻片。待盖玻片干燥后，将其放入无菌6孔板的孔中。</li>
	<li>取250−300 μL hESC专用基质溶液，小心地直接滴加至玻璃盖玻片中心。在使用前，将盖玻片置于超净台内室温环境中静置至少30分钟。</li>
</ol>
3. 小分子的制备
注意：除非另有说明，所有小分子和 Wnt 调节剂均用 DMSO 重悬。
<ol>
	<li>准备 IWR-1 和 CHIR 99021，每份 25 µL，浓度为 10 mM，分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>重悬 Thiazovivin（ROCK 抑制剂），每份 50 µL，浓度为 10 mM，分装后于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
4. iPSC 的维持与传代
注意：以下所有步骤均须在无菌细胞培养罩内进行。
<ol>
	<li>将iPSCs维持在标准的6孔板中，并在无菌条件下进行所有操作。每孔加入2 mL hiPSC培养基进行细胞培养，每隔一天更换一次培养基。将细胞置于37 °C、6% O2、5% CO2的环境中培养。当细胞融合度达到70−80%时进行传代。</li>
	<li>将不含Ca2+和Mg2+的PBS平衡至室温。</li>
	<li>开始传代操作时，向需要传代的孔中加入1 mL不含Ca2+和Mg2+的PBS，室温孵育7−10分钟。在显微镜下观察细胞，确保PBS处理未导致单层细胞完全解离。</li>
	<li>吸除PBS，每孔加入1 mL传代培养基。使用细胞刮轻轻刮取并使细胞从孔壁表面脱落。</li>
	<li>使用无菌的2 mL玻璃移液管通过机械方式解离细胞。重复操作，直至在显微镜下观察到细胞均匀地分散为小细胞团。</li>
	<li>当细胞充分解离后，加入5 mL传代培养基，按1:6比例进行分瓶。可根据所需的分瓶比例调整传代培养基的添加量。</li>
	<li>吸除hESC认证基质包被板中的hESC认证基质，每孔加入1 mL传代培养基。每孔加入1 mL已解离的细胞悬液。</li>
</ol>
5. 心肌细胞分化
<ol>
	<li>使用已建立良好（传代超过20代）且呈现均一形态的hiPSC细胞系，在开始心肌分化前进行评估。</li>
	<li>确保iPSCs的融合度在70−80%左右。</li>
	<li>用不含 Ca 的 PBS 洗涤细胞 1 次2+ 和 Mg2+.</li>
	<li>每孔加入 2 mL D0 培养基（步骤 1.7），将细胞放回培养箱中。</li>
	<li>24小时后，每孔更换为3 mL D1培养基，继续培养48小时。</li>
	<li>第3天，每孔更换为2 mL D3培养基。第4天用D4培养基重复操作。</li>
	<li>第5天，每孔更换为3 mL D5培养基。</li>
	<li>第7天，每孔更换为3 mL D7培养基，并转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中2，以及正常的O2 浓度。每2天更换一次D7（RPMI + B27）培养基。</li>
</ol>
6. 筛选流程与iPSC-CM解离
<ol>
	<li>在进行 Ca2+ 瞬变测量或任何功能分析前 10 天，每孔加入 3 mL 筛选培养基，替换 RPMI + B27 培养基，持续 48 小时。</li>
	<li>再次更换为每孔 3 mL 筛选培养基，继续培养 48 小时。</li>
	<li>每孔更换为 2 mL RPMI + B27 培养基，培养 24 小时。</li>
	<li>按照第 2 节所述方法包被标准 6 孔板。</li>
	<li>每孔加入 1 mL 无菌的含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用 1,000 μL 移液器机械性吹打细胞，直至在显微镜下可见单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞转移至无菌的 15 mL 圆底离心管中，每孔加入 2 mL RPMI 20 培养基。在 800 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于 RPMI + B27 培养基中。吸除培养板中的 hESC-合格基质，并更换为每孔 1 mL RPMI + B27 培养基。</li>
	<li>使用 1,000 μL 移液器枪头机械性吹打细胞沉淀，直至溶液呈现均一状态。</li>
	<li>将约 500,000 个细胞转移至每孔。将培养板放入培养箱中培养 24 小时。</li>
	<li>每孔更换为 3 mL 筛选培养基，培养 48 小时。</li>
	<li>每孔更换为 3 mL RPMI + B27 培养基。将细胞维持在 D7 培养基（RPMI + B2）中，每 2 天更换一次培养基，直至可用于功能分析。</li>
</ol>
7. 流式细胞术用iPSC-CMs的制备
<ol>
	<li>当细胞达到所需年龄并完成代谢筛选（第6节）后，用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>每孔加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶，于 37 °C 培育 5−7 分钟。</li>
	<li>使用 P1000 枪头将混合液吹打 5−10 次以分散细胞，然后转移至含有 2 mL RPMI 20 的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>以 600 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 100 µL 固定液（4% 多聚甲醛），在持续轻柔涡旋条件下逐滴加入，随后置于冰上 15 分钟。</li>
	<li>加入 1.5 mL PBS，通过离心收集细胞，并吸除上清液。</li>
	<li>每次实验均需为每种固定/通透条件设置一个未染色对照样本。</li>
	<li>将细胞重悬于 500 µL 封闭液（含 0.1% NP-40 的 PBS 中添加 2% FBS 和 2% BSA）中，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>不移除封闭液，直接加入初级抗体 MLC2V/MLC2A（5 mg/mL），于室温孵育 45 分钟。</li>
	<li>用封闭缓冲液洗涤，离心收集细胞，并吸除液体。</li>
	<li>加入用封闭缓冲液稀释的二抗 Alexa Fluor 555/488（1:750），于室温孵育 45 分钟，或 4 °C 过夜。</li>
	<li>加入 1.5 mL PBS，离心收集细胞，并吸除液体。</li>
	<li>将细胞重悬于 250−300 µL PBS 中，使用 P1000 移液器吹打以进一步分散细胞。</li>
	<li>准备带有 35 µm 尼龙网细胞筛帽的圆底管，用 50 µL PBS 预先润湿细胞筛，并将管置于冰上。</li>
	<li>将含有分散细胞的溶液转移至带细胞筛帽的圆底管中，让细胞溶液自然滤过，必要时轻敲管底以确保完全滤出并收集细胞至管中。操作后应尽快将管放回冰上。</li>
	<li>用 250 µL PBS 冲洗细胞筛，以回收残留细胞。</li>
	<li>将管保持在冰上，并用铝箔包裹，直至进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
8. 将心肌细胞接种到玻璃盖玻片上
注意：所有步骤均须在无菌环境中进行。
<ol>
	<li>按照步骤 2.10 和 2.11 所述方法准备玻璃盖玻片。</li>
	<li>当诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）已被筛选并达到所需培养时间后，按照步骤 6.5−6.7 将 iPSC-CMs 进行解离。</li>
	<li>吸除上清液，并用适量 RPMI 20 培养基重悬细胞，使每 250 μL 溶液中约含 300,000 个细胞。</li>
	<li>使用 2 mL 玻璃移液管，机械性地解离细胞沉淀，直至溶液呈现均匀状态。</li>
	<li>吸除盖玻片上的适用于人胚胎干细胞（hESC）的基质材料。</li>
	<li>使用 1000 μL 移液器，从 15 mL 锥形管中混匀并吸取 250 μL 溶液。</li>
	<li>缓慢将 250 μL 溶液滴加至玻璃盖玻片上，特别注意仅将溶液加至含有适用于 hESC 的基质涂层的区域。</li>
	<li>小心转移至培养箱中过夜，注意避免震荡或使盖玻片上的细胞扩散。次日早晨，每孔轻轻加入 2 mL D7 培养基（RPMI + B27）。24 小时后更换培养基，之后每两天更换一次。</li>
</ol>
9. 细胞固定
<ol>
	<li>确保将足量含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 平衡至 4 °C。</li>
	<li>用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，并平衡至 4 °C。</li>
	<li>当 iPSC-CMs 达到适当培养时间、完成代谢筛选（第 6 节）并接种于盖玻片上（第 8 节）后，每孔用 1 mL 冷的含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞 3 次。</li>
	<li>加入 1 mL 冷的 4% PFA，将细胞置于通风橱中室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>用冷的 PBS 洗涤细胞，以去除多余的 PFA。</li>
	<li>加入 2 mL 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS，并于 4 °C 保存。</li>
</ol>
10. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>移除固定细胞中的 PBS，加入 1 mL 封闭缓冲液，在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>移除封闭缓冲液，加入用封闭缓冲液稀释的一抗（5 mg/mL），在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>加入用封闭缓冲液按 1:1,000 稀释的二抗。</li>
	<li>用铝箔包裹培养板以避光，于室温孵育 45 分钟。后续步骤中继续使用铝箔避光。</li>
	<li>用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>加入足量 DAPI 工作液，完全覆盖细胞，在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 充分洗涤样品，以去除多余的 DAPI。</li>
	<li>取新的载玻片，在中央滴加一滴封片剂，用滴管将封片剂均匀铺开。将带有细胞的盖玻片细胞面朝下置于载玻片上。 
	注意：若避光保存，样品可存放长达 30 天。</li>
</ol>
11. 细胞内 Ca2+ 瞬变的评估
<ol>
	<li>当iPSC-CMs培养至少3个月、已完成代谢筛选（第6节）并接种于盖玻片上后，加入2 μL Fura-2, AM（终浓度：1 μM），在37 °C孵育10分钟。 
	注意：Fura-2对光敏感。所有染料加载操作及实验均需在避光条件下进行。</li>
	<li>准备钙离子与收缩力采集及分析系统。
	<ol>
		<li>启动系统电源，确保弧光灯已开启（图1B）。</li>
		<li>将灌流 chamber 置于系统上，将泵的管路连接至相应的进液口和出液口，并将刺激器的电线按 图1C 所示连接至 chamber。</li>
		<li>用预热至37 °C的Tyrode溶液填充流体在线加热器中的灌流管路。</li>
		<li>调整相机和成像孔径尺寸，以最小化背景区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将带有iPSC-CMs的玻璃盖玻片装入 chamber 并固定。</li>
	<li>轻轻在固定好的玻璃盖玻片上方直接加入500 μL Tyrode溶液，并开始以1.5 mL/min的速度向 chamber 灌流Tyrode溶液。</li>
	<li>使用电刺激器以1 Hz频率进行场刺激（10 V，4 ms），刺激iPSC-CMs。</li>
	<li>在持续刺激条件下，使iPSC-CMs在 chamber 中孵育至少3−5分钟，以充分洗去Fura-2染料并适应环境，同时清除残留荧光染料。</li>
	<li>将观察窗口调整至盖玻片的左上区域。</li>
	<li>开始记录。</li>
	<li>在获得连续稳定的5−10个峰信号后，点击 暂停 以暂时停止记录。</li>
	<li>确保焦点和观察窗口尺寸未发生改变，移动显微镜载物台至相邻区域，向对侧方向移动，然后恢复记录。</li>
	<li>重复步骤11.9和11.10，以锯齿形方式扫描整个盖玻片区域，先向左移动，再向下移动，覆盖整个盖玻片。每张盖玻片共进行80−100次测量。 
	注意：总测量时间应限制在10分钟以内，因次级因素会导致Ca2+瞬变信号减弱。</li>
	<li>完成Ca2+瞬变信号采集后，根据制造商说明，使用荧光轨迹分析软件对数据进行分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用人iPSC-CMs作为实验模型的关键步骤包括：1）生成高质量的心肌细胞（CMs），以确保实验性能的一致性和结果的可重复性；2）在培养中使细胞成熟至少90天，以充分评估其表型；3）进行电生理学研究，例如钙离子（Ca2+）瞬变测量，以提供对人iPSC-CMs具有生理相关性的功能表征。我们开发了一种基于单层培养的分化方法，可产生高质量的类心室样iPSC-CMs。该方法依赖于多个关键因素，是现有方案14,18的一种改进。与其他方案不同，本方法在iPSCs的维持及其向CMs分化的第一周均采用低氧条件（5% O2）。低氧环境模拟了胚胎和胎儿心脏发育过程中的生理条件19。已有研究表明，缺氧条件还可促进iPSCs的增殖及其后续向CMs的分化20。接种密度和iPSCs的正确传代也是成功进行心脏分化的关键因素。当70−80%汇合度的iPSCs使用无酶溶液解离为小细胞聚集体，并以1:6的传代比例接种时...

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）是一种极具吸引力的基于人类细胞的体外平台，可用于模拟多种心脏疾病1,2,3,4,5,6,7,8。此外，iPSC-CMs还可用于预测患者对新药或现有药物的反应，筛选候选化合物，并开发新的个体化药物9,10。然而，尽管已取得显著进展，在使用iPSC-CMs时仍需考虑若干局限性和挑战11。因此，研究人员已深入探索了多种改进心脏分化方案、提高iPSC-CMs的效率与成熟度以及生成特定心肌细胞亚型（心室型、心房型和结节型）的方法，并已提出大量培养策略以克服这些障碍12,13,14,15。
尽管这些方案具有较强的稳健性，但使用iPSC-CMs的一个主要问题是获得高质量心肌细胞的长期且复杂操作流程的可重复性，而高质量细胞是确保实验性能一致和结果可重复的关键。可重复性不仅在比较具有不同遗传背景的细胞系时至关重要，在对同一细胞系重复进行细胞和分子水平比较时也同样重要。细胞间的变异性，例如iPSCs在不同孔之间的密度差异，可能影响心脏分化过程，导致心肌细胞产量低、质量差。这些低质量细胞仍可用于不需要纯心肌细胞群体的实验（例如进行Ca2+瞬变测量时）。实际上，在进行电生理分析时，非心肌细胞无论在自发活动或电刺激下均不会搏动，因此容易将其排除在分析之外。然而，由于细胞质量较差，iPSC-CMs可能表现出异常的电生理特征（如不规则的Ca2+瞬变、Ca2+振幅降低），而这些异常并非由其遗传背景所致。因此，在利用iPSC-CMs构建心脏疾病模型时，尤其需要注意避免将低质量心肌细胞产生的结果误判为疾病表型。在开展电生理研究之前，必须进行严格的筛选和排除流程。
本方法包含优化的实验方案，用于生成高纯度和高质量的心肌细胞，并通过使用钙离子和收缩力采集与分析系统进行Ca2+瞬变检测，以评估其功能。该技术是一种简便而强大的方法，可用于区分高效与低效的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）制备，并对人源iPSC-CM提供更具生理相关性的功能表征。

<table><tbody><tr><td>抗肌动蛋白，&amp;alpha;-平滑肌抗体，小鼠单克隆</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗兔</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>不含胰岛素的 B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 核染色剂</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-谷氨酰胺 + 15 mM Hepes</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>双头细胞刮刀，平刃和J型钩</td><td>Celltreat</td><td>229306</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 多孔组织培养板，6 孔</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>流体在线加热器</td><td>Live Cell Instrument</td><td>IL-H-10</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>人胚胎干细胞合格基质</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel 基质</td></tr><tr><td>人多能干细胞培养基</td><td>Gibco</td><td>A33493-01</td><td>StemFlex 基础培养基</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>活细胞成像室</td><td>Live Cell Instrument</td><td>EC-B25</td><td></td></tr><tr><td>MLC-2A，小鼠单克隆抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>311011</td><td></td></tr><tr><td>心肌细胞钙离子与收缩力检测系统</td><td>Ionoptix</td><td>ISW-400</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白轻链2抗体，兔多克隆（MLC2V）</td><td>Proteintech</td><td>10906-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>带PES膜的Nalgene快速流动一次性无菌过滤装置</td><td>ThermoFisher</td><td>124-0045</td><td></td></tr><tr><td>含钙和镁的PBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>优质玻璃盖玻片</td><td>Lab Scientific</td><td>7807</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（无 D-葡萄糖）(1X)</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>钠-L-乳酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex 添加剂</td><td>Gibco</td><td>A33492-01</td><td></td></tr><tr><td>噻唑紫定</td><td>Tocris</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>台氏液</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BSS-355w</td><td>调节pH至7.2，加入1.2 mM氯化钙</td></tr></tbody></table>

生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）为研究钙离子（Ca2+）调控机制和信号通路的基础科学，以及高通量药物筛选和毒性检测提供了宝贵的人源细胞资源。本文详细描述了用于生成高质量iPSC-CMs的方法学，这些细胞可在不同细胞系之间稳定重现其分子和功能特性。此外，还介绍了一种通过评估Ca2+调控特性来可靠分析其功能表征的方法。低氧（O2）培养条件、乳酸筛选以及延长培养时间可获得高纯度、高质量的类心室心肌细胞。与分离的成年大鼠心肌细胞（ARCMs）类似，培养3个月的iPSC-CMs相较于培养30天的细胞，表现出更高的Ca2+振幅、更快的Ca2+再摄取速率（衰减时间常数）以及对β-肾上腺素能刺激呈正性肌松弛反应。该策略在技术上简便、成本效益高且可重复性强，为心脏疾病建模以及以Ca2+调控蛋白为靶点的大规模药物筛选提供了可靠的实验平台。

如图1A所述的方案可生成高纯度的心肌细胞，这些细胞在培养过程中随时间推移逐渐获得心室样/成年样表型。通过检测心房和心室肌球蛋白调节轻链2亚型（分别为MLC2A和MLC2V）的免疫荧光染色发现，在心脏分化诱导后第30天，该方案生成的大部分细胞呈MLC2A阳性，而同一时间点MLC2V的表达量则显著较低（图2A，上排图）。随着培养时间的延长（第60天和第90天），观察到MLC2亚型（从MLC2A向MLC2V）发生了完全转换（图2A，下排图）。为了定量分析MLC2A和MLC2V阳性细胞的比例，进行了流式细胞术分析。与免疫荧光结果一致，流式细胞术数据显示，早期阶段（第30天）的iPSC-CMs主要表达MLC2A（MLC2A阳性细胞占29.8%，MLC2V阳性细胞占1.9%）（见图2B</stro...

本文描述并验证了一种稳定生成强健的人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的方法，并对其功能进行了表征。这些技术可能有助于深入理解信号通路的机制，为大规模药物筛选提供平台，并可靠地模拟心脏疾病。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）为研究钙离子（Ca2+）生物学基础提供了宝贵的人源性材料...

在诱导干细胞来源的心肌细胞时，可重复性是一个主要关注点。利用这些方法，可以从诱导性多能干细胞（iPS）高效地生成高纯度、高质量的心肌细胞，用于功能研究。该技术的主要优势在于，它是一种简单、可靠、经济高效且极为强大的方法，可用于获得纯化的高质量iPSC来源心肌细胞制备物。进行细胞传代时，先用一毫升不含钙和镁的 PBS 清洗细胞，作用时间为七到十分钟，然后弃去 PBS，加入一毫升传代培养基。使用细胞刮轻轻刮下培养孔底部的细胞，并用无菌的两毫升玻璃移液管通过机械方式将脱落的细胞分散。在显微镜下观察到细胞以小细胞团的形式脱落时，加入传代培养基，按 1:6 的比例进行细胞传代。接下来，从六孔板中吸除适用于人胚胎干细胞的基质。然后向每孔加入1毫升传代培养基和1毫升解离的细胞，并让细胞生长至达到70%至80%汇合度，随后开始心肌分化。在解离iPSC-CMs前至少30分钟，用70%乙醇擦拭单独的玻璃盖玻片，并将盖玻片放入无菌六孔板的各个孔中。当盖玻片干燥后，将 250 至 300 微升人胚胎干细胞合格基质溶液直接加到每张盖玻片的中央，并将六孔板放入组织培养罩内。为解离经代谢筛选的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM），在每个孔中加入 1 毫升无菌的含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶，于 35 摄氏度孵育 5 分钟，并使用 1000 微升移液器进行机械性吹打，直至形成单细胞悬液。将细胞吸入无菌的 15 毫升锥形管中，并用每孔 2 毫升 RPMI 20 培养基洗涤每个孔。然后将洗涤液加入离心管中，通过离心沉淀细胞。用适量培养基重悬细胞，使细胞浓度达到每250微升含3×10⁵个细胞。使用1000微升移液枪头充分吹打，使细胞解离至溶液呈现均匀状态。然后用1000微升移液枪头吸取250微升细胞，缓慢将全部液体滴加至一张人胚胎干细胞专用基质包被的编码盖玻片上。所有细胞接种完成后，将培养板小心放入细胞培养箱中过夜。次日早晨，向每孔轻柔加入2毫升D7培养基。当所选的iPSC-CMs培养至至少三个月时，在37摄氏度条件下用2微升Fura-2 AM处理细胞10分钟，并启动钙成像分析系统。开启ArcLamp，将泵的管路连接至相应的入口和出口，将刺激器的电子导线连接至记录舱，然后将记录舱放置于系统上。用37摄氏度预热的Tyrode溶液填充穿过流体在线加热器的ProFusion管，并调整相机和框架光圈尺寸以最小化背景区域。将接种有iPSC-CMs的玻璃盖玻片固定到腔室中，然后轻轻在盖玻片上方直接加入500微升Tyrode溶液。以每分钟1.5毫升的流速开始向腔室灌注Tyrode溶液，并使用电刺激器以每4毫秒10伏特的1赫兹场刺激对iPSC-CMs进行起搏，持续3至5分钟。当所有染料均已被洗脱出腔室后，调整观察视野至盖玻片的左上区域，并开始记录。在采集到连续稳定的5至10个峰信号后，点击暂停以暂时停止记录，移动显微镜载物台至盖玻片另一端相邻区域，然后继续记录。以相同方式在10分钟内扫描整个盖玻片上的钙瞬变信号后，根据制造商的说明，使用适当的荧光轨迹分析软件对数据进行分析。本方案可生成高纯度的心肌细胞，这些细胞在培养过程中随时间推移逐渐获得心室样、成年型表型。通过心房和心室肌球蛋白轻链2（MLC2）亚型的免疫荧光染色评估，在诱导心脏分化第30天时，本方案产生的大多数细胞呈心房MLC2亚型阳性，而心室MLC2亚型在同一时间点表达量则较低。随着培养时间的延长，可观察到向MLC2亚型的完全转换。这些结果也通过流式细胞术对表达心房和心室MLC2标志物的细胞百分比进行定量分析得以证实。在第90天，iPSC-CMs的钙振幅显著增加，与成年大鼠CMs中观察到的情况相似。需要注意的是，在分化过程中，污染的非心肌细胞可能会影响人iPSC-CMs的功能成熟。此外，在记录iPSC-CMs的钙瞬变时，必须让细胞在37°C下持续刺激至少200秒以达到稳定状态，并将记录限制在特定时间窗口内，以确保结果的可重复性。请务必确认iPSCs呈现均一的形态，并在启动心肌分化前让细胞生长至70%至80%的融合度。不成熟iPS来源的心肌细胞若纯度不高或质量不佳，可能表现出改变的功能特性，这些特性并不能反映真实表型，却可能被误判为疾病表型。因此，获得高纯度且高质量的心肌细胞对于获得一致且可重复的实验结果至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

生成心室样HiPSC衍生的心肌细胞和用于钙处理特征的高质量细胞制剂

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。...

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

已开发并描述了多种从大鼠心脏中分离不同心肌细胞类型的方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），从而降低实验成本。...

从成年大鼠心脏中同时分离高质量心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞

本文介绍一种光学成像技术，用于特异性检测心室样诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中的动作电位。该方法基于启动子驱动的电压敏感型荧光蛋白表达。...

人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

本方案描述了用于高通量药物筛选和毒性检测的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）中触发细胞活动的全光学控制与观测方法。展示了在时间和空间上对表型模式进行多参数定量分析的结果，并演示了药物在数小时内产生的长期效应或在数天内进行的连续测量。...

用于毒性测试和表型药物筛选的诱导多能干细胞衍生心肌细胞中钙信号的高通量光学调控与记录

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

了解从人诱导多能干细胞生成高纯度心肌细胞的方法，用于心脏疾病建模和药物筛选。该技术简单可靠，可获得具有心室样表型的优质细胞制剂。

生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

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