基于频率域相机系统的氧气O₂发光寿命成像

作为最佳的电子受体，氧气在生物系统中起着至关重要的作用。通过本实验方案，您可以使用光学传感器对二维空间中的氧气分布进行成像。该方法不仅具有高空间和时间分辨率，而且无需额外的参考染料，极为稳定，并可同时获取结构图像。

该方法可应用于氧气起关键作用的多个研究领域，包括生态学、医学研究、生物打印和压力敏感打印。传感器的制备可能具有挑战性，因为添加到支撑箔上的感应混合液量以及刮刀涂布装置的拖动速度可能需要优化和反复练习。通过本视频，我们希望使这一强大技术能够被其他研究领域的科研人员所掌握。

制备平面氧敏传感器时，首先使用水膜或70%乙醇将一片洁净无尘的PET薄膜固定在干净的玻璃板上。将一个洁净的120微米刮刀涂布装置置于薄膜上，并用玻璃移液管在装置前方沿直线滴加传感器混合液。接着，缓慢而均匀地推动刮刀涂布装置在PET薄膜上移动，使混合液均匀铺展。

然后将制备好的平面氧敏光学传感器在室温空气中干燥1小时，随后在50至60摄氏度的加热柜中过夜干燥。至次日早晨，可获得厚度约为12微米的薄膜。将光学传感器避光保存，直至后续使用。

制备根际三明治培养室时，使用光固化丙烯酸类瞬干胶将显微镜载玻片沿玻璃板边缘粘合，留出一侧长边开口。将平面光学传感器裁剪至所需形状和尺寸，使其能够放入已粘合的显微镜载玻片之间的空隙中，并将光学传感器放置在前侧玻璃板内表面，涂层面向上。用胶带将光学传感器薄膜的一边固定在玻璃板上，然后在玻璃板与光学传感器薄膜之间加入自来水。

缓慢将箔片放至水滴上，使传感膜在玻璃表面自行展平，并用柔软的纸巾小心去除传感膜与载玻片之间截留的气泡。然后将玻璃载片擦干，并用胶带将箔片其余边缘固定在载片上。接着，使用一块平整的玻璃片将0.5毫米筛分的沉积物均匀铺展在载片上，使其厚度与显微镜载玻片间隔器的厚度一致。

仔细清洁载玻片的上表面，以确保第二块玻璃片能够正确密封反应室，并在载玻片表面涂抹硅脂。然后在沉积物上覆盖一层薄水膜，注意避免产生气泡。在将样品放置到沉积物上之前，需仔细清洗一株单花水车前（Littorella uniflora）的单个枝条，并将其置于沉积物上，使叶片从上方开口处伸出。

将样品放置到位后，将带有光学传感器的玻璃板置于沉积物上，并施加轻微压力，使光学传感器与植物根系及周围沉积物紧密接触。使用夹具将玻璃板固定在一起，并用纸巾擦干外缘。在构建根际-砂夹心结构期间，反复向叶片滴加少量水，以保持植物水分；使用乙烯基电工胶带收紧根际-砂夹心室。

然后用油灰密封边缘，并用额外的电工胶带加固。为成像做准备时，在孵育后移除光学传感器区域的覆盖箔，将根际三明治培养室带有光学传感器的玻璃壁垂直紧贴水族箱壁放置。使用垫片将根际三明治培养室压紧在箱壁上。

将配备物镜的基于频域的发光寿命相机放置在水族箱及目标区域前方。将适合成像指示染料的发射滤光片安装到相机物镜上，并将导光管固定在LED激发光源中。然后调整导光管位置，使其均匀照射覆盖目标区域的平面光极膜。

在成像软件中选择相机，并在LED控制软件中选择LED。根据需要设置LED强度，并勾选模拟和同步选项，以确认LED由外部晶体管-晶体管逻辑信号触发。手动调节相机焦距，调整物镜光圈，设置内部调制源为正弦波输出波形，启用额外相位采样，相位采样数设为八步，相位顺序设为反向，读出方式选择A B通道，调制频率设为5 kHz。

调整曝光时间，直至归一化发光强度图像的兴趣区域统计读数处于 0.68 至 0.72 范围内。然后点击“capture reference”以开始参考测量序列的采集。为校准氧传感器，使用气体混合装置将已知氧浓度的环境空气-氮气混合气体通入校准水族箱中，并利用配备氧传感器的外部探头监测氧浓度。

然后在校准室中获取不同氧气浓度下的一系列图像，以获得与所采集校准数据相匹配的适当拟合曲线。系统校准完成后，关闭照射植物的光源及其他所有光源，根据图像强度调整采集时间，确保信号在寿命测定中既不饱和过度，也不因过弱而影响信噪比。当所有氧气寿命图像采集完毕后，重新打开光源以获取结构图像，并在视野中放置标尺拍摄图像，以便后续对所采集的图像进行比例标定。

在对样品成像之前，必须对光学传感器进行校准。随着氧气浓度增加，测得的荧光寿命遵循准指数衰减规律而减小。该关系也可通过简化的双位点模型进行描述。

在完成光学传感器的校准后，可通过成像所观察到的荧光寿命来确定氧气浓度，如图中所示：在光照强度为每平方米每秒500微摩尔光子、持续照射12小时后，以及在黑暗条件下放置12小时后，对单花水车前（Littorella uniflora）根际区的氧气浓度分布进行了成像。除了荧光寿命图像外，还可以在外部照明条件下获取结构图像，同时保持成像几何结构不变，从而能够将氧气成像结果与结构图像进行精确定位关联。例如，可从在黑暗和光照条件下获取的图像中提取单根横截面上的氧气浓度分布剖面。

确保样品基质与传感器之间有良好的接触至关重要，以避免产生不必要的伪影。如有疑问，请重新制备夹心结构。以非破坏性方式瞬时获取图像，可实现对氧气环境的实时监测。

该方法也可与其他用于pH值或其他分析物的光极联用。由于传感器混合液含有氯仿，务必在通风橱中进行光极的制备。平面光极可用于鉴定沉积物中的微生物群落。

成像后，可打开三明治结构以采集这些热点区域，用于微生物群落分析。