使用基于频率域的摄像机系统的 O₂的发光寿命成像

我们描述了使用新型频域发光寿命相机绘制 2D O₂分布图和光学传感器箔。介绍了相机系统和图像分析程序，以及传感器箔的制备、校准和应用，以可视化水生植物根系层中的_O2微环境。

作为最好的电子接受者，氧气在生物系统中起着至关重要的作用。使用此协议，您可以使用光码在 2D 中成像氧气分布。除了高空间和时间分辨率外，该方法不需要额外的参考染料，非常坚固，并允许获得结构图像。

该方法可应用于氧在生态学、医学研究、生物印刷、压敏印刷等各个领域发挥着关键作用。视光剂制造可能具有挑战性，因为添加到支撑箔和刀涂装装置的鸡尾酒量可能需要优化和实践。通过这个视频贡献，我们希望让来自其他研究领域的研究人员能够访问这种强大的技术。

要准备平面氧视点，首先使用水膜或 70% 乙醇在干净的玻璃板上固定干净的无尘 PET 箔。将干净的 120 微米刀涂装装置放在铝箔上，并使用玻璃移液器在设备前面涂抹一行传感器鸡尾酒。接下来，缓慢而均匀地将刀涂装装置拖过PET箔，均匀地铺开鸡尾酒。

然后在环境空气中干燥成品平面氧敏感光码一小时，然后在 50 至 60 摄氏度的加热柜中干燥过夜。第二天早上，将得到一层约12微米厚的厚。存储受光线保护的视点，直到进一步使用。

要准备一个 rhizo-三明治室，请使用轻固化丙烯酸基即时胶粘剂将显微镜沿着玻璃板的边缘滑动，使长边打开。将平面视盘切成所需的形状和尺寸，以适应粘合显微镜幻灯片之间的空间，将视点放在前玻璃板内侧，涂层侧朝上。将视光箔的一边贴在玻璃板上，并在玻璃板和视光箔之间添加自来水。

慢慢地将铝箔放到水滴上，使视光器在玻璃表面自行拉直，并使用软组织小心地去除夹在视光和板之间的气泡。然后擦干玻璃板，将铝箔的剩余边缘胶带擦到板上。接下来，使用平板玻璃板将 0.5 毫米的筛分均匀地分布在板上，厚度与显微镜滑动垫片相同。

小心清洁显微镜幻灯片的上表面，确保第二个玻璃板正确密封腔室，并在显微镜幻灯片表面涂抹硅胶润滑脂。然后用一层薄薄的水覆盖沉积物，同时小心避免气泡的形成。在将样品放在沉积物上之前，请仔细清洗利托雷拉单叶的一次拍摄，并将拍摄点放置在沉积物上，让叶子从上开侧伸出来。

当样品就位时，将带光底的玻璃板放在沉淀物上，施加温和的压力，使光板与植物根部和周围沉积物紧密接触。使用夹子将板固定在一起，用纸巾擦干外缘。反复在叶子上加入几滴水，使植物在整个 rhizo 三明治的组装过程中保持水分，并使用乙烯基电胶带拧紧 rhizo-三明治室。

然后用建模粘土和附加电气胶带密封边缘。为准备成像，在孵化后从光面区域取出覆盖箔，并放置带玻璃壁的 rhizo-三明治室，视光罩直立在水族馆墙壁上。使用等位器将 rhizo-三明治室压在墙上。

将基于频域的发光寿命摄像机放在水族馆和感兴趣区域前面配备目标。将合适的发射滤镜连接到摄像机目标，并固定 LED 激励源中的光导。然后定位导轨，以便它均匀地照亮覆盖感兴趣区域的平面光箔。

在成像软件中，选择摄像机，然后选择 LED 控制软件中的 LED。根据需要设置 LED 强度，并勾选模拟和同步，以确认 LED 是由外部晶体管-晶体管逻辑触发的。手动对焦摄像机并调整目标光圈，并设置内部调制源、输出波形正弦波、附加相位采样、八相采样、相位顺序相反、点击 A B 读出和五千赫调制频率。

调整曝光时间，直到规范化发光强度图像的兴趣统计读出区域在 0.68 到 0.72 之间。然后单击捕获参考以开始获取参考测量系列。要校准光度，请使用气体混合装置用环境空气氮气混合物在校准水族馆中冲洗水，并采用已知氧气浓度，使用带氧传感器的外部探头监测氧气浓度。

然后获取校准室中不同氧气浓度的一系列图像，以获得与采集的校准数据合适的曲线。校准系统后，关闭对工厂和所有其他光源进行辐照的灯，并根据图像强度调整采集时间，以确保信号不会过饱和或太弱，在寿命确定中信号与噪声比率良好。获得所有氧气寿命图像后，重新打开灯以获取结构图像，并在视野中使用标尺获取图像，以便随后缩放采集的图像。

在成像样品之前，必须校准视点。在准指数衰减后，测量的发光寿命会随着氧气浓度的增加而缩短。还可以使用简化的两站点模型描述这种关系。

一旦对视光层进行校准，可以通过成像这些图像中观察到的发光寿命来确定氧气浓度，在这些图像中，在光照射到每平方米500微莫光子后，在12小时和12小时的黑暗中，对利托雷拉单叶的根圈中的氧浓度的分布进行成像。除了终身图像外，还可以在外部照明下获取结构图像，同时保持成像几何形状固定，使氧气成像能够精确地与结构图像关联。例如，可以从黑暗和光线下获得的图像中提取单个根的氧浓度剖面。

在样本矩阵和 optode 之间保持良好的接触以避免不必要的伪影至关重要。如果你有疑问，重拍三明治。以无损方式即时采集图像，可监控氧气环境。

该方法不妨与pH或其他分析物的其他光子结合使用。请务必在烟罩中进行光二极管制造，因为传感器鸡尾酒含有氯仿。平面光二极管可用于识别沉积物中的微生物群落。

成像后，可以打开三明治来采样这些热点，用于微生物群落分析。