通过物理性各向同性膨胀实现人体组织切片的纳米级成像

我们正在介绍扩展病理学（ExPath），这是一种低成本的方法，可用于在标准临床组织切片中以纳米级精度成像目标生物分子。ExPath通过将临床组织切片与可吸水膨胀的水凝胶进行化学结合，然后将处理后的样品物理性均匀扩展约一百倍，从而克服了传统光学显微镜的衍射极限，使原先重叠的荧光标记生物分子得以分离，并可通过常规光学显微镜观察。ExPath使研究人员能够在组织样本中研究与疾病相关的生物分子的纳米级空间构型，而无需投资新的成像硬件设备。

因此，有助于深入理解疾病机制并推动新的诊断方法发展。该方法可广泛应用于多种组织类型，为研究各类复杂疾病的发病机制提供新的见解，例如癌症、脑部疾病、自身免疫性疾病等。直观的演示对于正确展示关键操作步骤至关重要，例如凝胶腔室的构建以及在蛋白酶K消化前后对凝胶样品的处理。

首先将目标组织转换为与 ExPath 兼容的格式。若处理 FFPE 临床样本，将带有样本的载玻片放入 50 ml 锥形管中，并加入 15 ml Zylene。盖紧管盖，将管子水平放置于摇床中，以约 60 rpm 振荡三分钟。

用另外15 ml的二甲苯重复洗涤一次。然后根据文稿说明，将切片在一系列浓度递减的乙醇溶液中进行洗涤。若处理的是染色并封片的永久切片，将每张切片放入一个50 ml的锥形管中，再用二甲苯覆盖切片。

用刀片小心地移除盖玻片。然后以与FFPE临床样本相同的方式处理载玻片。若使用OCT溶液中的未固定冷冻组织切片，需在20摄氏度的丙酮中固定组织10分钟，随后用1× PBS溶液洗涤样本，每次10分钟，共洗涤三次。

若处理先前固定并冷冻的临床样本，将切片在室温下放置两分钟，以融化OCT包埋剂，然后用1× PBS洗涤样本三次，每次五分钟。完成格式转换后，对所有样本进行抗原修复。将20毫摩尔柠檬酸溶液在微波炉中加热至100摄氏度，然后将切片放入该溶液中。

立即将容器转移至培养箱中，在60摄氏度下孵育三十分钟。为染色样本，使用疏水性笔在载玻片上的组织切片周围画出边界。将载玻片放入培养皿中，然后在30摄氏度下用封闭缓冲液孵育组织一小时。

然后，在室温或37摄氏度下，用一抗溶液孵育组织至少三小时。孵育结束后，用封闭缓冲液洗涤组织三次，并在室温或37摄氏度下加入二抗溶液孵育至少一小时。再次使用封闭缓冲液进行洗涤，随后使用常规的宽场显微镜或其他合适的成像系统进行荧光成像。

根据文稿说明配制锚定溶液。将载玻片放入100 ml的培养皿中，用移液器将锚定溶液滴加至组织上，室温孵育至少三小时。随后，根据文稿说明配制凝胶溶液。

去除组织切片上多余的包埋溶液，将玻片放回培养皿中。向样品中加入新鲜的冷凝胶溶液，在4°C条件下孵育三十分钟。为了在玻片上围绕样品构建一个腔室，使用金刚石刀将盖玻片切成薄片作为间隔物。

在组织两侧使用水固定间隔片，并小心地将盖玻片盖在载玻片上，注意避免在组织上方产生气泡。随后，将样品置于湿润环境中，于37摄氏度孵育两小时。通过将刀片轻轻插入盖玻片下方并缓慢从凝胶表面提起，移除凝胶腔室的盖子。

修剪组织周围的空白凝胶以减小体积，注意以不对称方式切割凝胶以便追踪方向。用消化缓冲液将蛋白酶K按1:200稀释，确保配制足够的溶液以完全浸没凝胶。然后将样品置于密闭容器中，于60摄氏度孵育3小时。

如果样品在消化过程中未脱落，可使用刀片轻轻将其取下。使用柔软的画笔将样本转移至适合目标成像系统且足以容纳完全膨胀凝胶的容器中的1×PBS中。用PBS清洗样品10分钟，必要时可用300毫摩尔DAPI重新染色。

通过使用过量的双蒸水清洗样品，每次清洗10分钟，重复三至五次，使样品膨胀。然后进行荧光成像。如果该方案成功执行，样品在机械均质化后会呈现为平坦且透明的凝胶，并能在水中膨胀3至4.5倍。

一块五微米厚的FFPE肾脏样本被扩增了4.5倍，使用数值孔径为0.95的物镜实现了63纳米的分辨率。随后将组织转化为适用于扩增病理学的格式，并用针对Alpha Actinin 4和Vimentin的抗体、DAPI（用于显示细胞核DNA）以及小麦麦芽蛋白（Wheat Germa Glutenin）对碳水化合物进行标记染色。然后采用转盘共聚焦显微镜对样本进行成像。

随后将肾组织完全在水中膨胀，并再次进行成像。裂纹、形变以及标记靶标的丢失可能是由于锚定不充分或均质化不足所致。经苏木精和伊红染色的正常乳腺组织被当作FFPE样本处理，经膨胀、DAPI标记后，在转盘共聚焦显微镜下成像。

未固定和冷冻的肾脏切片也采用此方案进行处理。组织用冷丙酮固定，并用Alpha Actinin 4、Vimentin、DAPI和小麦胚芽谷蛋白进行染色。进行该技术操作时，需注意凝胶步骤的时间至关重要。

过早凝胶化可能导致形变、限制膨胀，并造成目标分子的丢失。按照本方案，在样本消化和膨胀后，可在显微镜下进行荧光成像。ExPath 可广泛应用于病理学及其他领域。

因为它能够使研究人员观察到感兴趣组织样本中的细微结构，从而有助于研究人员深入了解疾病的发病机制或生物过程的作用机理。