使用 Lucifer Yellow 离子电泳技术可视化星形胶质细胞形态

该方法可用于促进对星形胶质细胞精细突起的可视化观察，从而评估在疾病状态和稳态下星形胶质细胞与神经元在突触处的相互作用。该技术也可应用于任何小鼠模型、细胞群体或脑区。为制备具有合适电阻的尖锐电极，需使用微电极拉制仪将带丝的硼硅酸盐玻璃单管电极拉制成型。

将拉制好的电极存放在密闭容器中，以防止灰尘进入电极尖端，并将电极架高，使其不接触容器底部，以防尖端断裂。使用荧光黄染料溶液填充电极时，将电极垂直放置，尖端朝下，用移液器向电极后端加入一到两微升的荧光黄溶液。静置五到十分钟，使溶液通过毛细作用移至尖端，然后轻轻将已填充的电极固定在电极夹持器中，电极夹持器连接至操纵器，且夹持器内的银丝需与电极内部的荧光黄溶液接触。

进行染料喷射测试时，将轻微固定的脑切片轻轻放入盛有0.1摩尔PBS溶液的玻璃底培养皿中，在室温下用带有尼龙丝的铂金网格固定脑切片。将电极连接至电压源，并将接地电极置入盛有脑切片的浴液中。移动共聚焦显微镜的物镜至目标脑区，使用10倍水浸物镜将电极缓慢下降至溶液中，并调节电极位置使其位于视野中央。

在明场照明下，使用40倍水浸物镜仔细检查电极，确保电极清晰，无碎片或气泡。切换至共聚焦激光扫描显微镜，使用488纳米激光。打开刺激器，设置为12伏，以检测染料的喷出情况。

在电极尖端周围应可见一大片荧光染料云。随后，在明场下缓慢将电极向下移动至脑片，停在脑片表面稍上方。为通过离子电泳将目标星形胶质细胞染色，请使用红外微分干涉差显微镜识别位于脑片表面下40至50微米处、胞体呈长椭圆形、直径约10微米的星形胶质细胞。

这是位于海马锥体细胞层正下方的辐射层。当我们穿过组织时，可以看到血管、神经元、星形胶质细胞以及其他细胞类型。选定一个星形胶质细胞后，将细胞移至视野中央，然后缓慢将电极尖端插入切片，穿过组织，直至电极与细胞体处于同一平面。

当星形胶质细胞的胞体清晰可见并已勾画出轮廓后，缓慢而轻柔地向前推进电极，移动电极直至其尖端刺入细胞的胞体。缓慢上下调节物镜焦距，以确认电极是否已进入胞体内。一旦电极尖端进入细胞内，开启刺激器，施加 0.5 至 1 伏的电压，持续向细胞注入电流。

使用共聚焦显微镜观察细胞膜，必要时增加数字放大倍数以清晰显示细胞的细节，并确保电极尖端位于细胞内可见。等待约15分钟，直至细小的分支和突起结构清晰可辨，然后关闭电压，轻柔地将电极尖端从细胞中撤出。为成像已填充的细胞，需等待15至20分钟，使细胞恢复至原始形态，随后调整共聚焦显微镜的设置，确保在40倍物镜下细小的分支和突起结构清晰可辨。

设置Z轴步进堆栈，步长为0.3微米，成像时移动物镜直至细胞信号消失，并将此步设为顶部。然后将物镜向下移动，逐层聚焦穿过细胞，直至信号再次消失，并将此步设为底部。成像完成后，检查电极是否有染料喷出。

如果出现较大的染料云团，则该电极可用于下一个脑片；否则应更换电极。通过生成最大强度投影，可观察到星形胶质细胞在其功能域内的精细结构。

对星形胶质细胞进行四倍放大，显示出一个主要分支、若干次级分支以及周围小分支和叶状突起分布的最大强度投影。此处展示的是CA1区星形胶质细胞的原始图像。在后续图像中，对该细胞的胞体、主要分支、突起以及星形胶质细胞所包绕的 territory 体积进行了重建。

重建完成后，对胞体、整个细胞以及支配区域的体积进行了定量分析，并统计了主要分支的数量。由于细胞骨架蛋白可标记细胞胞体、主要分支以及部分二级星形胶质细胞分支中的中间丝，但在更细的分支和突起中不表达。

在此代表性分析中，胶质纤维酸性蛋白标记的初级分支数量与荧光黄可视化显示的分支数量之间未发现显著差异。此外，胶质纤维酸性蛋白标记的星形胶质细胞的细胞面积和体积明显小于荧光黄显示的面积和体积，表明胶质纤维酸性蛋白是标记主要分支的可靠标志物，但不适合用于确定细胞的整体面积或体积。电极尖端释放的染料量取决于电极阻抗，后者必须足够高，以确保染料能够持续稳定地喷出。

未来的研究可通过超分辨率光学显微镜观察星形胶质细胞结构的不同组分，或通过免疫组织化学方法分析星形胶质细胞结构内特定蛋白的表达情况。