Name: 沉默的火花:CRISPR/Cas9基因组编辑在弱电鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解CRISPR/Cas9基因编辑技术在弱电鱼中的应用方法，涵盖Gymnotiformes和Mormyridae物种的显微注射操作流程。该技术可成功诱导突变并降低放电幅度，为比较基因组学研究提供功能验证工具。

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作者感谢Monica Lucas、Katherine Shaw、Ryan Taylor、Jared Thompson、Nicole Robichaud和Hope Healey在鱼类饲养、数据收集以及早期方案开发方面所做出的杰出贡献。我们还要感谢三位审稿人对本文稿提出的宝贵建议。在认真回应并处理了审稿意见后，我们认为最终成果的质量得到了显著提升。本研究得到了美国国家科学基金会（项目编号#1644965和#1455405）对JRG的资助，以及加拿大自然科学与工程研究理事会DG项目对VLS的资助支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

弱电鱼类表型的丰富性，加上近年来基因组学资源的迅速增加，促使人们对弱电鱼类这一模式生物的功能基因组学工具产生了迫切需求。该体系尤其具有吸引力，是因为在多个平行的鱼类谱系中，众多表型性状发生了趋同进化，且这些鱼类易于在实验室中饲养。
本文所述方案展示了CRISPR/Cas9技术在弱电鱼类谱系中的有效性，这些鱼类在进化过程中平行演化出了发电和电感受能力，因此对该模型在表型进化比较基因组学未来研究中的应用前景具有重要意义。
这种简单的方法学仅需基本的分子生物学技能和培训，其基础是广泛用于斑马鱼的Gagnon方案38。值得注意的是，随着技术的发展，目前已有更多用于sgRNA制备的商业试剂盒，以及可合成向导RNA的公司，这使得缺乏分子生物学经验与设备的实验室也能更容易地采用该方案。我们首先注意到，该方法具有较高的诱变效率，可直接对显微注射后的幼体进行表型分析。然而，表型嵌合现象较为显著，这并不罕见，且与文献报道一致41,...

在脊椎动物的进化历史中，电感受和电发生能力发生了变化。两个硬骨鱼类类群——骨舌鱼目（Osteoglossiformes）和鲇形目（Siluriformes）——独立地平行演化出了电感受能力，而五个硬骨鱼类谱系（裸背电鳗目 Gymnotiformes、象鼻鱼科 Mormyrids，以及 Astroscopus、Malapterurus 和 Synodontis 属）则独立地平行演化出了电发生能力。这些独立演化出的表型表现出显著的趋同性，且共享一种共同的遗传结构1,2,3。
这一点在两种物种丰富的硬骨鱼类支系——即能够产生和感知微弱电场的裸背电鳗目（gymnotiforms）和长颌鱼目（mormyrids）——所表现出的众多趋同特征上体现得尤为明显，这两类鱼被称为弱电鱼类。自发现弱电鱼类利用电场感知环境并进行交流以来的50年中4，不断壮大的科研群体已在发育演化1,5,6、系统与神经回路神经科学7,8,9,10、细胞生理学11,12、生态学与能量学13,14,15,16,17、行为学18,19以及宏观演化3,20,21等领域获得了极为丰富的科学见解。
近年来，针对电鱼的基因组、转录组和蛋白质组资源迅速增多1,22,23,24,25,26,27,28。这些资源的应用已经为理解这些物种中基因型与表型之间的关联提供了重要见解1,2,3,28,29,30。目前将基因组数据与弱电鱼类表型数据整合的主要障碍在于缺乏有效的功能基因组学工具31。
其中一种工具是近期开发的成簇规律间隔短回文重复序列与Cas9核酸酶配对的技术（CRISPR/Cas9，简称CRISPR）。CRISPR/Cas9是一种基因组编辑工具，已在模式生物32,33,34和非模式生物35,36,37中得到广泛应用。CRISPR/Cas9技术已发展到这样一个阶段：任何具备基本分子生物学条件的实验室均可通过非克隆方法以较低成本轻松制备针对特定基因的短向导RNA（sgRNA）探针38。相较于其他基因敲除或基因沉默策略（如吗啉代寡核苷酸39,40、转录激活因子样效应物核酸酶&#160;(TALENs)以及锌指核酸酶（ZFNs）），CRISPR具有显著优势，后者的每个靶基因都需要耗费高昂成本且耗时较长的构建过程。
CRISPR/Cas9 系统通过靶向基因组中的特定区域来实现基因敲除，该过程由 sgRNA 序列引导，并造成双链断裂。细胞会识别该双链断裂，并优先通过非同源末端连接（NHEJ）途径激活内源性 DNA 修复机制。该修复途径具有高度的错误倾向性：在修复过程中，DNA 分子常在双链断裂位点引入插入或缺失（indels）。这些 indels 可能导致基因功能丧失，原因包括：(1) 开放阅读框发生移码，(2) 引入提前终止密码子，或 (3) 基因产物关键一级结构发生改变。在本实验方案中，我们利用 CRISPR/Cas9 编辑技术，在弱电鱼类物种中通过 NHEJ 途径靶向目标基因的点突变。尽管该诱变方法比其他技术更简单且高效，但预期在 F0 代个体中会产生不同程度的表型严重性，这归因于基因嵌合性41,42,43,44。
生物体的选择 
为了促进未来对弱电鱼类比较基因组学的研究，需要为裸背电鳗目（gymnotiforms）和长颌鱼科（mormyrids）分别选择一个代表性物种用于实验方案的开发。在2016年于乌拉圭蒙得维的亚举行的电鱼会议期间经过讨论后，学界达成共识，优先选用已在实验室条件下实现繁殖且具备基因组资源的物种。裸背电鳗目 Brachyhypopomus gauderio 和象鼻鱼 Brienomyrus brachyistius 符合这些标准的物种被选中。在这两个物种中，诱导和维持繁殖条件的自然信号在圈养环境中均易于模拟。 B. gauderio一种来自南美洲的裸背电鳗目物种，具有较低的饲养要求：可在相对较小（4 L）的水族箱中以较高密度饲养。 B. gauderio 在人工饲养条件下也具有较快的世代更替速度. 在实验室条件下， B. gauderio 大约4个月即可从卵发育为成虫。
B. brachyistius 是一种来自西中非的 Mormyridae 科鱼类，在人工饲养条件下易于繁殖。B. brachyistius 可通过观赏鱼贸易 readily 获得，已被广泛应用于多项研究，目前已有多种基因组资源可供使用。其生命周期为 1−3 年，具体时长取决于实验室条件。该物种的饲养要求相对较高，由于其在繁殖期间具有攻击性，需使用中等尺寸的水族箱（50−100 L）。
研究其他种类电鱼的实验室，只要该物种可进行繁殖，并能收集单细胞胚胎且将其培育至成年，便应能轻松地采用本方案。不同物种在饲养条件、幼体培育以及体外受精（IVF）率方面可能会有所差异；然而，本方案可作为其他弱电鱼类繁殖尝试的起点。
概念验证的理想基因靶点：scn4aa 
弱电鱼类中的 Mormyridae（象鼻鱼科）和 Gymnotiformes（裸背电鳗目）通过放电一种称为电器官的特化器官来产生电场（发电）。电器官放电（EOD）源于电器官细胞（称为电细胞）同时产生动作电位。EOD 被皮肤中的一系列电感受器检测，从而形成对鱼类周围环境的高分辨率电图像45。弱电鱼类还能够检测同种个体 EOD 波形的特征18以及其放电频率46，使得 EOD 除了具有感知功能外，还可作为类似鸟类鸣叫或蛙类鸣声的社会交流信号47。
在骨舌鱼目和裸背鱼目弱电鱼类的发电细胞中，动作电位产生的一个主要组分是电压门控钠通道NaV1.42。非发电硬骨鱼类表达两个旁系同源基因拷贝scn4aa和scn4ab，编码电压门控钠通道NaV1.430。在裸背鱼目和骨舌鱼目弱电鱼类的进化谱系中，scn4aa基因均经历了快速演化，并发生了大量影响其动力学特性的氨基酸替换48。最重要的是，在这两个谱系中，scn4aa基因的表达均已特异性地局限于电器官2,3。scn4aa在电器官中的相对特异表达及其在放电波形（EOD）产生中的关键作用，使其成为CRISPR/Cas9基因敲除实验的理想靶点，因其几乎不会产生有害的多效性影响。由于弱电鱼类在受精后6−8天（DPF）即开始使用幼体电器官放电，因此针对scn4aa的基因操作非常适合在胚胎显微注射后进行快速表型分析。

<table><tbody><tr><td>20 mg/mL RNA级糖原</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>50 bp DNA ladder</td><td>NEB</td><td>N3236L</td><td></td></tr><tr><td>带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-58-10</td><td>（外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 10 cm）</td></tr><tr><td>带有NLS的Cas9蛋白；1 mg/mL</td><td>PNA 生物学</td><td>CP01</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemptoJet 4i 显微注射仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader 吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>汉密尔顿注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-824-654</td><td>称为 &quot;精密玻璃注射器&quot; 在实验方案中</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>称为 &quot;精细任务擦拭&quot; 在实验方案中</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>NEB</td><td>B7003S</td><td>用于体外切割实验</td></tr><tr><td>OneTaq DNA 试剂盒</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Ovaprim</td><td>Syndel USA</td><td>https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html</td><td>称为 &quot;催产剂&quot; 在实验方案中</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>称为 &quot;热塑性塑料&quot; 在实验方案中</td></tr><tr><td>拉管仪</td><td>WPI</td><td>SU-P97</td><td>sutter 品牌</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用的针头——需要定制</td><td>Fisher Scientific</td><td>7803-02</td><td>定制为 0.7 英寸长；点样式 4，角度 25</td></tr><tr><td>T4 DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0203L</td><td>使用随附的10x NEB缓冲液</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯涂层工具</td><td>bonefolder.com</td><td>T-SPATULA4PIECE</td><td>称为 &quot;聚四氟乙烯&quot; 在实验方案中</td></tr></tbody></table>

沉默电火花：利用crispr/cas9在弱电鱼中进行基因组编辑

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

在脊椎动物的进化历史中，电感受和电发生能力发生了显著变化。这些独立演化而来的表型表现出高度的趋同性，并共享相同的基本遗传架构。这一现象最典型的例子是 Gymnotiformes（裸背电鳗目）和 Mormyridae（象鼻鱼科），这两个物种丰富的硬骨鱼类支系均能产生并感知微弱的电场，被称为弱电鱼类。自发现弱电鱼类利用电能感知环境和进行交流以来的50年中，越来越多的科学家群体在发育进化、系统与神经回路神经科学、细胞生理学、生态学、进化生物学以及行为学等领域取得了巨大进展。近年来，电鱼的基因组资源迅速增加。这些资源的利用已显著推动了对这些物种中基因型与表型之间关联的理解。然而，目前将基因组数据与弱电鱼类表型数据整合起来的主要障碍在于缺乏有效的功能基因组学工具。本文报告了一套完整的利用内源性DNA修复机制在弱电鱼类中实施CRISPR/Cas9诱变的实验方案。我们通过CRISPR/Cas9靶向钠离子通道基因scn4aa第一外显子中的插入缺失突变（indels）和点突变，证明该方案在象鼻鱼科物种Brienomyrus brachyistius和裸背电鳗目物种Brachyhypopomus gauderio中均同样有效。利用该方案，我们获得了这两个物种的胚胎，并通过基因分型确认了钠离子通道基因scn4aa第一外显子中存在预期的突变。通过电生理记录进一步验证了基因敲除的成功表型：与未注射的体型匹配对照组相比，突变个体的电器官放电幅度显著降低。

如第1节所述，在scn4aa基因的B. gauderio和B. brachyistius外显子1中鉴定了sgRNA靶向位点。sgRNA的制备方法如第2节所述。在成功完成sgRNA筛选与合成后（图1），进行了体外切割实验（图2）。选择在体外具有切割活性的sgRNA用于单细胞显微注射。
成年鱼类经繁殖条件驯化（第4.1节）后，注射促排卵剂（第4.2节），随后进行挤压取卵（B. gauderio），用于第4.4节所述的体外受精（IVF）；或让其自然产卵（B. brachyistius），如第4.3节所述。上述操作在两种鱼类中均获得了单细胞胚胎，用于显微注射。如第5节所述，在单细胞期向胚胎注射1.5−2.0 nL的scn4aa sgRNA/Cas9/酚红复合物（终浓度为65–190 ng/µL sgRNA、450 ng/µL Cas9、1%–10%酚红）。同一窝的卵...

本文介绍了一种用于制备和培育CRISPR/Cas9基因组敲除电鱼的实验方案。详细阐述了开展该实验所需的分子生物学操作、繁育条件和饲养要求，适用于一种裸背电鳗目（gymnotiform）和一种长颌鱼科（mormyrid）电鱼，并介绍了通过显微注射技术获得Cas9诱导的F0代插入缺失（indel）幼鱼的方法。

沉默电火花：利用CRISPR/Cas9在弱电鱼中进行基因组编辑

在脊椎动物的进化历程中，电感受和电发生能力发生了显著变化。这些特征在不同类群中表现出高度的趋同性……

在弱电鱼类中，特别是在比较研究背景下进行CRISPR/Cas9基因编辑，将使研究人员能够检验特定基因及遗传变异如何影响表型多样性的假说。CRISPR/Cas9是一种高效生成突变F零代胚胎的方法。本方案使研究人员能够在两种趋同进化的弱电鱼类物种中开展CRISPR-Cas9操作。在其他电鱼或其他鱼类中应用此方法并进行某些修改的关键在于，需具备转录组或基因组资源以设计sgRNA。进行显微注射并在二维平面上定位细胞的三维位置可能具有挑战性。可获取少量斑马鱼种群以获得卵子，用于练习常规的显微注射技术。本实验操作将由来自我实验室的技术员 Jared Thompson 与 Savvas Constantinou 共同演示。在将目标鱼类置于适当的繁殖条件下饲养后，需鉴定出呈现怀卵特征的雌鱼。在布氏囊鳍鲶（B.gauderio）中，雌鱼泄殖腔后方的性腺区域会出现明显肿胀。在短鳍叉舌鰕虎鱼（B.brachyistius）中，雌鱼腹部会肿胀，体型显得较深。麻醉给药后，在PCR管中将产卵剂加入四倍体积的DPBS中，并充分混匀。溶液将变得浑浊。使用移液器量取计算好的剂量，并将稀释后的试剂滴加到一片热塑性材料上，然后将溶液吸入一支精密玻璃注射器中，该注射器配备有28号、19至25毫升长度的斜面针头。以平稳的速度将溶液注入背部躯干肌，拔针前让针头停留2至4秒。随后，立即将鱼放入新鲜的系统水中进行恢复。采集B.gauderio精子时，24小时后选择一条大型雄性鱼，在麻醉后尽快将其彻底擦干，尤其是头部和泄殖腔周围。将干燥的鱼腹面朝上放置，头部朝左置于合适的固定装置中，并用浸有MS222的湿润纸巾覆盖，使头部尽可能与实验台平行。立即从尾部向头部方向施加压力，轻轻挤压性腺区域朝向泄殖腔，并使用带吸头的移液器，当精子从雄鱼体内被挤出时，以50 µL为增量小心收集精子。将精子直接加入盛有500 µL稀释液并置于冰上的精子稀释液中。采集后立即把鱼放入含有黏液保护剂的新鲜系统水中。对于B.gauderio卵子的采集，在将一条经麻醉的B.gauderio雌鱼体表擦干后，立即将鱼侧放，头部朝向非优势手一侧，用手从尾部向头部方向轻轻向中线挤压性腺区域，推动至泄殖腔开口处。使用聚四氟乙烯工具，小心收集从泄殖腔挤出的卵，并迅速将卵放入一个带盖的小型培养皿中。如果在挤压后独自操作，请在卵团从雌鱼体内排出时，将其轻触小型培养皿底部。收集卵后，立即将鱼放入含有黏液保护剂的新鲜系统水中。进行B.gauderio体外受精时，将100微升充分混合的精子SES溶液直接加入卵团上，随后加入1毫升新鲜系统水。将配子悬液彻底混合30至60秒，然后向细胞中添加额外的1至2毫升经0.22微米孔径滤膜过滤的系统水。用体外受精时间标记培养皿，并将培养皿放入29摄氏度的培养箱中，设定50分钟计时器以检查发育进展。在受精期间，使用微加载移液器吸

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