Name: 多纤维光测量记录自由移动动物的神经活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学习多光纤光测量技术，用于记录自由移动动物的神经活动并校正钙无关伪影。该方法结合双色成像，帮助研究人员深入理解特定神经元在行为反应中的功能机制。

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本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC：RGPIN-2017-06131）向 C.P. 提供的资助。C.P. 是 FRSQ 梳理研究员。我们还感谢分子工具平台（https://www.neurophotonics.ca/fr/pom）为本研究中使用的病毒载体的制备所提供的支持。

所有实验均依照加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会以及《加拿大实验动物护理与使用指南》的规定进行，并已获得拉瓦尔大学动物保护委员会的批准。 
1. CMOS（互补金属氧化物半导体）相机与单根或分支光纤跳线之间光路的对准
<ol>
	<li>松开五轴位移器上的所有螺丝（11，图2B）。</li>
	<li>将光纤跳线（12，图2B）拧入固定在五轴位移器上的适配器[SMA（亚微型A型）或FC（光纤连接器）]中。</li>
	<li>以低功率（100 µW）开启470 nm激发光源（1，图2B），并将跳线末端对准一块自发荧光塑料载玻片。此步骤不影响后续记录，仅用于可视化对准过程。</li>
	<li>以实时模式记录CMOS相机（13，图2B）的图像。增加增益或调整查找表（LUT），直到图像不再全黑。目的是能够在物镜（10，图2B）的焦平面上观察到清晰图像。</li>
	<li>推进五轴位移器靠近物镜，确保470 nm光束在跳线的SMA或FC端口处居中对准光纤，直至相机上可分辨出清晰图像。</li>
	<li>调节X轴和Y轴，使图像居中且清晰聚焦。</li>
	<li>观察跳线陶瓷插芯端发出的光，应呈现为各向同性的圆形光斑。若使用分叉型跳线，各跳线插芯端发出的光强应相近。若光斑非各向同性或发光强度不均，需调节五轴位移器的X-Y轴方向。</li>
</ol>
2. 围绕纤维设置感兴趣区域以测量平均荧光强度
<ol>
	<li>打开所有激发光源，以便更清晰地观察光纤。调节相机增益，确保无像素饱和，并能获得清晰的光纤图像。</li>
	<li>进行实时记录或拍摄初步图像。</li>
	<li>在光纤周围绘制感兴趣区域（ROI），并在记录过程中保留这些区域，用于测量平均荧光强度值（图 2A）。</li>
	<li>对于多光纤记录，需检测信号的独立性。
	<ol>
		<li>对所有光纤进行实时记录。</li>
		<li>将其中一根光纤对准光源并用手指轻敲。仅该通道应出现明显波动（可接受的串扰比例为 1:1000）。</li>
		<li>若信号不独立，请重新绘制更保守的感兴趣区域，并重复独立性检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为标记并追踪每个感兴趣区域所对应的光纤，可在光纤末端使用彩色胶带或指甲油进行标识。在任何实验开始前拍摄照片，作为辅助参考记录。</li>
</ol>
3. 记录区域的设置
<ol>
	<li>使用支架、夹子或固定装置将光纤跳线悬挂在实验区域上方。</li>
	<li>确保动物能够在整个实验区域内自由活动，不受光纤长度的限制。</li>
	<li>无论使用操作箱还是开放场地，均应确保光纤跳线能够以最小弯曲程度到达动物。若需连接鼻触装置，应保证其上方有足够的空间，防止光纤弯曲。避免光纤跳线出现过度弯曲或扭曲。</li>
</ol>
4. 体内记录
注意：用于光纤光度实验的光纤套管植入步骤与 Sparta 等人15所述的光遗传学实验步骤完全相同。我们建议使用牙科水泥（见材料表），它可将头帽牢固地固定在颅骨上。在无法使用固定螺钉的情况下，牙科水泥尤其适用。
<ol>
	<li>用肉眼和微型光纤显微镜检查光纤跳线末端的光纤表面。如果光纤表面有划痕，请使用细粒度（1 µm 和 0.3 µm）的光纤抛光/研磨膜重新抛光光纤。</li>
	<li>使用70%乙醇和棉签清洁光纤跳线的远端。</li>
	<li>使用70%乙醇和棉签清洁光纤插管。</li>
	<li>将光纤跳线的陶瓷插芯端通过覆盖黑色热缩管的陶瓷分体套筒连接至植入的光纤。连接时，确保套筒紧密贴合，否则应更换新的套筒。 
	注意：若光纤跳线插芯与植入物之间存在任何间隙，将导致大量信号损失， recordings 将无法正常进行。</li>
	<li>在开始行为测试前，让动物恢复数分钟。</li>
	<li>开始记录光学信号并运行实验。</li>
	<li>记录过程中，密切观察实时信号轨迹以确保记录质量。在记录开始的前2分钟内，信号通常会随时间迅速下降。此现象由热介导的LED衰减引起，即温度升高导致光学元件电阻增加。</li>
	<li>如果信号出现超出GCaMP开/关动力学范围的跳跃，通常表明套筒不够紧密，导致光纤跳线与植入物之间的间隙发生变化。此时应停止实验，并更换新套筒重新连接动物。</li>
</ol>
5. 光纤光度数据的分析
注意：这是一种适用于大多数记录数据的数据分析方法。然而，也可以采用其他替代方法。数据分析的示例代码可在此处获取：https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing。
<ol>
	<li>提取来自 470 nm（Int470）和 410 nm（Int410）LED 记录的平均荧光强度值，对应于每根独立的光纤。</li>
	<li>使用移动均值算法对每个信号进行平滑处理（图 3A）。</li>
	<li>使用自适应迭代重加权惩罚最小二乘法（airPLS）算法（https://github.com/zmzhang/airPLS）对每个信号进行基线校正（图 3A 和 3B），以去除信号中的斜率和低频波动。</li>
	<li>使用均值和标准差对每个信号进行标准化（图 3C）： 
	<img alt="静态平衡，z分数方程，符号；用于教育用途，统计分析方法" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"></li>
	<li>采用非负稳健线性回归，将标准化后的 zInt410 与 zInt470 信号拟合（图 3D），回归函数如下： 
	<img alt="线性方程 \(y = ax + b\)；用于线图的公式；数学表示" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ02v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2">
	<ol>
		<li>利用线性回归参数（a、b）计算拟合至 zInt470 的新 zInt410 值（fitInt410，图 3D,E）： 
		<img alt="线性回归方程，fitzInt410 = a * zInt410 + b，用于数据建模。" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算归一化的 dF/F（z dF/F）（图 3F）： 
	<img alt="荧光差值方程，z dF/F = zInt470 - fitzInt410，用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/60278/60278equ04v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4"></li>
</ol>
6. 双色同步记录
<ol>
	<li>在光度测量系统中添加一个560 nm的LED，用于激发红色荧光钙传感器，并配备适当的二向色镜和滤光片（详见Kim等，2016年的详细描述）12。</li>
	<li>在物镜和CMOS相机之间添加一个图像分光器，以分离绿色和红色发射波长（见图5）。图像分光器将在相机传感器上形成两个镜像，分别对应红色和绿色信号（例如，一根具有3个分支的光纤跳线将产生包含6根光纤的图像）。</li>
	<li>按照上述方法，在两种颜色中围绕所有光纤绘制感兴趣区域（ROI）。务必清楚地标记每个ROI所对应的光纤及通道（绿色和红色）（图4A）。</li>
	<li>触发470 nm和560 nm LED的同时激发，并与410 nm LED交替使用（图5A）。</li>
</ol>
7. 双色数据分析
<ol>
	<li>按照第5节中的步骤，找到Int470信号的fitInt410，并计算z dF/F。</li>
	<li>由于红移型GECI的等吸收点通常未知，因此可用410 nm LED在绿色通道中记录的信号对两个通道进行运动校正。按照第5节中的步骤，找到Int560信号的fitInt410，并计算z dF/F。</li>
</ol>

<ol><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Neural+Projection+Dynamics+Underlying+Social+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior.</a> Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).</li>
<li>Proulx, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+pathway+controlling+motivation+to+exert+effort%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A neural pathway controlling motivation to exert effort.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).</li>
<li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Fiber+Photometry+Reveals+Signature+of+Future+Stress+Susceptibility+in+Nucleus+Accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens.</a> Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+shapes+the+aversion+and+reward+responses+of+lateral+habenula+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>de Jong, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neural+Circuit+Mechanism+for+Encoding+Aversive+Stimuli+in+the+Mesolimbic+Dopamine+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System.</a> Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).</li>
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<li>Barker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Preoptic+Control+of+the+Lateral+Habenula+through+Convergent+Glutamate+and+GABA+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission.</a> Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).</li>
<li>Siciliano, C. A., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+calcium+imaging+to+illuminate+circuit+dysfunction+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction.</a> Alcohol. 74, 47-63 (2018).</li>
<li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+fast+measurement+of+circuit+dynamics+at+multiple+sites+across+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain.</a> Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).</li>
<li>Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+multi-fiber+photometry+for+studying+large-scale+brain+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics.</a> Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).</li>
<li>Akam, T., Walton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pyPhotometry%3A+Open+source+Python+based+hardware+and+software+for+fiber+photometry+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3521(2019).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).</li>
<li>Stamatakis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Hypothalamic+Area+Glutamatergic+Neurons+and+Their+Projections+to+the+Lateral+Habenula+Regulate+Feeding+and+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).</li>
<li>Tervo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Designer+AAV+Variant+Permits+Efficient+Retrograde+Access+to+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Amygdala+Somatostatin+Neurons+Gate+Passive+and+Active+Defensive+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).</li>
<li>Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+male+aggression-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomically+Defined+and+Functionally+Distinct+Dorsal+Raphe+Serotonin+Sub-systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems.</a> Cell. 175 (2), 472-487 (2018).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+GCaMP6m%E2%80%99s+Ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLOS ONE. 12 (2), 0170934(2017).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+Enables+Rapid+and+Specific+Detection+of+Dopamine+in+Flies%2C+Fish%2C+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li>
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<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Fluorescent+Sensor+for+Rapid+and+Specific+In+Detection+of+Norepinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine.</a> Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).</li>
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<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Wang, H., Jing, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+brain%3A+genetically+encoded+fluorescent+sensors+for+imaging+neurotransmitters+and+neuromodulators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+optoelectronic+photometers+for+monitoring+neuronal+dynamics+in+the+deep+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Hypothalamic+Network+Dynamics+for+Appetitive+and+Consummatory+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2014).</li>
</ol>

Sage Aronson 是 Neurophotometrics Ltd. 的首席执行官兼创始人，该公司销售多光纤光度测量系统。

光纤光度法是一种简便易行的技术，可使研究人员记录自由活动动物中特定神经元群体的群体钙活动动态。该方法可与多种行为学实验相结合，包括“运动强度高”的任务，如强迫游泳实验2、恐惧条件反射18、社交互动1,4，以及其他行为范式7,8,19,20。这使得研究人员能够观察特定神经元群体的活动由哪些行为或刺激所驱动，反之亦然。
尽管其 初步的 简单性，但在实施光纤光度法时仍有一些重要事项需要考虑，本方案中详述的系统具备多项优势，可规避常见问题。首先，该系统利用了GCaMP变体在约410 nm处存在钙离子无关的等吸...

将神经反应与动物行为的特定方面进行关联的能力，对于理解特定神经元群体在引导或响应某种行为或刺激中所起的作用至关重要。鉴于动物行为的复杂性，即使是看似最简单的动作，也可能受到多种内部状态和外部刺激的影响，因此以单次试验分辨率记录信号的技术为研究人员提供了克服这些局限性的必要工具。
光纤光度测定技术因其相较于其他体内记录技术具有相对简便的操作、较高的信噪比，以及能够在多种行为范式中进行记录等优势，已成为系统神经科学领域众多研究人员的首选技术1,2,3,4,5,6,7,8。与传统的电生理学方法不同，光度测定是一种光学方法，通常与基因编码的钙离子指示剂（GECIs，如GCaMP系列）联合使用9。GECIs在结合钙离子与否的情况下，其荧光能力会发生变化。由于神经元内钙离子浓度受到严格调控，且在神经元产生动作电位时电压门控钙通道会打开，因此细胞内钙离子浓度的瞬时升高会导致GECIs荧光能力的瞬时增强，这种变化可作为神经元放电活动的良好替代指标9。
利用光纤光度法，激发光被引导通过一根细小的多模光纤进入大脑，并通过同一根光纤收集发射信号。由于这些光纤重量轻且可弯曲，动物可以几乎不受限制地活动，使该技术能够与多种行为学测试和实验条件相兼容。某些情况，例如快速运动或光纤连接线弯曲超过其能维持全内反射的半径，可能会引入信号伪影。为了区分真实信号与噪声，我们可以利用GCaMP的一个特性，称为“等吸收点”。简而言之，对于GCaMP，当激发光波长向短波方向偏移时，其在钙结合状态下的发射光强度降低，而在无钙结合状态下的发射光强度略有增加。这两种发射光相对强度相等的波长点即被称为等吸收点。当在该波长点激发GCaMP时，其发射光不受细胞内钙离子浓度变化的影响，信号的波动通常主要源于光纤连接线过度弯曲导致的信号衰减，或脑组织相对于植入光纤的移动。
单细胞电生理学由于具有单细胞和单峰电位水平的分辨率，仍然是自由活动动物在体记录的金标准。然而，确定所记录细胞的分子身份可能较为困难，且事后分析过程可能相当繁琐。虽然光纤光度法不具备单细胞分辨率，但它使研究人员能够提出并解决传统技术无法涉及的问题。通过结合病毒策略与转基因动物，可将GECIs的表达定向至基因定义的神经元类型，从而记录特定神经元群体或投射定义的神经活动，该过程可通过直接监测轴突末梢的钙信号来实现10,11。此外，通过植入多个光纤套管，可在同一只动物中同时监测多个脑区和通路的神经活动12,13。
本文中，我们描述了一种单光纤和多光纤光度记录技术，介绍了如何校正与钙离子无关的伪影，并详细说明了单色和双色记录的实施方法。我们还举例说明了该技术能够回答的问题类型及其日益增加的复杂性（见图1）。本实验方案中详述的多光纤记录光度系统可通过访问 https://sites.google.com/view/multifp/hardware 获取所需材料清单进行搭建（图2）。
系统必须配备能够支持410 nm和470 nm激发波长的装置，以检测GCaMP6或其变体产生的钙离子依赖性和钙离子非依赖性荧光发射。对于自行搭建的实验系统，或在缺乏可用系统控制软件的情况下，可使用免费的开源程序Bonsai（http://www.open-ephys.org/bonsai/）。此外，光纤光度测定也可通过MATLAB（例如，https://github.com/deisseroth-lab/multifiber）12或其他编程语言14实现。系统的软件和硬件应能够控制410 nm和470 nm的LED以及相机，实现图像采集（图2），并计算在图像上围绕光纤绘制的兴趣区域（ROIs）内的平均荧光强度。输出结果应为一张表格，记录每根光纤在470 nm和410 nm LED激发下测得的平均强度值。在进行多光纤实验时，400 µm的光纤束可能会限制小鼠的活动。在此类情况下，我们建议使用200 µm的光纤跳线，以提供更高的灵活性。在小鼠训练期间，也可考虑使用更小的假电缆。
在光纤光度记录过程中，能够提取感兴趣事件的时间点至关重要。如果系统未提供内置机制来整合特定事件的TTL信号，则可采用另一种策略，即为记录的各个时间点分配时间戳，以与实验期间的特定时刻和事件对齐。时间戳可利用计算机时钟来实现。

<table><tbody><tr><td>1/4&quot;-20 不锈钢帽头螺钉，1&quot; 长</td><td>Thorlabs</td><td>SH25S100</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot;-20 不锈钢帽头螺钉，1/2&quot; 长</td><td>Thorlabs</td><td>SH25S050</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot;-20 不锈钢帽头螺钉，3/8&quot; 长</td><td>Thorlabs</td><td>SH25S038</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;m，0.50 NA，SMA-SMA 光纤跳线</td><td>Thorlabs</td><td>M59L01</td><td></td></tr><tr><td>12.7 mm 光学支杆</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td><td></td></tr><tr><td>12.7 mm 底座式支杆固定器</td><td>Thorlabs</td><td>PH20EM</td><td></td></tr><tr><td>15 V，2.4 A 电源单元，带用于 T-Cube 的 3.5 mm 插孔连接器</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td></td></tr><tr><td>20倍物镜</td><td>Thorlabs</td><td>RMS20X</td><td>图2中标记为#10，图5中标记为#11</td></tr><tr><td>30 mm 笼式立方体，带二向色滤光片支架</td><td>Thorlabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td>图2中标记为#8-9，图5中标记为#8-10</td></tr><tr><td>405 nm LED</td><td>Doric Lenses</td><td>CLED_405</td><td>图2中标记为#2</td></tr><tr><td>410 nm 带通滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>FB410-10</td><td>图2中标记为#5，图5中标记为#7</td></tr><tr><td>465 nm LED</td><td>Doric Lenses</td><td>CLED_465</td><td>图2中标记为#1</td></tr><tr><td>470 nm 带通滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>FB470-10</td><td>图2中标记为#4，图5中标记为#6</td></tr><tr><td>560 nm 带通滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-560/14-25</td><td>图5中标记为#5</td></tr><tr><td>560 nm LED</td><td>Doric Lenses</td><td>CLED_560</td><td>图3中标记为#1</td></tr><tr><td>五轴运动学安装座</td><td>Thorlabs</td><td>K5X1</td><td>图2中标记为#11，图5中标记为#12</td></tr><tr><td>消色差双合透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A-ML</td><td>图2中标记为#7</td></tr><tr><td>405 nm 准直器适配器</td><td>Thorlabs</td><td>AD11F</td><td>图2中标记为#3，图5中标记为#4</td></tr><tr><td>可调准直器适配器</td><td>Thorlabs</td><td>AD127-F</td><td>图2中标记为#3，图5中标记为#4</td></tr><tr><td>铝制光学平台板</td><td>Thorlabs</td><td>MB1824</td><td></td></tr><tr><td>夹紧叉</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td></td></tr><tr><td>立方体连接器</td><td>Thorlabs</td><td>CM1-CC</td><td></td></tr><tr><td>双通道 493/574 二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF493/574-Di01-25x36</td><td>图5中标记为#10</td></tr><tr><td>GCaMP6 发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-535/22-25</td><td>图2中标记为#6</td></tr><tr><td>带黑色硬质纤维板的外壳</td><td>Thorlabs</td><td>XE25C9</td><td></td></tr><tr><td>外置 SM1 螺纹加工用端盖</td><td>Thorlabs</td><td>SM1CP2M</td><td></td></tr><tr><td>快速更换 SM1 镜筒滤光片支架</td><td>Thorlabs</td><td>SM1QP</td><td>图2中标记为#4-6，图5中标记为#5-7</td></tr><tr><td>405 nm 光固定准直器</td><td>Thorlabs</td><td>F671SMA-405</td><td>图2中标记为#3，图5中标记为#4</td></tr><tr><td>470 nm 和 560 nm 光固定准直器</td><td>Thorlabs</td><td>F240SMA-532</td><td>图2中标记为#3，图5中标记为#4</td></tr><tr><td>绿色发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td>位于光束分光器内</td></tr><tr><td>高分辨率 USB 3.0 CMOS 相机</td><td>Thorlabs</td><td>DCC3260M</td><td>图2中标记为#13，图5中标记为#15</td></tr><tr><td>光束分光器</td><td>Neurophotometrics</td><td>SPLIT</td><td>图5中标记为#14</td></tr><tr><td>长通二向色镜，425 nm 截止</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP425R</td><td>图2中标记为#8，图5中标记为#9</td></tr><tr><td>长通二向色镜，495 nm 截止</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td>图2中标记为#9，图5中标记为#8</td></tr><tr><td>Metabond 牙科水泥</td><td>C&amp;B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M8 - M8 电缆</td><td>Doric Lenses</td><td>Cable_M8-M8</td><td></td></tr><tr><td>光纤套管</td><td>Doric Lenses</td><td></td><td>需注明这些将用于需要低自发荧光的光度测量实验</td></tr><tr><td>光纤跳线</td><td>Doric Lenses</td><td></td><td>需注明这些将用于需要低自发荧光的光度测量实验</td></tr><tr><td>红色发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>FF01-600/37-25</td><td>位于光束分光器内</td></tr><tr><td>T7 LabJack</td><td>LabJack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-cube LED 驱动器</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>USB 3.0 I/O 电缆，Hirose 25，用于 DCC3240</td><td>Thorlabs</td><td>CAB-DCU-T3</td><td></td></tr></tbody></table>

用于记录自由活动动物神经活动的多光纤光度法

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

在自由活动的动物体内记录一群神经元的活动是一项具有挑战性的任务。此外，随着大脑被划分为越来越小的功能亚区，对神经元投射和/或遗传学定义的神经元亚群进行记录变得至关重要。光纤光度法是一种简便而强大的方法，能够克服这些挑战。通过结合光学与遗传学技术，可在深部脑区表达基因编码的钙指示剂，将神经元活动转化为易于检测的光学信号，从而实现对神经活动的测量。本实验方案详细介绍了多光纤光度系统的组成、如何进入深部脑区以递送和收集光信号、校正运动伪影的方法，以及荧光信号的处理与分析流程。本方案还阐述了在单根或多根植入式光纤上进行单色或双色成像时的实验注意事项。

行为反应的神经关联可能因多种因素而异。在此示例中，我们采用体内光纤光度法测量来自外侧下丘脑区（LHA）并投射至外侧缰核（LHb）的轴突末梢的活动。将编码GCaMP6s的腺相关病毒（AAV-hSyn-GCaMP6s）注射至野生型小鼠的LHA区域，并将光纤植入LHb上方紧邻处（图4A）。GCaMP6s在LHA的胞体及其投射至LHb的轴突末梢中表达，可在该区域记录钙信号。LHA-LHb通路的激活在实时偏好测试中促进被动回避行为，提示该通路传递厌恶信号16。随后将小鼠连接至光纤光度系统，置于开放旷场中6分钟，并每隔60秒给予1秒的厌恶气流刺激。测量结果显示，荧光信号在气流刺激施加时显著升高（图4B-C）。而在表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠中，气流刺激期间未检测到信号变化（图4C）。行为测试结束后，通过组织学方法确认了L...

本方案详细介绍了如何实施和进行多光纤光度记录，如何校正钙离子非依赖性伪影，以及双色光度成像的重要注意事项。

在自由活动的动物中记录一群神经元的活动具有较大挑战性。此外，随着大脑被分解为越来越小的结构单元……

光纤光度法CSOM成像结合基因编码的定制指示剂和光纤，用于监测自由活动动物的神经活动。这对于理解特定神经元群体在引导或响应某种行为或刺激中的作用至关重要。该技术提供了一种便捷的方法，可记录由其连接特性或基因特征定义的特定脑区活动，并内置对照机制以区分信号与噪声。由本实验室的研究生 Ekaterina Martianova 演示该操作步骤。首先松开五轴位移器上的所有螺丝，然后将光纤跳线拧入固定在五轴位移器上的适配器中。然后以低功率开启470纳米激发光，将光纤尖端对准一块自发荧光塑料载玻片。接着以实时模式记录互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的信号。提高增益或调整查找表，直至在物镜的焦点位置可见图像。将五轴平移台向物镜方向推进，确保470纳米的光线对准跳线SMA或FC端的光纤中心，直至相机上能够分辨出图像。最后，调节X轴和Y轴，使图像居中且清晰聚焦。观察跳线小孔端发出的光，应呈现为一个各向同性的圆形光斑。首先打开所有激发光源，以便更清晰地观察纤维。调整相机增益，确保无像素饱和，并能获得纤维的清晰图像。然后拍摄一张初步图像。在纤维周围绘制感兴趣区域（ROI）。并在记录期间保留这些区域以测量平均强度值。对于多纤维记录，需通过同时记录所有纤维的实时信号来验证其独立性。将一根光纤对准光源，并用手指轻敲。观察通道中的信号波动。然后在光纤末端贴上彩色胶带，以标记每个感兴趣区域（ROI）对应的是哪根光纤。最后，使用支架、夹子和固定器将光纤跳线悬挂在实验区域上方，以设置记录区域。最后，确保动物活动时不会因光纤长度受限，能够自由地在整个实验区域内移动。首先通过肉眼以及微型光纤显微镜检查光纤跳线末端的光纤。如果光纤表面有划痕，请使用细粒度的光纤抛光膜重新抛光光纤。然后用70%乙醇和棉签清洁跳线的远端。使用70%乙醇和棉签清洁光纤插管。将光纤跳线的variole端通过覆盖黑色热缩管的陶瓷分束套管连接至植入的光纤上。连接时，确保套管紧密贴合。让动物恢复几分钟。然后开始记录光学信号，并运行实验。在记录过程中，需密切观察实时轨迹，以确保记录质量。同时注意观察信号是否出现跳跃，这可能表明套管不够紧密。对于双色记录，在光度测量系统中添加一个516纳米的LED，以激发红色荧光钙探针，并配备适当的二向色镜和滤光片。然后在物镜和CMOS相机之间添加一个图像分光器，以分离绿色和红色发射波长。最后，在两种颜色（红色和绿色）中分别围绕所有纤维绘制感兴趣区域（ROI）。务必使用相应的光纤和通道明确定义每个ROI。使用470纳米和560纳米LED触发同步激发，并与410纳米LED交替进行。结果显示，在激活LHA-LHB通路的小鼠中，施加气流刺激时测得的荧光信号显著增加。然而，在表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠中，给予气流刺激期间未检测到信号变化。该技术可使研究人员在动物自由活动时，合理地记录不同脑区特定类型细胞的活动。这有助于进一步解析这些脑区在行为中的功能。

multi-fiber-photometry-to-record-neural-activity-freely-moving

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

多纤维光测量记录自由移动动物的神经活动

通过将神经生理记录与高速视频技术相结合，可获得自由活动动物神经活动模式的非侵入性测量结果。...

自由活动动物神经环路激活的记录

本视频展示了一种利用光纤光度法在自由活动的小鼠中记录神经活动的方法。该方法中，特定脑区的神经元表达一种基因编码的钙离子指示剂。对该脑区施加刺激，并测量荧光强度随刺激依赖性的变化，从而识别神经活动。...

使用光纤光度法记录自由活动小鼠的神经活动

该方法为小鼠在显微成像或单细胞电生理记录期间提供了一个可感知且熟悉的环境，使其能够在动物头部被牢固固定的情况下进行导航与探索。...

平底式气浮平台：一种将清醒自由活动啮齿类动物行为学与显微成像或电生理记录相结合的新方法

本方案介绍了一种利用吸收型电压敏感染料和光电二极管阵列，在非转基因无脊椎动物物种中以单细胞分辨率成像神经元群体活动的方法。该方法可实现快速的工作流程，可在一天内完成成像与分析。...

基于光电二极管的光学成像技术用于在非转基因无脊椎动物中以单神经元分辨率记录神经网络动态

当与头部固定板及兼容单光子和双光子显微镜的光学设计结合使用时，微棱镜透镜在多种条件下测量垂直神经元柱中的神经反应方面具有显著优势，包括在头部固定状态下的精确控制实验，或在自由活动动物中进行的自然行为任务。...

使用微棱镜对自由活动和头部固定动物中已鉴定的神经元群体进行长期成像

该方案包括换能器制造、参数报告、手术操作以及信号记录，涵盖了在自由活动小鼠中同步进行聚焦超声神经调控和光纤光度记录的整个操作流程。...

自由活动小鼠中同步进行聚焦超声神经调控与光纤光度记录

采用全光学方法，在清醒且行为正常的小鼠脑卒中新兴核心区域，利用荧光生物传感器同时记录神经元Ca2+活动，以诱导缺血性脑卒中。...

在活动小鼠中同时进行光栓塞与光纤光度法以诱导并监测缺血性脑卒中

本方案全面描述了一种可同时记录多个与记忆相关脑区中神经元和星形胶质细胞钙信号的方法，并展示了其在学习与记忆行为范式中的应用。...

一种双色光纤光度法用于记录学习与记忆行为过程中多个脑区的星形胶质细胞-神经元活动

本方案提供了一种整合性方法，包括病毒递送、光探针植入、光血栓诱导、星形胶质细胞与神经元活动的同步记录，以及星形胶质细胞的光遗传学刺激。该整合性方法旨在对缺血性脑卒中从急性期到慢性期各个阶段的星形胶质细胞-神经元相互关系进行同步研究。...

一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

本文介绍了在小鼠颅骨上植入超薄聚酰亚胺基微电极阵列（PBM-array）以获取小鼠模型高密度脑电图（EEG）的手术步骤及操作要点。...

基于聚酰亚胺的微电极对自由活动小鼠进行高密度脑电图记录

学习多光纤光测量技术，用于记录自由移动动物的神经活动并校正钙无关伪影。该方法结合双色成像，帮助研究人员深入理解特定神经元在行为反应中的功能机制。

用于记录自由活动动物神经活动的多光纤光度法

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