成年小鼠耳蜗表面制备

耳蜗表面制备技术可利用免疫组织化学和共聚焦成像对柯蒂氏器的整个听觉毛细胞层进行可视化观察。该方法已广泛应用于特定耳蜗病理学的研究。我们将对耳蜗显微解剖方法进行改良。

该技术的主要优势在于，耳蜗上皮组织能够牢固地贴附于10毫米圆形盖玻片上，从而在免疫标记过程中避免多次洗涤步骤中的组织丢失。此外，耳蜗病理学研究中，耳蜗表面制备还可用于评估基因表达及毛细胞再生。该技术需要具备基本的显微镜操作技能，而对方法进行直观演示有助于确保每一步骤均被正确执行。

本实验操作将由我实验室的研究生 Qiaojun Fang 演示。进行颞骨提取时，动物安乐死后立即向前牵拉皮肤以暴露颅骨，用剪刀沿颅骨中线从后向前剪开颅骨。先用镊子去除脑组织，然后用拇指和食指手动分离三个月龄及以上小鼠的颞骨。

将骨组织放入直径为30毫米的培养皿中，培养皿内含有新鲜的冰上预冷的4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS），在解剖显微镜下操作，从卵圆窗处移除镫骨。用5号镊子刺破圆窗膜，并使用连接在含有新鲜4%PFA的一毫升注射器上的27号针头，在耳蜗顶处打一小孔。通过圆窗和卵圆窗缓慢而轻柔地灌注固定液，直至溶液从耳蜗顶部的小孔中流出。

然后将最多两个灌注过的耳蜗分别转移至含有10毫升4%PFA的20毫升闪烁瓶中，于室温下轻轻振荡样品2小时，随后在4摄氏度下于旋转仪上过夜保存。次日早晨，用新鲜的PBS对耳蜗进行三次洗涤，每次洗涤5分钟。最后一次洗涤后，向每个瓶中加入20毫升4%EDTA，并在4摄氏度下轻轻振荡旋转样品48小时。

孵育结束后，用镊子轻触每个耳蜗的骨性前庭部分，以评估样品的弹性。如果骨组织呈现弹性而非坚硬，则表明耳蜗已脱钙完全。将每个样品中的EDTA替换为新鲜的PBS。

进行耳蜗上皮的显微解剖时，用镊子夹住颞骨的前庭部分，使用解剖刀以45度角切割耳蜗顶回。沿圆窗与卵圆窗之间隐约可见的分界线垂直切割，将耳蜗部分与前庭部分分离，并将耳蜗部分摆放至底回朝向培养皿底部、中回朝向培养皿顶部。在此位置下，从之前移除顶回的一端开始，向耳蜗中回的骨囊和外侧壁进行切割，并继续切割，直至完全分离中回部分与底回及钩区。

将基底部分和钩状部分放置于培养皿中，使基底膜一侧朝向培养皿底部，垂直切割去除钩状区域的内侧部分，以移除内侧组织，并切割基底部分与钩状部分，从而分离钩状区域。为避免组织变形，应在分离基底回和钩状区域之前，先切除钩状区域的内侧部分。切除中回相对较大的骨性囊壁和侧壁组织，用镊子夹住侧壁，使骨性囊壁和侧壁与培养皿底部对齐，从基底膜侧切割去除这些组织。

接下来，将标本展平，使感觉毛细胞表面朝上，并剪除其余的骨性囊壁和侧壁。然后用镊子去除前庭膜，完全分离中段区域，并按上述方法去除剩余螺旋部分的骨性囊壁、侧壁组织和前庭膜区域。当所有耳蜗螺旋部分均完成解剖后，在一个直径10毫米的圆形盖玻片中心滴加0.5 µL细胞与组织粘附剂，于室温下静置干燥3至5分钟。

将干燥的盖玻片放入培养皿中，并将每份感觉上皮样本的四个部分全部贴附于一张盖玻片上。然后用镊子夹住每张盖玻片的一边，将标本转移至四孔细胞培养板的各个孔中，用于免疫标记。对于耳蜗表面突触制备样本的免疫标记，每份感觉上皮需用新鲜的PBS洗涤三次，每次五分钟，随后在旋转仪上于室温下用2毫升2%非离子型表面活性剂处理30分钟。

孵育结束后，用移液器吸尽各孔中的表面活性剂溶液，并在室温下于旋转器上轻轻振荡，每孔加入100 µL封闭液封闭非特异性结合位点，封闭1小时。封闭孵育结束后，在轻微振荡条件下用PBS洗涤样本3次，随后每孔加入100 µL目标一抗溶液，在37°C避光孵育24小时。次日，用新鲜PBS洗涤样本3次，每次均在轻微振荡条件下进行，然后每孔加入100 µL相应的目标二抗溶液，在37°C避光孵育2小时。

孵育结束后，用新鲜的 PBS 每次洗涤 5 分钟，共洗涤 3 次，然后将每张盖玻片样品面向上放置于独立的玻璃显微镜载片上。接下来，小心地在每张盖玻片中央加入 8 µL 适当的封片介质，并用镊子将另一张 10 mm 盖玻片覆盖在每个样品上。然后用透明指甲油密封每张盖玻片夹心的边缘，将样品放入纸板载片盒中，并于 4 °C 保存载片。

尽管成年小鼠耳蜗用于铺片制备的解剖操作并不简单，但刚接触该技术的研究人员在练习10至15个耳样本后应能够掌握该方法。对未经处理的10至12周龄CBAJ小鼠耳蜗铺片进行CTBP2和GluA2免疫标记显示，突触前带状体和突触后终末分别位于内毛细胞核下方，且彼此相邻，表明存在功能性突触。对肌球蛋白7A进行免疫标记，并结合鬼笔环肽和DAPI复染，可显示感觉毛细胞（包括外毛细胞和内毛细胞）及其细胞核的存在。

使用肌球蛋白7A免疫标记并用鬼笔环肽复染，结果显示无论是否使用细胞和组织粘附剂，免疫反应性或均匀性均无差异。此外，对未经处理的6至8周龄C57黑6小鼠进行表面制备的扫描电镜观察，显示样本中外毛细胞三排V形排列的静纤毛结构良好。请注意，应通过圆窗和卵圆窗缓慢轻柔地向耳蜗内灌注固定液，直至液体从顶部的小孔流出为止。

在将钩状区域与基底回分离之前，需注意将钩状区域上的内侧部切下，以方便去除内侧部。