小肠神经内分泌肿瘤类球体的建立与表征

高分化的SBNET细胞生长缓慢且难以传代。目前已建立的细胞系极少，且研究人员难以获得。为克服这些局限性，我们开发了这种三维培养方案。

与建立SBNET细胞系的传统方法相比，该技术的优势在于可在三周内获得三维培养物并进行药物测试。该方法可应用于其他神经内分泌肿瘤，例如胰腺来源的神经内分泌肿瘤。获取切除的患者SBNET样本后，将其切成5毫米的立方体，并置于含有25毫升DMEM/F12培养基的锥形管中用于运输。

根据文稿说明配制洗涤液，将肿瘤组织在其中孵育15分钟。随后转移至新的培养皿中，使用无菌弯剪将组织切碎至小于1毫米的片段。将切碎的组织转移至一个新的50毫升离心管中，管内含25毫升洗涤液，然后在4°C条件下以500 × g离心15分钟。

弃去上清液，并将沉淀重悬于含有胶原酶和DNase的10毫升洗涤培养基中。将剪碎的肿瘤组织在37°C条件下缓慢振荡消化90分钟。注意避免过度消化肿瘤样本。

酶用量过多或孵育时间过长均会导致SBNET细胞死亡。消化完成后，在4摄氏度条件下以500 × g离心15分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于15毫升洗涤培养基中。

将一个70微米的细胞滤网置于一个新的50毫升离心管上方，通过滤网加入10毫升洗涤缓冲液。轻轻摇动管内的洗涤缓冲液，防止细胞黏附在管壁上。随后将细胞悬液通过滤网过滤。

在4 °C条件下，以500 × g离心细胞15分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL洗涤液中。将离心管置于冰上，取5 µL细胞悬液，用血细胞计数板进行细胞计数。

计算细胞数量，然后重复离心以去除上清液，并将细胞重悬于液态细胞外基质（ECM）中，浓度为每毫升一百万个细胞。接着，将5至20微升含SBNET类球体的ECM转移至96孔板中，将板置于37摄氏度培养箱内，使液态ECM凝固。向含有类球体的每个孔中加入200微升SBNET培养基，或如前所述在干细胞培养基中培养类器官。

使用 P1000 移液器将类器官转移至 1.5 毫升离心管中，在 1,500 ×g 条件下离心 1 分钟以去除上清液。用 1 毫升 PBS 洗涤培养物，再次离心以去除上清液。然后加入 500 微升多聚甲醛固定类器官，并于室温孵育 15 分钟。

孵育结束后，用一毫升 PBS 洗涤培养物两次。加入含有 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 500 微升 PBS，以对培养物进行通透处理。将离心管孵育五分钟，然后用一毫升含 3% BSA 的 PBS 洗涤类器官三次。

接下来，将细胞与一抗在室温下孵育一小时，然后用 PBS 和 BSA 重复洗涤。随后与二抗孵育，并重复洗涤步骤，确保吸除并弃去所有上清液。为观察类球体，加入 5 µL 含 DAPI 的封片剂，并使用 P20 移液器将 5 µL 类球体转移至载玻片上。

用盖玻片封片，并使用10、20和40倍物镜在荧光显微镜下观察成像。用P1000移液器机械性破坏细胞外基质（ECM），并将其转移至无菌的1.5毫升离心管中。在4°C条件下，以1,000 × g离心该离心管。

然后完全去除上清液，将离心管置于冰上。向沉淀中加入新ECM体积的2至4倍，通过移液吹打10次混匀管内物质，注意避免产生气泡。取5至20微升ECM与SBNET混合物转移至新的96孔板中，静置使ECM凝固。

然后用新的SBNET培养基覆盖已固化的ECM，并将培养板放入培养箱中。若需将SBNET类球体运送至其他实验室，则将类球体连同新ECM一起转移至T25培养瓶中，静置使ECM固化。随后加入SBNET类球体培养基至满，拧紧瓶盖，并准备运输包装。

收到球体培养物后，移除培养基，并重复之前的步骤将球体重新放入培养。通过显微成像监测SBNET球体的生长速率。当培养基每周更换一次时，SBNET球体体积增至两倍大约需要14天。

培养14天后，SBNET类球体未见体积增大。使用针对突触素、嗜铬粒蛋白A和SSTR2的特异性抗体对类球体进行染色，并通过免疫荧光显微镜成像。数据显示，这些标志物定位于SBNET细胞的细胞质及细胞膜。

为确保抗体的特异性，对一种不表达突触素、嗜铬粒蛋白A和SSTR2的胰腺肿瘤类器官系进行了相同的染色操作，结果未检测到绿色信号。免疫荧光成像的主要优势在于可在四小时内完成，并提供与免疫组织化学相似的染色信息。将SBNET培养为球状体是一种有价值的技術，可用于鉴定能够抑制SBNET生长的药物。

类球体用雷帕霉素和mTOR抑制剂处理。五天后，经雷帕霉素处理的类球体形成葡萄样结构，并出现凋亡或坏死。在进行此操作时，重要的是预先用洗涤培养基润湿细胞滤筛和收集管。

这将防止SBNET细胞粘附在细胞筛网和塑料管上。通过本方案，科研人员和临床医生可以从切除的肿瘤中建立SBNET类球体培养物，与其他实验室共享，并用于测试经FDA批准的药物。