一种用于延长斑马鱼全胚胎共聚焦显微延时成像的分层封片方法

我们开发了一种用于延时成像的固定方法，该方法既能允许脆弱的斑马鱼胚胎自由生长，同时又能使其保持完全固定的位置。该固定方法快速、简便且成本低廉，适用于任何倒置显微镜上的实验室成像。我们开发此方法主要用于活体斑马鱼胚胎的成像，但也可稍作修改，用于其他小型水生动物模型的成像。

首先进行成年斑马鱼的繁殖。下午时，将斑马鱼以1:2的雄雌比例放入繁殖缸中。随后，在胚胎培养基中配制1%低熔点琼脂糖的储备溶液，并用微波炉加热使其溶解。

将琼脂糖溶液分装至1.5毫升离心管中。用蒸馏水配制4%三卡因（tricaine）储存液，并将琼脂糖和三卡因溶液于4摄氏度保存。三卡因具有毒性，须在通风橱内称量和配制。

交配后，在培养皿中用 E3 培养基收集斑马鱼胚胎，并在封片前于 26.5 °C 下孵育约 28 小时。用 0.02% 三卡因麻醉胚胎，然后在显微镜下轻轻夹住并拉开卵膜以去除卵膜，释放胚胎。封片前，将琼脂糖溶液加热至 65 °C，随后冷却至约 30 °C，以免高温损伤胚胎，并在琼脂糖溶液中加入三卡因。

使用底部带有直径为零的盖玻片的35毫米玻璃底培养皿。用玻璃移液管或微量移液器轻轻将去壳的胚胎放置于培养皿底部，使其一侧朝下，然后用微量移液器小心吸除残留的E3溶液。将第一种琼脂糖溶液加入由贴附于培养皿底部的盖玻片形成的小凹槽中，以覆盖胚胎，注意确保琼脂糖溶液充满小凹槽但不溢出。

用盖玻片覆盖小孔，形成一个狭窄的琼脂糖填充空间，使胚胎位于两片盖玻片之间。在整个培养皿底部的盖玻片上方覆盖一层1%琼脂糖溶液，待其凝固后可固定盖玻片。然后用含有0.02%三卡因的E3溶液填充培养皿的剩余部分，以保持系统湿润。

为了确定第一层琼脂糖的最佳浓度，将胚胎置于浓度递增的琼脂糖中，并进行延时成像，以确定能够最小化胚胎形变和运动性的琼脂糖浓度，然后根据结果测试更精细浓度范围的琼脂糖。本实验方案中最关键的步骤是确定第一层琼脂糖的最佳浓度。可测试不同纳米浓度的琼脂糖，例如 0.030%、0.032% 等。

以确定最佳浓度。对胚胎进行延时成像时，使用带有培养箱的显微镜载物台，将温度设置为28.5摄氏度，并持续成像长达55小时。若需同时对多个胚胎进行成像，可使用可承载多个培养皿的载物台适配器，并逐一旋转培养皿，使胚胎处于水平位置。

选择低倍物镜，然后通过目镜定位胚胎，最后通过旋转培养皿将其水平对齐。在软件中记录胚胎的位置，并为数据自动保存创建文件名。设置针孔大小、扫描速度、图像尺寸和缩放倍数。

然后选择更高的放大倍数以采集图像，并设置需要成像的荧光通道。针对每个通道，调节激光功率和探测器高压，确保在避免信号饱和并尽量减少光漂白的前提下，获得最佳的动态范围。接下来，若使用10倍物镜对整个胚胎进行成像，需在软件中设置大图采集参数，以拍摄多个视野并将其拼接成完整图像，同时调整胚胎的位置，确保其完全位于该大图像区域内。

根据文稿说明设置Z轴层扫图像采集参数。为在长期延时成像过程中维持多个胚胎的聚焦，需使用自动对焦功能，并为每个胚胎调整独立的偏移量，以使其聚焦于参考平面。随后在显微镜软件中设置延时成像参数，以每小时一次的频率连续成像55小时。

每个周期中，依次采集两个胚胎数据集，并自动保存数据。使用显微镜软件处理图像。如果对多个胚胎进行了成像，则根据成像位置将数据集拆分，为每个胚胎创建独立的文件。

使用最大强度投影或类似工具将三维时间数据集转换为二维时间数据集。最后，通过保存为 AVI 格式并选择无压缩选项，以每 200 毫秒一帧的速度生成视频文件，实现每秒五帧的播放速度。这种分层固定方法能够在允许斑马鱼胚胎生长的同时限制其运动，从而实现对胚胎的成像。

如果琼脂糖浓度过高，胚胎会发生变形；但如果浓度过低，在延时显微成像过程中胚胎会移出视野。最佳琼脂糖浓度范围为 0.028% 至 0.034%。对整胚表达红色荧光蛋白（RFP）、血管内皮细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）的活体转基因斑马鱼进行了长达 55 小时的成像观察，期间记录了体节间血管的出芽、肠下血管和头部血管的发育，以及尾静脉网的凝聚与躯干延伸过程。

通过成像表达GFP的胚胎和运动神经元，以观察运动神经元的发育过程。运动神经元的轴突从神经管腹侧发出，跨越体节向胚胎腹侧延伸。利用更高倍数的放大，对运动神经元轴突背侧出芽的共发育过程及其与节间血管位置的关系进行了成像观察。

这使得能够可视化神经管腹侧轴突出芽以及背侧轴突出芽的更细微细节。随着体节数量的增加，体节在长度和宽度上也相应延伸。该过程通过表达肌肉中绿色荧光蛋白（GFP）的转基因胚胎成像实现。

由于琼脂糖的最佳浓度范围非常狭窄，因此在配制琼脂糖母液时，其用量对微小的测量误差极为敏感，且每批新配制的琼脂糖溶液均需重新确定最佳浓度。设定成像参数时必须谨慎，包括图像尺寸与分辨率、扫描速度、放大倍数、检测器高压电压以及激光功率，以确保不同实验之间的结果一致性，并减少长期延时成像过程中光毒性与光漂白的发生可能性。采用此种固定方法对转基因斑马鱼胚胎进行处理后，结合对整个生物体的长时间延时成像，我们能够直观地观察不同组织如何协同发育。