Name: 通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习利用反相液相色谱-质谱联用技术对无细胞蛋白合成中的40种中心碳代谢和能量代谢相关代谢物进行绝对定量。该方法采用苯胺衍生化提高分离效果，结合同位素标记内标实现精准定量，为合成生物学研究提供可靠分析手段。

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本研究工作由美国国家癌症研究所（https://www.cancer.gov/）资助，资助编号为1U54CA210184-01，项目名称为癌症代谢物理学研究中心。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家癌症研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. 苯胺标记试剂的制备
<ol>
	<li>制备 pH 4.5 的 6 M 苯胺溶液。在通风橱中操作，将 550 µL 苯胺、337.5 µL LCMS 级水和 112.5 µL 12 M 盐酸（HCl）加入离心管中混合。充分涡旋混匀，并在 4 °C 下保存。 
	注意：苯胺溶液可在 4 °C 下保存 2 个月。 
	警告：苯胺具有高毒性，必须在通风橱中操作；盐酸具有强腐蚀性。</li>
	<li>制备 pH 4.5 的 6 M 13C 苯胺溶液。将 250 mg 13C6-苯胺与 132 µL 水和 44 µL 12 M HCl 混合。充分涡旋混匀，并在 4 °C 下保存。</li>
	<li>制备 200 mg/mL N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液。每份待标记样品中加入 2 mg EDC 溶于 10 µL 水中，充分涡旋混匀。 
	注意：EDC 溶液应在反应当天配制。EDC 可作为苯胺衍生化反应的催化剂12。</li>
</ol>
2. 标准品的制备
<ol>
	<li>使用液相色谱/质谱级水分别配制所有化合物的储备液（表1）。</li>
	<li>内标储备液的配制
	<ol>
		<li>除烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、乙酰辅酶A（ACA）和3-磷酸甘油（Gly3P）外，将所有化合物按适当体积混合，配制成各成分为2 mM的储备液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将NAD、NADP、FAD、ACA和Gly3P按适当体积混合，配制成2 mM的储备液。</li>
</ol>
3. 样品制备（图1）
<ol>
	<li>向无细胞蛋白合成反应体系中加入等体积预冷的100%乙醇，以终止反应并沉淀蛋白质。在4 °C条件下，以12,000 × g 离心15分钟。将上清液转移至新的离心管中。 
	注意：样品可在-80 °C长期保存，后续再进行分析</li>
</ol>
4. 标记反应
<ol>
	<li>使用 12C-苯胺溶液标记样品
	<ol>
		<li>将6 µL样品转移至新的离心管中，并用水补足至50 µL。 
		注意：样品体积可能取决于特定的CFPS反应。</li>
		<li>加入5 µL的200 mg/mL EDC溶液。</li>
		<li>加入5 µL的12C-苯胺溶液。 
		注意：苯胺溶液会分层，使用前需充分混匀。</li>
		<li>室温下轻轻振荡反应液2小时。</li>
		<li>2小时后，从摇床取出离心管，在通风橱中向反应体系加入1.5 µL三乙胺（TEA）。 
		注意：三乙胺可提高溶液pH值，从而终止苯胺标记反应并稳定化合物。 
		警告：三乙胺具有毒性，可引起眼睛和呼吸道刺激。</li>
		<li>以13,500 × g 离心3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 13C-苯胺溶液标记内标物
	<ol>
		<li>将内标储备液稀释至80 µM，最终体积为50 µL。 
		注意：内标物浓度可根据实验样品的水平进行调整。</li>
		<li>加入5 µL的200 mg/mL EDC溶液。</li>
		<li>加入5 µL的13C-苯胺溶液。</li>
		<li>室温下轻轻振荡反应液2小时。</li>
		<li>2小时后，从摇床取出离心管，在通风橱中向反应体系加入1.5 µL TEA。</li>
		<li>以13,500 × g 离心3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>混合标记后的内标物与标记后的样品
	<ol>
		<li>将25 µL的12C-苯胺标记样品与25 µL的13C-苯胺标记内标物混合。</li>
		<li>转移至自动进样瓶中，并按LC/MS程序进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立未标记代谢物的标准曲线
	<ol>
		<li>将未标记代谢物（NAD、NADP、FAD、ACA和Gly3P）的储备液稀释至最终浓度分别为320 µM、80 µM、20 µM和5 µM，体积为50 µL。</li>
		<li>加入5 µL的200 mg/mL EDC溶液。</li>
		<li>加入5 µL的12C-苯胺溶液。</li>
		<li>室温下轻轻振荡反应液2小时。</li>
		<li>2小时后，从摇床取出离心管，在通风橱中向反应体系加入1.5 µL TEA。</li>
		<li>以13,500 × g 离心3分钟。</li>
		<li>将上清液转移至自动进样瓶中，并按LC/MS程序进行分析。 
		注意：未标记代谢物采用与样品相同的处理流程，以模拟样品基质，保持相似的离子化效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 液相色谱/质谱分析程序的设置
<ol>
	<li>溶剂的制备
	<ol>
		<li>用乙酸将5 mM三丁胺（TBA）水溶液调节至pH 4.75。 
		注意：流动相中的TBA有助于分析物实现良好的分辨率和分离14。</li>
		<li>制备含5 mM TBA的乙腈（ACN）溶液。</li>
		<li>用5%水和95% ACN配制清洗溶剂。</li>
		<li>用95%水和5% ACN配制 purge 溶剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质谱条件的设置
	<ol>
		<li>将质谱仪设为负离子模式，探头温度为520 °C，负极毛细管电压为-0.8 kV，正极毛细管电压为0.8 kV，并将软件设为以每秒5个点的速度采集数据。</li>
		<li>为每种代谢物设置选定离子记录（SIR），并指定锥电压和质荷比（m/z）值。参见表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明初始化液相色谱/质谱（LC/MS）系统
	<ol>
		<li>对溶剂管理器中的溶剂管路进行3分钟的预冲洗。</li>
		<li>对清洗溶剂（5%水，95% ACN）和 purge 溶剂（95%水，5% ACN）进行5个循环，每个循环15秒。</li>
		<li>将样品管理器温度设为10 °C。</li>
		<li>安装C18色谱柱（1.7 µm，2.1 mm × 150 mm），并以0.3 mL/min流速用100% ACN冲洗10分钟以初始化色谱柱。</li>
		<li>在引入含缓冲液的溶剂前，以95%水和5% ACN在0.3 mL/min流速下对色谱柱平衡10分钟。</li>
		<li>以95%溶剂A（5 mM TBA水溶液，pH 4.75）和5%溶剂B（5 mM TBA的ACN溶液）在0.3 mL/min流速下对色谱柱平衡10分钟。</li>
		<li>设置梯度程序：洗脱起始于95%溶剂A和5%溶剂B，10分钟内升至70%溶剂B，再用2分钟升至100%溶剂B，并维持100%溶剂B 3分钟；随后在1分钟内返回初始条件（95%溶剂A，5%溶剂B），并保持9分钟以重新平衡色谱柱。</li>
		<li>在进行任何样品进样前，使用该梯度程序对色谱柱进行3次平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进样及标准品注入
	<ol>
		<li>将5 µL样品注入色谱柱，并采集12C-苯胺标记样品对应的m/z离子强度。</li>
		<li>再次注入5 µL相同样品，但此次采集13C-苯胺标记标准品对应的m/z离子强度。 
		注意：由于在指定的SIR时间窗口内采集数据量过大，我们的LC/MS系统无法同时采集12C和13C的m/z离子强度，因此需对同一样品进行两次进样。</li>
		<li>按浓度从低到高的顺序注入未标记的代谢物标准品，并记录相应的m/z离子强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 定量分析
<ol>
	<li>创建导出方法 
	<ol>
		<li>在数据采集软件中选择 文件 &gt; 新方法 &gt; 导出方法.</li>
		<li>指定一个文件名，例如 苯胺标记日期.</li>
		<li>检查 导出 ASCII 选择文件并指定导出文本文件的目录。</li>
		<li>在 报告类型，选择 All 摘要.</li>
		<li>在 分隔符，用于 柱 选择 a ,。对于 行，选择 [cr][if].</li>
		<li>在 Table，选择 导出 然后 编辑表格 以包括 样本名称, 面积, 高度, 量 和 单位.</li>
		<li>保存导出方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用数据采集软件和内标法定量代谢物
	<ol>
		<li>在……之下 样本集 标签，右键单击相应的 液相色谱-质谱联用 运行并选择 以...方式查看 &gt; 通道.</li>
		<li>选择所有 SIR 通道 13C-苯胺内标的一次进样，右键单击并选择 综述. </li>
		<li>如果 LC 处理方法布局 窗口不会自动出现时，请前往 查看 &gt; 处理方法布局.</li>
		<li>在 处理方法布局，前往 整合 标签与设置 ApexTrack 作为算法。</li>
		<li>前往 平滑处理 制表符并设置类型为 平均值 以及平滑程度至 13. 
		注意：只要在所有样本中保持一致，可选择任意平滑程度。</li>
		<li>在 质谱 通道 标签，禁用 质谱 三维 处理.</li>
		<li>在 SIR 通道窗口中，逐个通道对每个峰进行积分。完成一个峰的积分后，转至下一个 选项 &gt; 从结果填充 峰的详细信息将填入其中 组分 标签。将峰名称更改为相应的化合物名称。</li>
		<li>所有 SIR 通道评估完成后，保存处理方法并关闭窗口。</li>
		<li>选择所有 SIR 通道的 13C-苯胺和 12C-苯胺标记样品，右键单击并选择 过程.</li>
		<li>检查 过程 选择框，选择 使用指定的处理方法，并选择刚刚保存的处理方法。同时检查 导出 选择“使用指定的导出方法”，然后选择之前创建并保存的导出方法。点击 好的。</li>
		<li>用 Excel 打开导出的文本文件，并通过以下公式计算未知化合物的浓度： 
		<img alt="化学浓度计算公式，分析化学中的方程 Cxi = Axi / Astdi × CstdiD。" src="/files/ftp_upload/60329/60329eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
		其中 Cx,i 是未知样品中代谢物 i 的浓度，Ax,i 是未知代谢物 i 的积分面积，A标准差，i 是代谢物 i 的内标物的积分面积，C标准差，i 是代谢物 i 的内标浓度，D 为稀释因子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准曲线定量未标记代谢物
	<ol>
		<li>在……之下 样本 集合 标签页中，右键单击相应的LC/MS运行记录并选择 以...方式查看 &gt; 通道.</li>
		<li>选择一次进样中未标记标准品的所有 SIR 通道，右键单击并选择 综述. </li>
		<li>如果 LC 处理方法布局 窗口不会自动出现时，请前往 查看 &gt; 处理方法布局.</li>
		<li>在处理方法布局中，转到 整合 标签与设置 ApexTrack 作为算法。</li>
		<li>前往 平滑处理 标签并设置类型为 平均值 以及平滑程度至 13. 
		注意：只要在所有样本中保持一致，可选择任意平滑程度。</li>
		<li>在 质谱 通道 标签，禁用 质谱 三维 处理.</li>
		<li>在 SIR 通道窗口中，逐个通道对每个峰进行积分。完成一个峰的积分后，进入下一个 选项 &gt; 从结果填充 峰的详细信息将被填入 组件 选项卡。将峰名称更改为相应的化合物名称。</li>
		<li>所有 SIR 通道评估完成后，保存处理方法并关闭窗口。</li>
		<li>在……之下 样本 集合 标签页中，右键单击样本集并选择 改变样本.</li>
		<li>选择 量 在新窗口中。</li>
		<li>选择复制内容 过程 方法并选择刚刚保存的流程方法。</li>
		<li>输入每个试管中每种代谢物的浓度，并输入单位为 &lt;μM 针对每个组分（或相应单位）进行选择 好的.</li>
		<li>再次选择样本集，右键单击， 以...查看 &gt; 通道.</li>
		<li>选择未标记代谢物标准品的所有 SIR 通道，右键单击并选择 过程.</li>
		<li>检查 过程 方框并选择 使用指定的处理方法选择适当的处理方法并单击 好的.</li>
		<li>为所有样本中的未标记代谢物选择 SIR 通道，右键单击并选择 过程.</li>
		<li>检查 过程 选择框，选择 使用指定的处理方法 方法，并选择刚刚保存的处理方法。同时勾选 导出 盒，选择 使用指定的导出方法 并选择之前保存的导出方法。点击 好的.</li>
		<li>使用标准曲线对未标记的代谢物进行定量，并将结果导出至指定目录的文本文件中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li>
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<li>Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-functional+derivatization+of+amine%2C+hydroxyl%2C+and+carboxylate+groups+for+metabolomic+investigations+of+human+tissue+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).</li>
<li>Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Tagging+in+Mass+Spectrometry+for+Systems+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).</li>
<li>Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+metabolites+involved+in+central+carbon+and+energy+metabolism+using+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+and+in+vitro+13C+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling.</a> Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).</li>
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<li>Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+multiple+intracellular+metabolites+in+glycolysis%2C+pentose+phosphate+pathway%2C+and+tricarboxylic+acid+cycle+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

无细胞系统没有细胞壁，因此可以直接接触代谢物和生物合成机制，无需复杂的样品制备。然而，目前尚缺乏系统且稳健的定量分析无细胞反应体系的实验方案。在本研究中，我们开发了一种快速、稳健的方法，用于定量无细胞反应混合物中的代谢物，并可能扩展至全细胞提取物中的代谢物定量。在复杂混合物（如无细胞反应体系或全细胞提取物）中对单个代谢物进行定量具有多重挑战，其中最主要的原因是化学多样性。这些混合物中同时存在的多种官能团（例如羧酸、胺基、磷酸基、羟基等）显著增加了分析的复杂性。为克服这一难题，我们采用苯胺衍生化方法，并结合13C内标，向代谢物混合物中引入疏水性组分。利用该方法，我们通过单次液相色谱-质谱（LC/MS）分析，稳健地检测并定量了无细胞反应体系中的40种代谢物。本研究中，该方案成功标记了40种化合物中的35种，其余5种则采用标准曲线法进行定量。先前研究表明，反应条件下可能在胺基与磷酸基之间形成分子内盐，从而抑制衍生化反应12。目前尚未确定可同时衍生化全部40种化合物的反应条件；然而，现有替代方法即为标准曲线法。尽管本技术是在无细胞反应混合物中验证的，但其同样可能适用于全细胞提...

无细胞蛋白质合成（CFPS）是一种用于生产蛋白质和化学品的有前景的平台，这类应用传统上由活细胞完成。无细胞系统来源于粗制细胞提取物，避免了与细胞生长相关的复杂性1。此外，CFPS能够直接获取代谢物和生物合成机制，且不受细胞壁的干扰。然而，目前对无细胞过程性能极限的基本理解仍然不足。高通量的代谢物定量方法对于代谢表征至关重要，并且是构建代谢计算模型的关键2,3,4。常用于测定代谢物浓度的方法包括核磁共振（NMR）、傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）、酶法检测以及质谱法（MS）5,6,7,8。然而，这些方法通常受限于无法高效地同时测量多种化合物，且往往需要比典型的无细胞反应更大的样品量。例如，酶法检测通常一次只能定量一种化合物，当样品量较小时（如无细胞蛋白质合成反应，通常在10–15 μL规模下进行）其应用受到限制。同时，NMR需要较高的代谢物丰度才能实现检测和定量5。&#160; 针对上述局限性，色谱联用质谱技术（LC/MS）具有多项优势，包括高灵敏度以及可同时检测多种物质的能力9；然而，随着被测物质的数量和种类增加，分析复杂性也显著上升。因此，开发能够充分实现LC/MS系统高通量潜力的方法显得尤为重要。样品中的化合物通过液相色谱分离，并通过质谱进行鉴定。化合物的信号强度取决于其浓度和离子化效率，而不同化合物的离子化效率可能不同，且还可能受样品基质的影响。&#160;
在使用液相色谱-质谱法（LC/MS）对分析物进行定量时，样品与标准品之间实现相同的电离效率是一个挑战。此外，由于代谢物的多样性导致信号分裂以及质子亲和力和极性的异质性，定量变得更加困难10。最后，样品中共洗脱的基质也可能影响化合物的电离效率。为解决这些问题，可对代谢物进行化学衍生化，从而提高LC/MS系统的分离分辨率和灵敏度，同时在某些情况下减少信号分裂10,11。化学衍生化通过标记代谢物的特定官能团，调节其电荷或疏水性等物理性质，以提高电离效率11。可使用多种标记试剂靶向不同的官能团（如胺基、羟基、磷酸基、羧酸基等）。苯胺即为一种此类衍生化试剂，可同时靶向多个官能团，并将疏水性组分引入亲水性分子中，从而提高其分离分辨率和信号强度12。为应对共洗脱基质引起的离子抑制效应，Yang及其同事开发了一种基于官能团特异性内标技术（GSIST）的标记方法，该方法使用13C标记的苯胺同位素对标准品进行标记，并将其与样品混合12,13。由于代谢物与其相应的内标物共洗脱，具有相同的电离效率，因此可通过它们的信号强度比值来定量实验样品中的浓度。
本研究中，我们建立了一种用于检测和定量CFPS反应中涉及糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、能量代谢及辅因子再生的40种化合物的实验方案。该方法基于GSIST技术，采用12C-苯胺和13C-苯胺对代谢物进行标记、检测和定量，结合反相液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析。所有化合物的线性范围跨越2至3个数量级，平均相关系数为0.988。因此，该方法是一种稳健且准确的研究无细胞代谢以及可能的全细胞提取物代谢的手段。&#160;

<table><tbody><tr><td>12C 苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242284</td><td>苯胺 12C</td></tr><tr><td>13C 标记苯胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>485797</td><td>苯胺 13C6</td></tr><tr><td>3-磷酸甘油酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>3PG</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>FisherScientific</td><td>AC222140010</td><td>ACE</td></tr><tr><td>乙腈，LCMS级</td><td>JT BAKER</td><td>9829-03</td><td>ACN</td></tr><tr><td>乙酰辅酶A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td>ACA</td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18 1.7 &amp;mu;m，2.1 × 150 mm 色谱柱</td><td>Waters</td><td>186002353</td><td>色谱柱</td></tr><tr><td>腺苷二磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>腺苷一磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1752</td><td>AMP</td></tr><tr><td>腺苷三磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>ATP</td></tr><tr><td>α-酮戊二酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td>aKG</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td>CIT</td></tr><tr><td>胞苷二磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9755</td><td>CDP</td></tr><tr><td>胞苷一磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006</td><td>CMP</td></tr><tr><td>胞苷三磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9274</td><td>CTP</td></tr><tr><td>D-甘油醛-3-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39705</td><td>GAP</td></tr><tr><td>赤藓糖-4-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0377</td><td>E4P</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EX0276</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Fisher Scientific accuSpin Micro 17 离心机</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>离心机</td></tr><tr><td>黄素腺嘌呤二核苷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625</td><td>FAD</td></tr><tr><td>果糖-1,6-二磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6803</td><td>F16P</td></tr><tr><td>果糖-6-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3627</td><td>F6P</td></tr><tr><td>延胡索酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td>FUM</td></tr><tr><td>6-磷酸葡萄糖酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7877</td><td>6PG</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>GLC</td></tr><tr><td>葡萄糖-6-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7879</td><td>G6P</td></tr><tr><td>甘油-3-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Gly3P</td></tr><tr><td>鸟苷二磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7127</td><td>GDP</td></tr><tr><td>鸟苷一磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377</td><td>GMP</td></tr><tr><td>鸟苷三磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>HCl</td></tr><tr><td>异柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1252</td><td>ICIT</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1750</td><td>LAC</td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02288</td><td>MAL</td></tr><tr><td>myTXTL - Sigma 70 主混合试剂盒</td><td>ArborBiosciences</td><td>507024</td><td>无细胞蛋白合成</td></tr><tr><td>N-(3-二甲基氨基丙基)-N&amp;prime;-乙基碳二亚胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449</td><td>EDC</td></tr><tr><td>烟酰胺腺嘌呤二核苷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43410</td><td>NAD</td></tr><tr><td>烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td>NADP</td></tr><tr><td>还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>NADPH</td></tr><tr><td>还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td>NADH</td></tr><tr><td>草酰乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td>OAA</td></tr><tr><td>磷酸烯醇式丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td>PEP</td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>PYR</td></tr><tr><td>核糖-5-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7750</td><td>R5P</td></tr><tr><td>核酮糖-5-磷酸</td><td>CarboSynth</td><td>MR45852</td><td>RL5P</td></tr><tr><td>景天庚酮糖-7-磷酸</td><td>CarboSynth</td><td>MS07457</td><td>S7P</td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td>SUCC</td></tr><tr><td>三丁胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90780</td><td>TBA</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>FisherScientific</td><td>O4884</td><td>TEA</td></tr><tr><td>超纯水</td><td>FisherScientific</td><td>10977-015</td><td>水</td></tr><tr><td>尿苷二磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U4125</td><td>UDP</td></tr><tr><td>尿苷一磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375</td><td>UMP</td></tr><tr><td>尿苷三磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6625</td><td>UTP</td></tr><tr><td>VWR 高强度涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td></td><td>涡旋振荡器</td></tr><tr><td>水，LCMS级</td><td>JT BAKER</td><td>9831-03</td><td>WATER</td></tr><tr><td>Waters Acquity H UPLC 四元溶剂管理系统</td><td>Waters</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Waters Acquity H UPLC 样品管理器 FTN</td><td>Waters</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Waters Acquity Qda 检测器</td><td>Waters</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Waters Empower 3</td><td>Waters</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>Waters LCMS 全回收小瓶</td><td>Waters</td><td>186000384c</td><td>LCMS 小瓶</td></tr></tbody></table>

采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

无细胞蛋白质合成（CFPS）是系统生物学和合成生物学中用于体外蛋白质生产的新兴技术。然而，若要使CFPS走出实验室，成为广泛应用且标准化的即时制造技术，我们必须深入了解这些系统的性能极限。针对这一问题，我们开发了一种稳健的实验方案，用于定量CFPS反应中涉及糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、能量代谢以及辅因子再生的40种化合物。该方法使用13C-苯胺标记的内标物，而样品中的化合物则用12C-苯胺进行衍生化。将内标物与样品混合后，采用反相液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）进行分析。化合物的共洗脱消除了离子抑制效应，从而实现了在2至3个数量级范围内的代谢物浓度准确定量，平均相关系数达0.988。在40种化合物中，有5种未用苯胺标记，但仍可在CFPS样品中被检测，并通过标准曲线法进行定量。色谱分析运行时间约为10分钟。综上所述，我们建立了一种快速、稳健的方法，可在单次LC/MS运行中分离并准确定量CFPS中涉及的40种化合物。该方法为全面、准确地表征无细胞代谢提供了有效手段，有助于我们最终理解并提升无细胞系统的蛋白产率、生产效率和能量利用效率。

作为一个概念验证，我们使用该方案对表达绿色荧光蛋白（GFP）的大肠杆菌（E. coli）无细胞蛋白表达系统（CFPS）中的代谢物进行了定量分析。CFPS反应液（14 μL）通过乙醇淬灭并去除蛋白质。CFPS样品随后用12C-苯胺标记，而标准品则用13C-苯胺标记。标记后的样品与标准品混合后注入液相色谱-质谱联用仪（LC/MS）（图1）。该方案利用内标法检测并定量了40种参与中心碳代谢和能量代谢的代谢物，同时针对其中5种未被苯胺标记的代谢物建立了标准曲线（图2）。这些代谢通路中涉及的多种代谢物包括磷酸化糖类、磷酸羧酸类、羧酸类、核苷酸以及辅因子。通过苯胺衍生化，将疏水性基团引入亲水性分子，从而提高了反相色谱分离的效果12。此外，该方法能够在一次LC/MS运行中实现结构异构体对的分离，例如葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸。在实验前，通过依次注入1 mM的单一化合物，并将其质谱与空白对照进行比较，确定了每种化合物的质...

本文介绍了一种可靠的实验方案，用于定量无细胞蛋白合成反应中涉及中心碳代谢和能量代谢的40种化合物。通过苯胺对无细胞合成混合物进行衍生化处理，以实现反相液相色谱的有效分离，随后使用同位素标记的内标物结合质谱法进行定量分析。

无细胞蛋白合成（cell-free protein synthesis, CFPS）是系统生物学与合成生物学中一种新兴的体外蛋白质生产技术。然而，若要实现CFPS的广泛应用……

无细胞蛋白质合成是系统生物学和合成生物学中一种新兴的体外蛋白质生产技术。无细胞蛋白质合成系统不含细胞壁，因此可直接获取代谢物。在本方案中，我们对参与中心碳代谢和能量代谢的40种代谢物进行绝对定量，从而能够表征无细胞代谢过程。该方案依赖于使用苯胺对化合物进行衍生化，从而实现更好的分离效果和更高的质谱分辨率。此外，我们采用同位素标记的苯胺作为内标物，以实现对代谢物的绝对定量。标记后的代谢物共洗脱，可消除基质抑制效应的影响。确保化合物的准确定量。在通风橱中，于离心管内加入550 µL苯胺、337.5 µL液相色谱-质谱级水和112.5 µL 12 M盐酸。充分涡旋混匀，并将6摩尔的苯胺溶液在pH 4.5、4摄氏度条件下保存。制备pH 4.5的6摩尔碳-13标记苯胺溶液时，将250毫克碳-13标记苯胺与132微升水和44微升12摩尔盐酸混合。充分涡旋混匀后，于4摄氏度保存。为制备200毫克/毫升的EDC溶液，每份待标记样品中加入两毫克EDC溶于10微升水中，并充分涡旋混匀。为制备样品，向无细胞蛋白合成反应体系中加入等体积预冷的100%乙醇，以终止反应并沉淀蛋白质。在4°C条件下，以12,000 × g离心样品15分钟。将样品的上清液转移至新的离心管中。为使用碳-12苯胺溶液标记样品，取6 µL样品加入新的离心管中，并加水至终体积为50 µL。加入5 µL浓度为200 mg/mL的EDC溶液，充分混匀碳-12苯胺溶液，然后将5 µL混合液转移至离心管中。在室温下轻轻振荡反应2小时。2小时后，从摇床中取出离心管，转移至通风橱中。向每个反应中加入1.5 µL三乙胺，以终止苯胺标记反应并稳定化合物。在13,500 ×g下离心3分钟，并保留上清液。为了用碳-13标记的苯胺溶液标记内标物，将内标储备液稀释至终浓度为80微摩尔，终体积为50微升。加入5微升200毫克/毫升的EDC溶液和5微升充分混合的碳-13标记苯胺溶液。在室温下轻轻振荡反应混合物，涡旋2小时。两小时后，从摇床中取出试管，在通风橱中向反应体系加入1.5微升三乙胺。以13,500 × g离心3分钟，收集上清液。为测定标记的内标和标记的样品，取每种各25微升，混入自动进样瓶中。然后通过LC-MS程序进行分析。接着，为未标记代谢物建立标准曲线：首先将未标记代谢物的储备溶液稀释至不同浓度，每份体积为50微升。向每个浓度中加入5微升200毫克/毫升的EDC溶液和5微升碳-12苯胺溶液。在室温下轻轻振荡反应液两小时，然后进行三乙胺处理，随后离心，再按照之前的方法进行LC-MS分析。根据制造商说明启动液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）后，将五微升样品注入色谱柱，采集碳-12标记苯胺样品对应的质荷比（m/z）离子强度。随后，再次注入五微升相同样品。并获取碳-13标记苯胺的标准品的质荷比（m/z）离子强度。在本方案中，利用基于大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系统表达绿色荧光蛋白的代谢物进行了定量分析。通过内标法检测并定量了40种参与中心碳代谢和能量代谢的代谢物。同时，还建立了其中五种未用苯胺标记的代谢物的标准曲线。这些代谢途径中涉及的多种代谢物包括磷酸化糖类、磷酸羧酸、羧酸、核苷酸以及辅因子。此外，该方法能够在一次液相色谱-质谱（LC-MS）分析中实现结构异构体对的分离，例如葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。最关键的步骤是使用苯胺对去蛋白化样品进行标记。由于苯胺溶液易分层，因此在保持良好安全操作规范的同时，必须快速而高效地完成操作。该方法有助于通过定量40种代谢物来表征无细胞代谢过程。但是，无细胞混合物中还含有其他化合物，例如可被定量的氨基酸。这有助于更全面地了解无细胞代谢。该方法揭示了无细胞系统具有复杂的代谢活动，这些代谢过程仍然在运行，未来可能被用于提高能量利用效率和碳产率。该方案依赖于使用EDC作为催化剂，将苯胺标记到化合物上。这两种试剂均有危害性，应谨慎使用。

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采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

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