通过反相液相-质谱法对无细胞蛋白合成代谢的绝对定量

无细胞蛋白质合成是系统和合成生物学中用于蛋白质体外生产的新兴技术。无细胞蛋白质合成系统没有细胞壁，因此我们可以直接获得代谢物。在该协议中，我们量化了参与中央碳和能量代谢的40种代谢物的绝对测量结果，这使我们能够描述无细胞代谢的特征。

该协议依赖于用阿尼林转移化合物，从而提供更好的分离和更高的质谱分辨率。此外，我们使用内部标准与同位素，我们标记的碱，为代谢物的绝对定量。标记代谢物，消除铁抑制的影响。

允许对化合物进行精确定量。在发动机罩中工作，将 550 微升的 Aniline 与 337.5 微升的 LC-MS 级水混合在一起。和112.5微升12摩尔盐酸在离心管。

漩涡良好，并储存在pH 4.5和4摄氏度的六摩尔碱溶液。在pH 4.5下，将6摩尔碳-13苯胺溶液与132微升水和44微升12摩尔盐酸混合在一起。漩涡好，储存在四摄氏度。

要制备每毫升 EDC 溶液 200 毫克，将 2 毫克 EDC 溶解在 10 微升水中，每个样品都贴标签。和漩涡很好。为了准备样品，淬火和沉淀蛋白质在无细胞蛋白质合成反应，通过添加同等体积的冰冷100%乙醇到无细胞合成反应。

将样品以12，000倍g离心，在4摄氏度下15分钟。将样品的上一液转移到新的离心管中。要用碳-12 Aniline溶液标记样品，请将样品的六微升转移到新的离心管中，并将体积与水一起带到 50 微升。

加入5微升200毫克每毫升EDC溶液，混合碳-12 Aniline溶液，并将5微升转移到管中。在室温下轻轻摇晃两小时，进行涡流反应。两小时后，从摇床上拆下管子并将其转移到烟气罩中。

在每个反应中加入1.5微升的三乙胺，以停止苯胺标记反应并稳定化合物。在13，500次g下离心3分钟。并保存上一个。

要使用碳-13 aniline溶液为内部标准贴上标签，请将内部库存溶液稀释至80微摩尔，最终体积为50微升。添加每毫升 EDC 溶液 200 毫克的 5 微升，以及混合良好的碳-13 Aniline 溶液的 5 微升。在室温下轻轻摇晃两小时，进行涡流反应。

两小时后，从摇床中取出管子，在烟气罩中的反应中加入1.5微升的三乙胺。在 13，500 次 g 下离心三分钟，并保存上一代。要神化标记的内部标准和标记样品，在自动采样器小瓶中混合 25 微升每个微升。

并分析LC-MS程序。然后，为未标记的代谢物创建标准曲线，首先，将未标记代谢物的库存溶液稀释到不同的浓度，体积为 50 微升。在每个毫升 EDC 溶液中加入 5 微升 200 毫克，并在每个浓度中加入 5 微升碳-12 aniline 溶液。

在室温下轻轻摇晃两小时，进行涡流反应。并继续三乙胺治疗。和离心化之前分析由LC-MS如前所述。

初始化LC-MS后，根据制造商的说明，将样品的五微升注入柱中。并获取碳-12 aniline标记样品的适当m-z离子强度。然后，再次注入同一样品的五微升。

并获取碳-13 Aniline 标记标准的 m 过 z 离子强度。在该协议中，对在大肠杆菌无细胞蛋白合成中表达绿色荧光蛋白的代谢物进行量化。40种代谢物涉及中央碳和能量代谢，使用内部标准检测和量化。

虽然还开发了五种未用非碱标记的代谢物的标准曲线。这些途径所涉及的多种代谢物是磷酸糖、磷酸-碳氧酸、碳氧酸、核苷酸和共因子类。此外，该方法还使结构异构体对（如葡萄糖六磷酸盐和果糖六磷酸盐）在单个LC-MS运行中得以分离。

最重要的步骤是用非碱标记去蛋白化样品。由于 Aniline 解决方案是分开的，因此在保持良好安全实践的同时，快速有效地工作非常重要。这种方法通过40种代谢物的定量，有助于描述无细胞代谢的特征。

但是，额外的化合物是无细胞的混合物，如氨基酸，可以量化。这将有助于提供一个更全面的研究无细胞代谢。这种方法表明，无细胞系统具有复杂的新陈代谢，仍然运行，可以潜在地利用，以提高能源效率和碳产量。

该协议依赖于使用EDC作为催化剂对化合物进行标记。这两种试剂都是危险的，应谨慎使用。