采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

无细胞蛋白质合成是系统生物学和合成生物学中一种新兴的体外蛋白质生产技术。无细胞蛋白质合成系统不含细胞壁，因此可直接获取代谢物。在本方案中，我们对参与中心碳代谢和能量代谢的40种代谢物进行绝对定量，从而能够表征无细胞代谢过程。

该方案依赖于使用苯胺对化合物进行衍生化，从而实现更好的分离效果和更高的质谱分辨率。此外，我们采用同位素标记的苯胺作为内标物，以实现对代谢物的绝对定量。标记后的代谢物共洗脱，可消除基质抑制效应的影响。

确保化合物的准确定量。在通风橱中，于离心管内加入550 µL苯胺、337.5 µL液相色谱-质谱级水和112.5 µL 12 M盐酸。

充分涡旋混匀，并将6摩尔的苯胺溶液在pH 4.5、4摄氏度条件下保存。制备pH 4.5的6摩尔碳-13标记苯胺溶液时，将250毫克碳-13标记苯胺与132微升水和44微升12摩尔盐酸混合。充分涡旋混匀后，于4摄氏度保存。

为制备200毫克/毫升的EDC溶液，每份待标记样品中加入两毫克EDC溶于10微升水中，并充分涡旋混匀。为制备样品，向无细胞蛋白合成反应体系中加入等体积预冷的100%乙醇，以终止反应并沉淀蛋白质。

在4°C条件下，以12,000 × g离心样品15分钟。将样品的上清液转移至新的离心管中。为使用碳-12苯胺溶液标记样品，取6 µL样品加入新的离心管中，并加水至终体积为50 µL。

加入5 µL浓度为200 mg/mL的EDC溶液，充分混匀碳-12苯胺溶液，然后将5 µL混合液转移至离心管中。在室温下轻轻振荡反应2小时。2小时后，从摇床中取出离心管，转移至通风橱中。

向每个反应中加入1.5 µL三乙胺，以终止苯胺标记反应并稳定化合物。在13,500 ×g下离心3分钟，并保留上清液。

为了用碳-13标记的苯胺溶液标记内标物，将内标储备液稀释至终浓度为80微摩尔，终体积为50微升。加入5微升200毫克/毫升的EDC溶液和5微升充分混合的碳-13标记苯胺溶液。在室温下轻轻振荡反应混合物，涡旋2小时。

两小时后，从摇床中取出试管，在通风橱中向反应体系加入1.5微升三乙胺。以13,500 × g离心3分钟，收集上清液。为测定标记的内标和标记的样品，取每种各25微升，混入自动进样瓶中。

然后通过LC-MS程序进行分析。接着，为未标记代谢物建立标准曲线：首先将未标记代谢物的储备溶液稀释至不同浓度，每份体积为50微升。向每个浓度中加入5微升200毫克/毫升的EDC溶液和5微升碳-12苯胺溶液。

在室温下轻轻振荡反应液两小时，然后进行三乙胺处理，随后离心，再按照之前的方法进行LC-MS分析。

根据制造商说明启动液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）后，将五微升样品注入色谱柱，采集碳-12标记苯胺样品对应的质荷比（m/z）离子强度。随后，再次注入五微升相同样品。

并获取碳-13标记苯胺的标准品的质荷比（m/z）离子强度。在本方案中，利用基于大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系统表达绿色荧光蛋白的代谢物进行了定量分析。通过内标法检测并定量了40种参与中心碳代谢和能量代谢的代谢物。

同时，还建立了其中五种未用苯胺标记的代谢物的标准曲线。这些代谢途径中涉及的多种代谢物包括磷酸化糖类、磷酸羧酸、羧酸、核苷酸以及辅因子。此外，该方法能够在一次液相色谱-质谱（LC-MS）分析中实现结构异构体对的分离，例如葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。

最关键的步骤是使用苯胺对去蛋白化样品进行标记。由于苯胺溶液易分层，因此在保持良好安全操作规范的同时，必须快速而高效地完成操作。该方法有助于通过定量40种代谢物来表征无细胞代谢过程。

但是，无细胞混合物中还含有其他化合物，例如可被定量的氨基酸。这有助于更全面地了解无细胞代谢。该方法揭示了无细胞系统具有复杂的代谢活动，这些代谢过程仍然在运行，未来可能被用于提高能量利用效率和碳产率。

该方案依赖于使用EDC作为催化剂，将苯胺标记到化合物上。这两种试剂均有危害性，应谨慎使用。