半高通量成像方法和数据可视化工具包，用于分析C. elegans胚胎发育

C.elegans 胚胎形成大约需要 13 小时，通常通过一次拍摄一个胚胎来监测。然而，我们的协议允许同时对80到100个胚胎进行3D时间推移成像。为大量发育中的C.elegans胚胎收集数据的能力开辟了一系列新的实验，包括发育事件的定量分析和大规模筛选。

该协议可以很容易地适应捕捉不同的发育过程或图像胚胎表达任何组合的标记在感兴趣的组织。将胚胎适当分散在井中是很有挑战性的。它们应该紧密地结合在一起，以便捕获每个场的多个胚胎，而不会聚集在不同的Z平面上。

我们建议使用两个研究人员进行并排解剖，在冰上，并堵住未使用的油井。我们还将演示一些有用的技巧，以快速设置一个良好的舞台384井板。首先用PCR粘合箔密封一个玻璃底384孔板，以掩盖未使用的油井。

使用剃须刀或手术刀切割铝箔，以暴露用于的井的子集。在每个井中加入70微升新鲜准备的TMHC，并将盘子放在冰上。排除板的外两行，以防止边缘效应。

为了快速制备样品，建议两位研究人员进行并排解剖。当所有溶液都镀上时，使用精细的钳子和解剖显微镜将大约 10 名重力成人转移到 150 微升的冰冷 TMHC 溶液中，每个情况只有一个凹陷幻灯片。使用钳子和手术刀，解剖蠕虫释放胚胎，并加载一个拉毛细管移液器到口腔吸气器。

使用口移液器将所有两到八个细胞阶段的胚胎转移到准备好的板的单个孔中，并检查该板以确认任何孔中不存在任何聚集体。收集所有胚胎后，通过离心沉淀标本，并使用乙醇浸泡的湿巾清除板底的任何残留物。将板放在装有温度控制环境的共体显微镜的板架中，并使用 10 倍目标对每一个井进行预扫描，以识别具有合适胚胎的田地。

扫描结束时，切换到 60X 目标，调整每个点的焦点平面，以每井成像 1 到 4 个场，每 20 分钟以 2 微米间隔获取 18 个 Z 节，间隔 10 小时。获得所有图像后，执行低、全井光场扫描，大约在开始夜间成像后 20 到 24 小时，以评估胚胎的致命性。对于使用胚胎CropUI可执行文件自动裁剪，首先从Zenodo和测试文件下载程序。

zip 以确定程序是否在平台上正常工作。一旦下载，解压缩和导航找到胚胎CropUI可执行文件，并双击启动程序。选择"打开"可加载第一个特定的 4D 视图字段以裁剪。

裁剪具有多个尺寸的 TIFF 系列时，仅加载文件夹中序列中的第一个图像。加载所有图像后，请指定成像参数，选择背景减法和衰减校正，并设置图像收集顺序和每像素微米。然后选择"运行"，将在与未裁剪文件夹相同的路径中创建标记裁剪的新子文件夹，裁剪的版本将保存在此位置。

对于可视化，下载打开和组合的 MSV2 ImageJ 插件和图形用户界面说明 Zenodorepov2。docx 从 Zenodo 和打开插件在 Imagej 。找到第三行和第四行，并输入裁剪后存储图像文件夹的位置。

要处理的条件的图像文件夹名称，以及每个通宵实验的唯一字母数字标识符。输入所有信息后，单击"运行"。将出现一个窗口，该窗口将启动一个提示，以导航到包含裁剪的图像文件夹的外部文件夹。

一旦选定，将出现另一个窗口，这将允许规格的成像参数。单击"确定"。复合文件将开始组装。

生成复合后，查看保持打开状态的文件。结合自定义报告器应变进行成像时，可为大多数重大发展事件提供信息的读数。包括硫酸盐规格、对板间分质、表皮外壳、伸长和神经生成。

注射后 24 小时是成像的最佳时间点。到此，母体蛋白的耗竭和酶基因表达的抑制都是有效产生不同，高可重复的特征表型跨越涉及硫酸盐规范和形态生成的广泛基因谱。在解剖和胚胎选择步骤中保持耐心是重要的。

最大限度地减少包装和选择适当的焦点平面对于确保高质量数据也至关重要。我们的协议可以与各种荧光标记菌株一起执行，并结合RNAi或突变体。我们的处理工具允许简化、自动化或手动数据分析。

利用此处描述的菌株、方法和工具，我们的团队对胚胎发育所需的大约 2，000 个基因进行了基于 RNAi 的高含量屏幕。半高吞吐量方法对该项目至关重要。