半高通量成像方法和数据可视化工具包，用于分析C. elegans胚胎发育
October 29th, 2019
这项工作描述了一个半高通量协议，允许在一次一夜的运行中同时对80-100 C.elegans胚胎的胚胎发生进行3D延时成像。此外，还包括图像处理和可视化工具，以简化数据分析。这些方法与自定义报告菌株相结合，有助于详细监测胚胎生成。
C.elegans 胚胎形成大约需要 13 小时，通常通过一次拍摄一个胚胎来监测。然而，我们的协议允许同时对80到100个胚胎进行3D时间推移成像。为大量发育中的C.elegans胚胎收集数据的能力开辟了一系列新的实验，包括发育事件的定量分析和大规模筛选。
该协议可以很容易地适应捕捉不同的发育过程或图像胚胎表达任何组合的标记在感兴趣的组织。将胚胎适当分散在井中是很有挑战性的。它们应该紧密地结合在一起，以便捕获每个场的多个胚胎，而不会聚集在不同的Z平面上。
我们建议使用两个研究人员进行并排解剖，在冰上，并堵住未使用的油井。我们还将演示一些有用的技巧，以快速设置一个良好的舞台384井板。首先用PCR粘合箔密封一个玻璃底384孔板，以掩盖未使用的油井。
使用剃须刀或手术刀切割铝箔，以暴露用于的井的子集。在每个井中加入70微升新鲜准备的TMHC，并将盘子放在冰上。排除板的外两行，以防止边缘效应。
为了快速制备样品，建议两位研究人员进行并排解剖。当所有溶液都镀上时，使用精细的钳子和解剖显微镜将大约 10 名重力成人转移到 150 微升的冰冷 TMHC 溶液中，每个情况只有一个凹陷幻灯片。使用钳子和手术刀，解剖蠕虫释放胚胎，并加载一个拉毛细管移液器到口腔吸气器。
使用口移液器将所有两到八个细胞阶段的胚胎转移到准备好的板的单个孔中，并检查该板以确认任何孔中不存在任何聚集体。收集所有胚胎后，通过离心沉淀标本，并使用乙醇浸泡的湿巾清除板底的任何残留物。将板放在装有温度控制环境的共体显微镜的板架中，并使用 10 倍目标对每一个井进行预扫描，以识别具有合适胚胎的田地。
扫描结束时，切换到 60X 目标，调整每个点的焦点平面，以每井成像 1 到 4 个场，每 20 分钟以 2 微米间隔获取 18 个 Z 节，间隔 10 小时。获得所有图像后，执行低、全井光场扫描，大约在开始夜间成像后 20 到 24 小时，以评估胚胎的致命性。对于使用胚胎CropUI可执行文件自动裁剪，首先从Zenodo和测试文件下载程序。
zip 以确定程序是否在平台上正常工作。一旦下载，解压缩和导航找到胚胎CropUI可执行文件，并双击启动程序。选择"打开"可加载第一个特定的 4D 视图字段以裁剪。
裁剪具有多个尺寸的 TIFF 系列时，仅加载文件夹中序列中的第一个图像。加载所有图像后，请指定成像参数，选择背景减法和衰减校正，并设置图像收集顺序和每像素微米。然后选择"运行"，将在与未裁剪文件夹相同的路径中创建标记裁剪的新子文件夹，裁剪的版本将保存在此位置。
对于可视化，下载打开和组合的 MSV2 ImageJ 插件和图形用户界面说明 Zenodorepov2。docx 从 Zenodo 和打开插件在 Imagej 。找到第三行和第四行，并输入裁剪后存储图像文件夹的位置。
要处理的条件的图像文件夹名称，以及每个通宵实验的唯一字母数字标识符。输入所有信息后，单击"运行"。将出现一个窗口，该窗口将启动一个提示，以导航到包含裁剪的图像文件夹的外部文件夹。
一旦选定，将出现另一个窗口，这将允许规格的成像参数。单击"确定"。复合文件将开始组装。
生成复合后，查看保持打开状态的文件。结合自定义报告器应变进行成像时，可为大多数重大发展事件提供信息的读数。包括硫酸盐规格、对板间分质、表皮外壳、伸长和神经生成。
注射后 24 小时是成像的最佳时间点。到此，母体蛋白的耗竭和酶基因表达的抑制都是有效产生不同，高可重复的特征表型跨越涉及硫酸盐规范和形态生成的广泛基因谱。在解剖和胚胎选择步骤中保持耐心是重要的。
最大限度地减少包装和选择适当的焦点平面对于确保高质量数据也至关重要。我们的协议可以与各种荧光标记菌株一起执行，并结合RNAi或突变体。我们的处理工具允许简化、自动化或手动数据分析。
利用此处描述的菌株、方法和工具，我们的团队对胚胎发育所需的大约 2，000 个基因进行了基于 RNAi 的高含量屏幕。半高吞吐量方法对该项目至关重要。
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概述
本文描述了一种半高通量协议，该协议允许在单次过夜运行中同时进行80-100个C. elegans胚胎的3D时间序列成像。能够收集大量发育中的C. elegans胚胎数据为一系列新的实验开辟了道路，包括发育事件的定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 成像技术
背景
- C. elegans胚胎发育大约需要13小时。
- 传统方法涉及一次拍摄一个胚胎。
- 同时成像允许更全面的数据收集。
- 可以使用定制的报告器菌株进行详细监测。
研究目的
- 开发用于C. elegans胚胎高通量成像的协议。
- 实现发育过程的定量分析。
- 促进胚胎发育的大规模筛查。
使用的方法
- 半高通量3D时间序列成像协议。
- 用于数据分析的图像处理和可视化工具。
- 用于监测特定发育标志的定制报告器菌株。
- 适应各种发育过程的协议。
主要结果
- 成功同时成像80-100个胚胎。
- 通过定制工具简化数据分析。
- 增强了对胚胎发育的详细监测能力。
- 具有适应不同实验需求的潜力。
结论
- 该协议显著提高了胚胎发育研究的效率。
- 它为发育生物学中的定量分析开辟了新的途径。
- 未来应用可能包括各种发育过程和标志组合。
常见问题
Executive Industry Relevance
Semi-high-throughput 3D imaging of C. elegans embryogenesis enables quantitative, multiplexed analysis of developmental phenotypes across multiple genetic or experimental conditions. This capability accelerates early discovery by supporting large-scale, parallelized hypothesis testing and mechanistic de-risking in developmental biology. The approach enhances predictive confidence and portfolio triage for gene function and pathway interrogation in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function during embryonic development.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing phenotypic outcomes across diverse genetic perturbations.
- Facilitates high-content screening for target validation and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes imaging and data processing for reproducible, quantitative outputs.
- Enables scalable, parallel evaluation of gene knockdowns or compound effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic readouts with disease-relevant developmental processes when using informative reporter strains.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis workflow bridges early discovery, screening, and preclinical validation by enabling multiplexed, quantitative phenotyping in a model organism system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-content, parallelized imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for large-scale genetic or compound screens.
- Analytics: Provides automated cropping, orientation, and visualization tools for standardized data analysis.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to disease-relevant biological processes when using appropriate markers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform adaptable to diverse experimental needs and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental gene function studies.
- Operational Value: Streamlines data acquisition, processing, and visualization for high-throughput experiments.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust, scalable phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets and pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires microscopy infrastructure with point visiting and temperature control capabilities.
- Demands expertise in embryo handling, imaging, and data analysis workflows.
- Benefits from cross-team standardization of imaging parameters and data processing protocols.
- Adaptable to various fluorescent marker strains and genetic backgrounds.
- Dependent on careful sample preparation to avoid embryo clumping and ensure data quality.
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