Name: 半高通量成像方法和数据可视化工具包，用于分析C. elegans胚胎发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 了解半高通量三维延时成像方法，用于同时分析80至100个秀丽隐杆线虫胚胎发育过程。该方案结合定制图像处理工具，实现发育生物学定量分析与大规模筛选。

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S.D.O. 获得了由美国国立普通医学科学研究所资助的加州大学圣地亚哥分校机构研究与学术职业发展奖（NIH/IRACDA K12 GM068524）的支持。A.D. 和 K.O. 得到了路德维希癌症研究所的支持，该研究所还为本研究提供了研究经费。我们感谢 Andrew Chisholm 在本项目初期阶段提供的建议，Ronald Biggs 在初始方法开发阶段之后对本项目所作的贡献，以及 Dave Jenkins 和 Andy Shiau 提供的支持和使用小分子发现团队高内涵成像系统的机会。

1. 准备 秀丽隐杆线虫 用于半高通量成像的胚胎
注意：本实验方案部分的目标是将一群半同步化（2至8细胞期）的C. elegans胚胎（从合适的标记品系中解剖获得，图2）装载到玻璃底384孔板中，用于成像。其他规格的培养板也可使用，但优先选择384孔板，因为其孔径较小，可限制胚胎扩散至相对较小的区域，从而便于识别含有多个胚胎的视野，以进行延时成像。对胚胎进行大致同步化处理，可确保在同一视野中的每个胚胎均能完整记录其整个发育过程。
<ol>
	<li>准备 5–10 mL 浓度为 0.1 mg/mL 的盐酸四咪唑（TMHC）麻醉剂溶液，将其溶解于冰冻 M9 培养基（0.45 M Na2HPO4∙7H2O，0.11 M&#160;KH2PO4，0.04 M NaCl，0.09 M NH4Cl）中，用于解剖和成像过程。该培养基含有麻醉剂，可确保孵化出的活动幼虫不会干扰早期胚胎发育阶段的成像。 
	注意：若使用裁剪和可视化工具分析通过标准琼脂糖垫固定方法获得的数据，请直接跳至下文第 3 节。</li>
	<li>将配制好的溶液每孔分装 70 µL 至玻璃底 384 孔板的各个孔中，每个实验条件对应一孔；避免使用板的最外两行孔，以防止边缘效应。 
	注意：使用粘性 PCR 板箔遮蔽周围孔（参见图 1D示例）是有益的，这可以保留相邻孔用于后续实验，并便于在解剖显微镜下定位目标孔。溶液分装后，整个解剖过程中需将板和剩余溶液置于冰上保存。</li>
	<li>制备用于将胚胎从凹槽载玻片（即产卵雌雄同体解剖处）转移至各孔的口吸管。将毛细移液管（25 µL 校准移液管）在火焰上拉制，并折断以形成细长的锥形末端（图 1D）。每个实验条件需使用独立的移液管以防止交叉污染；使用后即弃去。</li>
	<li>使用精细镊子在解剖显微镜下将约 10 只性成熟的成虫转移至各实验条件对应的凹槽载玻片上的 150 µL 冰冻 TMHC 溶液中。利用镊子和解剖刀解剖线虫以释放胚胎。</li>
	<li>将拉制好的毛细移液管插入配套的吸管附件中，通过口吸方式将所有处于 2 至 8 细胞期的胚胎转移至预处理板的单个孔中（图 1D）。避免转移晚期胚胎及解剖碎片。在解剖显微镜下检查，若存在胚胎聚集体，可通过反复吸打或轻敲移液管尖端使团块分散。 
	注意：为防止交叉污染，在不同实验条件间操作时应清洁解剖器械并更换新的口吸管。每次解剖之间应将板置于冰上保存。</li>
	<li>当所有实验条件的线虫均完成解剖且胚胎已放入相应孔中后，将 384 孔板以 600 × g 离心 1 分钟，使胚胎沉降。</li>
	<li>用含乙醇的擦拭布擦拭板底以去除残留物，并将板置于配备板架、处于温度控制环境中的共聚焦显微镜上。 
	注意：后续步骤以本实验室设置为例进行说明；请根据实验需求和设备情况调整采集条件。此处使用配备微透镜增强型双尼普科夫旋转盘、512 × 512 EM-CCD 相机、高精度自动 XY 载物台（标称分辨率为 0.1 µm）和电动 Z 轴控制（标称分辨率为 0.1 µm）的共聚焦扫描系统。该系统置于 16 °C 房间内，可在过夜成像期间维持显微镜温度在 21 至 23 °C 之间。</li>
	<li>为识别含有合适胚胎的视野，使用 10× 0.4 NA 物镜和合适的成像软件对每个孔进行预扫描。最佳视野应包含多个处于相同焦平面的早期胚胎，且相邻胚胎之间接触尽可能少。标记合适区域的位置。</li>
	<li>选择成像视野时，切换至 60× 物镜，并在访问每个点位时调整焦平面以适当切片胚胎。每孔成像 1–4 个视野，共 14 个孔总计成像 50 个视野，每个视野可包含 1 至 5 个胚胎。总体上，从每个实验条件中选择 4 至 15 个胚胎进行高分辨率成像。 
	注意：此步骤的关键变量是使用足量的镜油；先在物镜上滴加油滴，访问各孔中的点位以使油均匀覆盖所有孔的表面，然后在选择视野前再额外添加一滴油至物镜上。</li>
	<li>使用 60× 1.35 NA 物镜对选定视野进行成像，每隔 20 分钟采集一次，每次以 2 µm 间隔获取 18 层 Z 轴切片，持续 10 小时。使用生殖层和形态发生报告基因品系时的成像条件如下：明场，90% 功率，25 ms，20%&#160;增益；488 nm，100% 功率，200 ms，60% 增益；568 nm，45% 功率，150 ms，60% 增益。</li>
	<li>成像完成后，约在过夜成像开始后 20–24 小时，使用低倍率（10× 0.4 NA 物镜）对整个孔进行明场扫描，以评估胚胎致死率。</li>
</ol>
2. 胚胎致死率评分
<ol>
	<li>利用跑胶后 10 倍扫描的视野，通过计数每个孔中孵化的线虫和未孵化的胚胎，评估胚胎致死率和幼虫缺陷。</li>
	<li>将未孵化的胚胎记为胚胎致死。排除停滞在 1 至 4 细胞阶段的胚胎不计入致死率，因为刚解剖出的胚胎有时未能完成卵壳形成（若减数分裂 II 尚未完成），且通透性缺陷可能在前两次分裂期间引起渗透压相关并发症。</li>
	<li>将部分孵化或完全孵化但存在体态或行为缺陷（如短粗型或瘫痪）的线虫记为“异常幼虫”。</li>
</ol>
3. 自动裁剪（图3A）
注意：该软件存放在两个位置：（1）Zenodo 提供了一个用户友好的软件版本12，无需任何编程经验即可使用。（2）Github 包含了我们 embryoCropUI.py 和 screenCrop.py 软件的源代码13，使用该版本需要具备 Python 编程能力。以下提供了下载和运行这两个版本程序的详细说明。
<ol>
	<li>使用 embryoCropUI 可执行版本进行自动裁剪（用户友好版本）
	<ol>
		<li>要使用 embryoCropUI 程序，首先从 Zenodo 下载该程序（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）12。
		<ol>
			<li>下载适用于 MacOS 或 Windows 格式的程序版本（注意：MacOS 版本需要 MacOS X10.11 或更高版本）。</li>
			<li>下载说明文件（GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx），其中提供了测试和使用 embryoCropUI 程序的逐步指导。</li>
			<li>下载 test_files.zip 以测试程序在当前平台上的运行是否正常（参见说明文件）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>下载完成后，解压缩并找到 embryoCropUI 可执行文件（…\embryoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe）或（…\embryoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe）。双击启动（或选择“用终端打开”），运行 embryoCropUI 可执行程序。</li>
		<li>该图形界面可执行程序一次裁剪一个 4D 视场。在左上角选择“打开”按钮以加载待裁剪的特定视场（多通道 tiff 文件）。如果裁剪的是包含多个维度（即 z、时间、通道）的 tiff 序列，请仅加载文件夹中的第一张图像（每个文件夹仅包含一个 tiff 序列）。</li>
		<li>图像加载后，请指定以下信息：z 层切片数（Z）、时间点数（T）、通道数（C），以及对应于 DIC 或明场的通道（第一个为 1，第二个为 2，依此类推）。</li>
		<li>选择要在图像上运行的附加处理步骤。程序提供漂移校正、背景扣除和衰减校正功能。</li>
		<li>在图形界面提示中指定背景扣除和衰减校正的参数，以指导处理过程。对于背景扣除，请定义最大特征尺寸以反映有意义信号的大小；该特征尺寸不应被视为背景，且必须为奇数。为衰减校正输入 0 到 1 之间的数值。衰减校正值表示成像对象最深处保留的原始强度百分比。 
		注意：背景扣除和衰减校正必须同时运行。</li>
		<li>指定图像采集顺序（例如，通道-z-时间（czt）或 z-通道-时间（zct））。</li>
		<li>根据所使用的相机指定图像的微米/像素值。 
		注意：若像素尺寸未正确设定，将导致图像裁剪效果不佳。</li>
		<li>点击左下角的运行按钮。将在未裁剪文件夹的同一路径下创建一个名为“crop”的新子文件夹；裁剪后的图像将保存在此位置。根据文件大小，裁剪过程通常在几秒到几分钟内完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 screenCrop.py 进行自动裁剪 （上述 embryoCrop 图形界面的批量处理替代方案；仅限熟悉 Python 的用户）10,13
	<ol>
		<li>要使用 screenCrop.py，该 Python 软件版本可用于批量格式裁剪较大数据集，请从 Github 克隆或下载源代码 (github.com/renatkh/embryo_crop.git)。</li>
		<li>阅读配置适当虚拟环境的说明，并遵循其中描述的文件命名系统；这些内容均详细记录在 Github 仓库的 README 文件中：https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md。</li>
		<li>在正确设置环境变量和命名规范后，使用任意编辑器打开 parameters.py 和 screenCrop.py 文件。</li>
		<li>如需在不修改源代码的情况下调整参数，请编辑 parameters.py 文件。 
		注意：也可直接在 screenCrop.py 文件头部修改参数。
		<ol>
			<li>如果使用 parameters.py 配置文件，请将 use_configure 设置为 True。如果直接在 screenCrop.py 中编辑参数，请将 use_configure 设置保持为 False。</li>
			<li>在 parameters.py 文件中找到以下信息，并根据所需的成像参数和文件结构进行修改：
			<ol>
				<li>loadFolder（第 9 行）：更改为存储文件的驱动器（例如 Z:/, D:// 等）</li>
				<li>date（第 7 行）：更改为包含成像会话文件的文件夹。这在 CSV 跟踪文件中被称为“实验文件夹名称”（参见说明）。</li>
				<li>trackingFile（第 11 行）：更改为存储实验信息的 CSV 文件路径。</li>
				<li>z（第 13 行）：设置为 z 平面的数量。</li>
				<li>nT（第 14 行）：设置为时间点数量。</li>
				<li>nWells（第 19 行）：设置为使用的孔数。</li>
				<li>pointVisits（第 20 行）：设置为每个孔的最大访问点数。</li>
				<li>在第 10 行找到当前由 'CV1000/' 占据的位置，并输入文件路径中使用的外层文件夹名称。为避免问题，请使用以下格式：'XXXXXXX/'。</li>
				<li>在第 12 行输入一个有效的文件路径，用于存储裁剪数据的宽高比信息。</li>
				<li>在第 15、16、17 和 18 行输入 True/False，以确定图像是否进行以下处理：
				<ol>
					<li>在第 15 行输入 True 或 False 以启用或禁用漂移校正。</li>
					<li>在第 16 行输入 True 或 False 以启用或禁用背景扣除。不同标记品系和像素尺寸下的特征尺寸需通过实验确定。在此配置中，胚层品系的特征尺寸定义为 41，形态发生品系为 201。背景扣除必须与衰减校正同时进行。</li>
					<li>在第 17 行输入 True 或 False 以启用或禁用衰减校正。</li>
					<li>在第 18 行输入 True 或 False 以启用或禁用前后轴旋转。</li>
				</ol>
				</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>完成所有修改后，即可开始裁剪。为此，请切换到 screenCrop.py，在工具栏中选择播放图标，在下拉菜单中选择 Run As &#62; Python Run。</li>
		<li>由于大规模数据集的裁剪可能需要数小时才能完成（例如 50 个访问点、18 个 z 步骤、3 个通道、31 个时间点），请在控制台窗口中跟踪裁剪进度。裁剪完成后，将弹出一个小窗口，在保存前预览裁剪后的图像。对于每张图像，有以下三种选项：
		<ol>
			<li>保存：若图像裁剪正确且无感兴趣区域被裁切，请按空格键保存图像。</li>
			<li>X：若图像显示感兴趣区域被裁切，请按X键；图像将以前缀 X 保存，以便与其他图像区分开。</li>
			<li>删除：若图像裁剪不正确或胚胎不符合要求，请按D键删除裁剪后的图像。 
			注意：图像将保存至加载文件夹（程序第 9 行定义）中名为 &#34;Cropped" 的子文件夹中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 可视化（图4）
注意：OpenandCombine_embsV2.ijm10,12 是一个 ImageJ 宏，可将特定菌株和条件下所有图像整合为一个便于查看的 tiff 文件。需要预先安装 FIJI/ImageJ14,15。该宏依据我们的文件结构运行；若使用其他文件结构，需对其进行修改。有关正确文件结构的指南及重要注意事项的详细说明，请参见 Zenodo 仓库中 GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx 文件末尾部分。 在成像前，请务必完整阅读这些说明，以便正确命名和组织文件，从而与该宏实现最佳兼容。作为参考，我们的文件路径结构如下： 
Z:\cropped\Target\Strain\Emb#\Target_Emb#_15 位唯一标识符 _W##F#_T##_Z##_C#.tif 
例如：Z:\cropped\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif
<ol>
	<li>从 Zenodo 网站（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）下载 OpenandCombine_embsV2 和 GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx。</li>
	<li>准备以下信息： 
	- 存储图像文件夹的位置（裁剪后）。 
	- 需要处理的特定条件对应的图像文件夹名称（例如：EMBD0002）。在上述示例中，这被称为 &#34;目标（Target）" 
	- 一个15位字母数字组成的唯一标识符，用于标识某次过夜实验——该标识符即为数据采集文件夹的名称（例如：20140402T140154），并且该唯一标识符嵌入在当天拍摄的每个胚胎的独立 tiff 文件名中（如：EMBD0002_Emb1_20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1）。该宏将使用此标识符来识别同一天采集的胚胎，并可将不同日期但条件重复的实验分别整合为独立的 ImageJ 文件。</li>
	<li>打开 ImageJ，将宏文件 OpenandCombine_embsV2.ijm 拖放到 ImageJ 工具栏中，或直接在 ImageJ 中打开该宏文件。</li>
	<li>宏文件打开后，请定位到第3行和第4行。根据以下步骤输入在（第4.2节）中收集的信息：
	<ol>
		<li>在第3行（RNAL）中，输入待处理图像的目标名称。每个目标需按以下格式输入：newArray(&#34;XXXXXXXX/&#34;)；需包含引号。若需同时运行多个条件，请用逗号分隔，并将所有目标名称保留在括号内（例如：newArray(&#34;EMBD0000/&#34;,&#34;EMBD0001/&#34;,&#34;EMBD0002/&#34;)。</li>
		<li>在第4行（date）中，输入15位字母数字组成的唯一标识符，并用引号括起，例如：newArray(&#34;20140402T140154&#34;)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击宏窗口左下角的运行（Run）按钮。随后将弹出一个窗口，提示您导航至包含已裁剪图像文件夹的上级文件夹（如第4.4.1节所述）。</li>
	<li>选择完成后，将出现另一个窗口，用于设置成像参数。
	<ol>
		<li>输入通道数量、Z 层切片数量、用于标注合成图像的文本字体大小，以及每个通道的颜色。</li>
		<li>选择是否在所有通道中启用/关闭自动对比度调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有参数设置完成后，点击窗口底部的确定（OK）按钮。系统将开始生成合成文件；每种条件的处理过程可能需要数分钟才能完成。</li>
	<li>处理完成后，可根据需要查看保留打开状态的文件。这些文件可直接关闭而不保存，因为宏已将文件自动保存至一个新创建的文件夹中，该文件夹的命名方式如下：上级文件夹名称（如第4.5节提示中指定） + &#34;-fiji-processed-output"（例如：Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif）。</li>
</ol>

<ol><li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I%3A+development%2C+patterning%2C+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li>
<li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans%3A+teaching+an+old+dog+a+new+trick%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+In+Biology%22%5BJournal%5D)">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948(2012).</li>
<li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li>
<li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin+complexity%3A+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li>
<li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li>
<li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li>
<li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+Embryonic+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li>
<li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li>
<li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22Dryad+Digital+Repository%22">Dryad Digital Repository</a>. , (2019).</li>
<li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22Zenodo%22">Zenodo</a>. , (2018).</li>
<li>Khaliullin, R. N. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4%2FFoxA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li>
<li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4%2FFOXA+in+development+and+environmental+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848(2010).</li>
<li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1%28hd20%29+lin-15b%28hd126%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li>
<li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+approach+to+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+pattern+analysis+and+machine+intelligence%22%5BJournal%5D)">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li>
<li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li>
<li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
<li>Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOegema%2C+K+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-40 (2006).</li>
<li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861(2018).</li>
</ol>

本研究介绍了一套为大规模分析C. elegans胚胎发育过程中基因功能而开发的工具与方法。我们的半高通量方法可在单次实验中对80至100个胚胎进行三维时间序列成像，时间分辨率为20分钟。尽管该实验方案可适配于任何所需的标记品系，但本研究通过两种自主构建的品系展示了该方法的应用潜力：（1）胚层报告品系，其中组织特异性启动子驱动荧光组蛋白表达，以标记内胚层、中胚层和外胚层的细胞核；（2）形态发生报告品系，利用表皮和神经元特异性启动子驱动荧光标记物在细胞连接和质膜中的表达。通过对这两个品系进行成像，可详细记录分子扰动对细胞命运决定及形态发生事件的影响。为应对该方法所产生的大量数据带来的挑战，我们开发了定制化工具以简化数据处理与可视化流程。第一个工具可从三维时间序列图像中将单个胚胎裁剪出来，同时将胚胎旋转至标准的头尾轴方向，并完成背景扣除、漂移校正和衰减校正。该程序已封装为用户友好的图形界面（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w），并为熟悉Python的用户提供源代码及更高级的批量处理版本（github.com/renatkh/embryo_crop.git）<sup c...

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学机制以及细胞命运决定和驱动胚胎发育的形态发生事件的重要模型系统1,2,3,4,5,6,7,8,9。迄今为止，对胚胎中细胞水平事件和细胞命运决定的大部分表征工作，依赖于对表达荧光标记物的胚胎进行单个、相对高时间分辨率的成像实验（即每10–100秒采集一次图像）。尽管该方法适用于持续数秒至数十分钟的事件，但在表征持续数小时至数天的较长时间过程时，其技术上存在局限性。从第一次卵裂到体轴伸长结束的胚胎发育过程大约需要10小时。在此时间尺度下，若能采用半高通量方法，同时对来自不同条件的较大量胚胎群体进行较低时间分辨率的成像（即每5–20分钟采集一次图像），将有望拓展新的实验范围；例如，实现系统性的大规模筛选，并分析足够数量的胚胎，以比较分子扰动所导致的后果。
本文介绍了一种用于监测 C. elegans 胚胎发育的半高通量方法，该方法可在单次过夜实验中，对来自最多14种不同条件的80–100个胚胎进行同步的三维时间序列成像。该方案操作简便，任何配备具有多点成像功能显微镜的实验室均可实施。本方案的主要步骤如图1所示。简言之，从表达目标荧光标记的成年雌雄同体线虫中解剖获得胚胎，并将早期胚胎（2–8细胞期）转移至384孔板的孔中进行成像。在此体系中，较小的孔径使胚胎集中于一个狭窄区域，有利于识别包含多个胚胎的视野，从而进行时间序列成像。为保持整批胚胎发育的大致同步性，解剖过程在预冷的培养基中进行，并将板置于冰上，以防止在长达一小时的解剖期间发生显著发育。随后将板转移至显微镜，在温度受控的环境中于夜间连续成像，时间间隔为20分钟，使用60倍油镜（数值孔径1.35），以2 µm步长采集完整的z轴范围。单次过夜实验可对50个视野进行成像，每个视野包含1–5个胚胎。根据具体实验需求，可通过相应减少成像视野数量来提高时间分辨率（例如，以5–10分钟间隔进行成像）。
通过本方案，即使单次过夜运行也会产生大量数据（在50个视野中分布有80–100个胚胎），而更大规模的实验在数据分析方面可能迅速变得难以处理。为了促进数据的处理、可视化并简化分析流程，我们开发了一个程序，用于裁剪并定向胚胎，同时执行预处理步骤（可选），以及一个ImageJ宏，用于整合数据以简化查看。这些程序可用于处理采用常规方法采集的图像，因其独立于成像方式，仅需单个明场图像平面即可。第一个程序可输入包含多个胚胎的4D视野（GUI选项或源代码embryoCrop.py），或输入多个包含多个胚胎的4D视野（screenCrop.py），对胚胎进行紧密裁剪，并将其定向为头尾方向排列。这些程序还允许用户选择执行背景扣除、漂移校正和衰减校正。输出文件为每个胚胎经过统一预处理、紧密裁剪后的TIFF图像序列，适用于自动化图像分析。为了更方便地查看每种实验条件下的所有胚胎，编写了一个ImageJ宏（OpenandCombine_embsV2.ijm），该宏将特定条件下的所有胚胎整合为单个TIFF图像序列，并为每个胚胎并排排列明场图像与最大强度投影彩色（RGB）叠加图像。本方法已通过实验验证：利用一对自主构建的转基因品系，对40个先前报道的发育相关基因进行敲低后，表征胚胎发育过程；这些品系表达经优化的荧光标记，可清晰显示胚层特化和形态发生的关键特征10,11。综上所述，该半高通量胚胎成像方案与图像处理工具将有助于开展更高样本量的实验，并推动以解析发育过程为目标的大规模筛选研究。此外，这些品系也为研究分子扰动对胚胎发育的影响提供了高效手段。&#160;

<table><tbody><tr><td>吸液管组件</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-000</td><td></td></tr><tr><td>校准移液管（25 mL）</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Voyager 软件</td><td>Yokogawa Electric Corp</td><td>随 CV1000 提供</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>CV1000 显微镜</td><td>Yokogawa Electric Corp</td><td>CV1000</td><td></td></tr><tr><td>凹孔载玻片（3 孔）</td><td>Erie Scientific</td><td>1520-006</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ-645</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 07336</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>开源软件</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td></td></tr><tr><td>M9 缓冲液</td><td>实验室配制</td><td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Microseal F型封膜</td><td>Bio-Rad</td><td>MSF1001</td><td></td></tr><tr><td>NGM 平板</td><td>实验室配制</td><td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td><td></td></tr><tr><td>15 号手术刀片</td><td>Bard Parker</td><td>REF 371615</td><td></td></tr><tr><td>Sensoplate Plus，384 孔，F 型底，玻璃底</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781855</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1512-10G</td><td></td></tr><tr><td>镊子，Dumont #3</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0109-3-PO</td><td></td></tr><tr><td>U-PlanApo 物镜（10&amp;times; 0.4 NA）</td><td>Olympus</td><td>1-U2B823</td><td></td></tr><tr><td>U-PlanApo 物镜（60&amp;times; 1.35 NA）</td><td>Olympus</td><td>1-U2B832</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans 是研究胚胎发育过程中细胞命运决定和形态发生事件的首选体系。一个挑战在于，胚胎发育是一个动态过程，持续时间约为 13 小时；这种长达半天的时间尺度限制了可成像胚胎的数量，从而制约了实验的范围。本文介绍了一种半高通量实验方案，可在单次过夜实验中，以中等时间分辨率，同时对 80 至 100 个胚胎进行三维延时成像，涵盖最多 14 种不同条件下的发育过程。该方案操作简便，任何配备具有多点成像功能显微镜的实验室均可实施。通过成像两种自主构建的转基因线虫品系（其表达经优化的荧光标记，用于可视化胚层形成和形态发生的若干关键过程），验证了本方案的实用性。为分析数据，我们开发了一个定制程序，该程序可从多通道、多 z 层及多时间点的宽视野图像中裁剪出单个胚胎，并将每个胚胎的图像序列保存为独立的 tiff 堆栈文件。该程序配备用户友好的图形界面（GUI），可通过分离、预处理和统一胚胎朝向，显著简化数据处理流程，为后续可视化或自动化分析做好准备。同时提供一个 ImageJ 宏，可将单个胚胎的数据整合为多面板文件，展示每个胚胎在各时间点的最大强度荧光投影图像和明场图像。本文所述的实验方案与工具已通过功能验证：用于分析 40 个已知发育相关基因敲降后的胚胎发育表型，不仅重现了先前报道的发育异常，还发现了新的表型。综上所述，本研究建立了一种半高通量成像方法，并配套开发了胚胎裁剪程序和 ImageJ 可视化工具，结合表达特异性荧光标记的品系，可显著加速胚胎发育相关研究的实验进程。

在表征分子扰动对C. elegans胚胎发育影响方面，一个重大挑战在于，胚胎从第一次卵裂到伸长阶段结束需要约10小时（20°C条件下）16。因此，建立一种半高通量方法，能够同时对大量胚胎进行成像，对于此类时间尺度上的事件研究具有重要意义，该方法可实现多种实验条件的平行成像，并为每种条件提供足够大的样本量，从而支持定量分析（图1A）。
半高通量成像方法与多标记菌株 
本文所述的半高通量成像方法（如图1B所示）采用384孔玻璃底板；多孔板格式可并行排列最多14种条件，且小孔尺寸限制了搜索区域，简化了用于高分辨率成像的含胚胎视野的识别。此处使用了一台共聚焦扫描仪，配备微透镜增强型双Nipkow旋转盘、512 × 512 EM-CCD相机、高精度自动XY载物台（标称分辨率为0.1 µm）以及电动Z轴控...

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C. elegans胚胎进行三维延时成像，以观察胚胎发育过程。此外，还提供了图像处理与可视化工具，以简化数据分析流程。将这些方法与定制的报告基因品系相结合，可实现对胚胎发育的精细动态监测。

秀丽杆线虫（C. elegans）是研究胚胎发育过程中细胞命运决定和形态发生事件的首选体系。一种……

秀丽隐杆线虫（C.elegans）的胚胎发育大约需要13小时，通常通过一次拍摄一个胚胎来进行监测。然而，我们的实验方案能够同时对80至100个胚胎进行三维时间序列成像。这种大规模采集发育中秀丽隐杆线虫胚胎数据的能力，为一系列新实验提供了可能，包括对发育事件的定量分析以及大规模筛选实验。该方案可轻松调整，用于捕获不同的发育过程，或对在特定组织中表达任意标记物组合的胚胎进行成像。将胚胎均匀分散于孔中具有一定挑战性。胚胎应紧密排列，以便在单个视野中捕获多个胚胎，同时避免在不同Z平面发生聚集。我们建议两名研究人员并排在冰上进行解剖，并封闭未使用的孔。我们还将演示一些快速设置分阶段384孔板的实用技巧。首先，使用PCR粘性封膜密封底部为玻璃的384孔板，以遮蔽未使用的孔。使用剃刀或手术刀切去铝箔，暴露部分孔以便使用。向每孔中加入 70 µL 新鲜配制的 TMHC，并将板置于冰上。排除板的最外两行，以避免边缘效应。为快速制备样品，建议两名研究人员并行进行解剖操作。当所有溶液接种完毕后，使用精细镊子和解剖显微镜，将约10条具有生殖力的成虫转移至每个条件对应的凹面载玻片中，其中含有150 µL冰冻的TMHC溶液。使用镊子和解剖刀解剖线虫以释放胚胎，并将拉制的毛细移液管装入口吸装置中。 使用口吸管将所有处于2至8细胞期的胚胎转移至已准备好的培养板的各个孔中，并检查培养板，确认各孔内无聚集物存在。当所有胚胎收集完毕后，通过离心使样本沉降，并使用经乙醇浸润的擦拭布清除培养板底部的任何残留物。将培养板放入配备有温度控制环境的共聚焦显微镜的板架中，使用10倍物镜对每个孔进行预扫描，以识别含有合适胚胎的视野。扫描结束后，切换至60倍物镜，在每个时间点调整焦平面，对每孔成像1到4个视野，并以2微米为间隔在10小时内每隔20分钟采集18层Z轴切片。所有图像采集完成后，在过夜成像开始后约20至24小时进行一次低倍率的全孔明场扫描，以评估胚胎致死率。若要使用embryoCropUI可执行程序进行自动裁剪，请首先从Zenodo下载该程序及测试文件。解压缩以确定该程序是否在平台上正常运行。下载完成后，解压并找到 embryoCropUI 可执行文件，双击启动程序。选择“打开”以加载第一个需要裁剪的特定 4D 视场。当裁剪具有多个维度的TIFF序列时，仅在文件夹中加载该序列的第一幅图像。当所有图像加载完成后，设定成像参数，选择背景减除和衰减校正，并设置图像采集顺序及每像素对应的微米数。然后选择运行，系统将在未裁剪文件夹的同一路径下创建一个名为crop的新子文件夹，裁剪后的图像将保存在此位置。为进行可视化操作，请从 Zenodo 下载开源且整合的 MSV2 ImageJ 插件及图形用户界面说明文件 Zenodorepov2.docx，并在 ImageJ 中打开该插件。找到第三行和第四行，输入图像文件夹在裁剪后将要存储的位置。待处理条件的图像文件夹名称，以及每个过夜实验的唯一字母数字标识符。输入所有信息后，点击“运行”。此时将弹出一个窗口，提示导航至包含已裁剪图像文件夹的最外层文件夹。选择后，将出现另一个窗口，可用于设定成像参数。点击确定。复合文件将开始组装。当复合体生成后，检查仍处于打开状态的文件。当与定制报告基因品系联合成像时，可为大多数主要的发育事件提供具有信息性的读出结果，包括硫酸盐特化、背侧嵌合、表皮包裹、伸长以及神经发生。注射后24小时是成像的最佳时间点。此时，母源蛋白已有效耗尽，合子基因表达也被有效抑制，从而在参与硫酸盐定型和形态发生的一系列基因中产生明显且高度可重复的特征性表型。在解剖和胚胎筛选步骤中务必保持耐心。尽量减少团聚并选择合适焦平面对于确保高质量数据也至关重要。本方案可与多种荧光标记菌株联用，并可结合 RNAi 或突变体进行操作。我们的处理工具支持简化、自动化或手动的数据分析。利用本文所述的菌株、方法和工具，我们的研究团队开展了一项基于RNA干扰的高内涵筛选，靶向约2,000个在胚胎发育过程中必需的基因。半高通量方法对于本项目的实施至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

半高通量成像方法和数据可视化工具包，用于分析C. elegans胚胎发育

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

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高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

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了解半高通量三维延时成像方法，用于同时分析80至100个秀丽隐杆线虫胚胎发育过程。该方案结合定制图像处理工具，实现发育生物学定量分析与大规模筛选。

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