Name: 微卫星DNA基因分型和流细胞学比较分析形式固定石蜡嵌入水合体摩尔组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 了解微卫星DNA基因分型和流式细胞学分析方法，用于诊断水泡状胎块并减少母体DNA污染。该技术为病理学研究提供快速且经济有效的检测方案。

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作者感谢 Sophie Patrier 和 Marianne Parésy 分享原始流式细胞术实验方案，以及 Promega 和 Qiagen 提供的耗材和试剂。本研究得到了魁北克生殖研究网络和加拿大卫生研究院（MOP-130364）对 R.S. 的资助支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

葡萄胎是一种具有异质性病因的异常人类妊娠，其组织学和基因型类型多样，导致准确分类和诊断较为困难。组织病理学形态学评估常被证明不够准确，因此单独依靠该方法对完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）进行分类，并将其与非葡萄胎性流产相区分并不可靠。因此，葡萄胎的准确诊断需要结合其他方法，如多重微卫星DNA基因分型、流式细胞术进行倍性分析、FISH进行倍性分析，以及p57KIP2免疫组织化学检测。这些方法各自具有一定的局限性和优势。
多重基因分型与流式细胞术的局限性与优势
母体污染是处理FFPE组织时最常见的问题之一，可能导致误诊，因此强调了将母体组织与产物组织（POC）分离的重要性。识别母体污染对于预判基因分型峰的特征及其结果解读具有重要意义。如果污染程度过高而影响结果的可靠判读，则应重复DNA的分离与提取过程，并格外注意彻底清除所有可能的母体组织。在组织形态不清晰的区域，应优先去除这些区域，以最大限度地降低母体污染的风险。本方案所述方法的第一个优势在于，除了成本较低外，...

葡萄胎（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征是胚胎发育异常、滋养层细胞过度增殖以及绒毛膜绒毛（CV）的水泡样变性。传统上，葡萄胎仅根据形态学评估分为两种类型：完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）1。然而，研究表明，仅依靠形态学评估不足以将葡萄胎准确分类为这两种亚型（CHM 和 PHM），也难以将其与非葡萄胎性流产相区分2,3,4。
由于完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）的恶性倾向不同，因此准确判断葡萄胎的基因型对于为患者提供恰当的随访和管理至关重要。因此，在过去几十年中，已开发并发展出多种方法，用于确定葡萄胎组织的亲本来源，从而实现对葡萄胎的正确分类。这些方法包括核型分析、染色体带型多态性分析、人类白细胞抗原（HLA）血清学分型、限制性片段长度多态性分析、串联重复序列可变数目分析、微卫星基因分型、流式细胞术以及p57KIP2免疫组织化学染色。这些技术使得可根据基因组中亲本贡献的来源对葡萄胎妊娠进行准确分类，具体如下：完全性葡萄胎（CHM）为二倍体，其来源为单精子或双精子的雄性基因组；而部分性葡萄胎（PHM）为三倍体，其中99%为双精子来源，1%为单精子来源5,6,7,8。此外，在过去二十年中还发现了一种新的葡萄胎基因型，即二倍体双亲来源型葡萄胎。这类葡萄胎多表现为复发性，可累及单个家庭成员（单发病例）或至少两个家庭成员（家族性病例）。这些二倍体双亲来源型葡萄胎大多由患者NLRP7或KHDC3L基因的隐性突变引起9,10,11,12。携带NLRP7基因隐性突变的患者所发生的二倍体双亲来源型葡萄胎，在形态学分析中可能被误诊为CHM或PHM，这似乎与患者突变的严重程度相关13,14。除了根据基因型对葡萄胎进行分类外，多种基因分型方法的引入和应用还使得能够将各种类型的葡萄胎与非葡萄胎性流产（如非整倍体二倍体双亲来源妊娠及其他类型的妊娠）区分开来5,15。这些非葡萄胎性妊娠可能表现出一定程度的滋养层细胞增殖和异常绒毛形态，从而在某些方面模拟葡萄胎的部分形态学特征。
本文的目的是提供针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的多重基因分型和流式细胞术的详细实验方案，并对这些方法的结果进行综合分析，同时将其与其他方法整合，以实现对葡萄胎组织的准确且结论性的诊断。

<table><tbody><tr><td>BD FACS Canto II</td><td>BD BioSciences</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>毛细管电泳仪：Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA 分析仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>313001R</td><td>由加拿大基因组应用中心提供服务&lt;br/&gt;(http://www.tcag.ca)</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>组织病理学封片介质：Cytoseal 60</td><td>Fisher</td><td>23244257</td><td></td></tr><tr><td>伊红Y储备液（1%）</td><td>Fisher</td><td>SE23-500D</td><td></td></tr><tr><td>FCSalyzer - 流式细胞术分析软件</td><td>SourceForge</td><td>-</td><td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td></tr><tr><td>FFPE Qiagen 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>11295-51</td><td>用于切片及清洗过程</td></tr><tr><td>冰乙酸（浓）</td><td>Sigma</td><td>A6283-500mL</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片：Cover Glass</td><td>Fisher</td><td>12-541a</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Fisher</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>高纯度去离子甲酰胺：Hi-Di Formamide</td><td>Thermo Fisher</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>免疫组化平台：Benchmark Ultra</td><td>Roche</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>Ultident</td><td>30-34120</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>Fisher</td><td>12-634-1C</td><td></td></tr><tr><td>Nitex 滤网，48 &amp;mu;m</td><td>Filmar</td><td>74011</td><td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&amp;amp;id=51&amp;amp;lang=en ；其他滤膜亦可使用，但此产品来自非科研公司，价格低廉且效果良好</td></tr><tr><td>p57 抗体</td><td>Cell Marque</td><td>457M</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>VWR</td><td>53499-632</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>PeakScanner 1.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4381867</td><td>基因分型分析软件。</td></tr><tr><td>来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P7012</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>带正电荷载玻片：Superfrost Plus 25×75 mm</td><td>Fisher</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>PowerPlex 16 HS 系统</td><td>Promega Corporation</td><td>DC2102</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>来源于牛胰腺的核糖核酸酶A</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>分离基质：POP-7 聚合物</td><td>Thermo Fisher</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织微卫星dna基因分型与流式细胞术倍性分析

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

葡萄胎（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征为滋养层细胞过度增殖和胚胎发育异常。根据显微镜下的形态学评估，HM可分为两种类型：完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）。这两种类型还可根据亲本对葡萄胎基因组的贡献进一步细分。通过形态学和基因型分析对HM进行分类，对于患者的临床管理以及对该疾病病理机制的基础理解至关重要。已有充分文献表明，HM的形态学分析存在较大的观察者间差异，单独依靠形态学不足以准确地将HM分类为CHM或PHM，也难以将其与水肿性非葡萄胎流产相区分。基因分型分析通常在来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的妊娠产物组织及其DNA上进行，但这类样本质量欠佳，可能导致错误结论。本文提供了针对FFPE葡萄胎组织进行多重基因分型和流式细胞术分析的详细实验方案，并阐述了这些方法的结果解读、常见问题的排查，以及如何将其与形态学评估、p57KIP2免疫组织化学和荧光原位杂交（FISH）技术相结合，以实现准确且可靠的诊断。作者在此分享了过去10年中对约400例妊娠产物分析所积累的方法与经验。

由于葡萄胎组织的复杂性及其可能存在多种基因型，必须进行严格的分析，并采用多种方法，如形态学评估、p57免疫组织化学、微卫星基因分型、流式细胞术和FISH。例如，一名患者（1790号）因两次被诊断为部分性葡萄胎（PHM）而转诊，仅通过对产物组织（POCs）的微阵列分析发现其为三倍体。因此，该患者被诊断为复发性部分性葡萄胎（PHM）。然而，对其两次所谓的“PHM”样本以及患者及其配偶的DNA进行微卫星基因分型后发现，患者的第一个葡萄胎为三倍体双精受精来源（图9A），而第二个“PHM”则具有三倍体双母源基因型（图9B），因此并非真正的PHM，而是一次非葡萄胎性流产。
第一个标记物在 图9A</str...

葡萄胎是一种具有异质性病因的异常人类妊娠，可根据其形态学特征及葡萄胎基因组的亲本来源进行分类。本文详细描述了对福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织进行多重微卫星DNA基因分型和流式细胞术分析的实验方案，并介绍了结果的解读与整合方法。

福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织微卫星DNA基因分型与流式细胞术倍性分析

葡萄胎（Hydatidiform mole, HM）是一种以滋养层细胞过度增殖和胚胎发育异常为特征的异常人类妊娠。根据……

本基因分型方案的主要优势在于可最大程度减少母体DNA的污染，而母体DNA污染是检测福尔马林固定、石蜡包埋的葡萄胎组织时面临的主要挑战。流式细胞术是一种快速且经济的方法，可显著促进葡萄胎的诊断。对于每一份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的妊娠产物样本，应按照本视频所述制备厚度为四微米的苏木精-伊红染色切片，用于显微镜下的形态学评估。将FFPE组织块置于冰上15分钟，以利于切片。调整切片机，切取厚度为4 µm的切片用于显微镜下形态学评估。将冷却的组织块放入切片机中，从每个组织块切取一张切片用于苏木精-伊红（H&E）染色。用镊子将每个切片转移至 45 °C 的水浴中。用已用铅笔标记好样本编号的带正电荷载玻片从水浴中捞起切片。将带有切片的载玻片放入 65 °C 的烘箱中，使切片牢固黏附于载玻片上。将载玻片置于烘箱中孵育25分钟。进行H&E 将切片浸入相应染色缸中，按照文本方案中列出的时间进行染色。使用封片介质对四微米切片进行封片，用于形态学分析。用盖玻片覆盖。利用 H&E 切片和光学显微镜，选择含有最多绒毛组织的 FFPE 组织块；如果可能，应选择绒毛组织与母体组织分离且未混杂的组织块。将切片机调整至切取厚度为10微米的切片，用于DNA提取。根据组织块中绒毛组织的量，切取10至30张切片。如前所述用载玻片收集切片后，将带有切片的载玻片置于65°C的烘箱中，使切片牢固附着于载玻片上。将载玻片置于烘箱中孵育20分钟。进行H&E 将载玻片浸入相应染色缸中，按照文本方案中列出的时间进行染色。将载玻片置于通风橱内至少三小时，以使有毒的二甲苯气味充分挥发。使用镊子从湿润的纸巾上撕下一小片。在立体显微镜下，利用镊子和经水润湿的小片纸巾，轻轻刮除苏木精-伊红染色的10微米厚切片上所有不需要的母体组织。此步骤的关键在于耐心，尤其是对于较难处理的组织块。此外，还应由其他人进行检查，以确保没有遗漏母体组织。现在，从湿润的擦拭纸上撕下新的一片，用它来收集绒毛组织。将带有附着绒毛组织的擦拭纸片放入已标记的1.5 ml离心管中。尽量减少此步骤中使用的纸巾量，因为使用过多可能会堵塞DNA提取柱，从而降低最终收集到的DNA量。按照FFPE试剂盒的DNA提取方案进行DNA提取。使用实验室分光光度计，加入1 µL DNA，于216 nm处测定吸光度以进行定量。取1微升DNA样品加入2%琼脂糖凝胶中，在80至100伏电压下进行琼脂糖凝胶电泳，用于定性分析。根据DNA评估结果，确定用于多重短串联重复序列PCR扩增的DNA用量，建议使用不少于1000纳克的DNA。按照文本方案中所述，进行PCR扩增、毛细管电泳和数据分析。为选择理想的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块，使用光学显微镜观察苏木精-伊红（H&E）染色切片，挑选其中约50%至70%组织成分为绒毛组织的FFPE组织块。对于绒毛组织含量不理想的组织块，可在切片过程中对绒毛组织进行富集。为此，根据相应的H&E切片确定新鲜切割组织的哪一侧含有更多的绒毛膜绒毛，然后使用刀片切去需要丢弃的另一侧，以富集绒毛膜绒毛。为获得最佳的FFPE包埋块切片效果，使用切片机切割四张厚度为50 µm的切片。若无法获得理想的FFPE组织块，仍应尽量保持绒毛组织与母体组织的比例。例如，如果组织块中仅有30%为绒毛组织，其余部分为母体组织，则应去除至少一半含有母体组织的切片，并通过增加切片数量进行补偿。将切片置于已标记的15 mL离心管中。进行脱蜡和复水时，应在通风橱中操作，按照文本方案中列出的时间依次加入每种试剂，并等待相应时间。然后使用巴斯德吸管通过真空抽吸去除试剂。接着，向15 mL离心管中加入4°C的柠檬酸溶液。将溶液置于80摄氏度水浴中两小时后，使其冷却至室温。用真空抽滤去除柠檬酸溶液。加入6毫升1x PBS缓冲液，涡旋混匀，静置1至2分钟，使组织沉降至管底。如有需要，将样品在1000 RPM条件下离心30秒。用真空抽吸法去除1X PBS。随后加入1 mL预热的胃蛋白酶溶液，置于37摄氏度干浴中孵育30分钟。每10分钟涡旋一次。在此孵育的最后10分钟内，配制碘化丙啶-核糖核酸酶A溶液。再加入6 mL的1×PBS，涡旋混匀，静置1至2分钟，使组织沉降至管底。再次用真空抽吸法移除 1x PBS。加入 550 µL 碘化丙啶-核糖核酸酶 A 溶液，将样品置于 37 °C 干浴中孵育 30 分钟。用镊子将一块 5 cm × 5 cm 的 48 µm 滤膜置于聚苯乙烯圆底管的上部，用于流式细胞仪检测。用移液管将液体通过滤网过滤至离心管中。样品现可进行流式细胞仪检测。在准备上机前，需用铝箔包裹避光保存。最后，按照文本方案中所述进行流式细胞术及数据分析。对部分性葡萄胎进行微卫星基因分型，同时分析患者及其配偶的DNA，结果显示该患者的葡萄胎为三倍体双精子来源。第一个标记位点在妊娠产物中显示出两个峰。第一个峰来自母亲，因为只有母亲具有这种大小的峰。根据相同的推理，第二个峰来自父亲，因为他携带相同的等位基因。注意第二个峰明显高于第一个峰，表明该峰中可能含有两份相同的父源等位基因。该妊娠产物中的母体污染非常轻微，因为在第二个母源等位基因位置仅显示一个极小的峰。第二个位点在妊娠产物中显示出三个峰，其中两个峰来自父亲，一个峰来自母亲。第三和第四个位点与第一个位点相似，同样显示有两个等位基因来自父亲，一个来自母亲。由于所有四个位点均一致显示存在三个等位基因，其中两个来自父亲，一个来自母亲，因此可以得出结论：该妊娠产物为双精子受精型三倍体，确诊为部分性葡萄胎。在解读基因分型结果时，必须结合清洗步骤中所记录的备注，充分考虑样本污染的程度。在某些情况下，采用上述两种方法仍无法得出结论。此时，我们会使用其他方法，例如荧光原位杂交（FISH），以揭示真实的基因型。微卫星基因分型技术实现了对葡萄胎的精确诊断，并为进一步理解与不同类型葡萄胎特征相关的基因型奠定了基础。

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遗传学

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本文介绍了一种用于测定单个细胞中线粒体（mt）DNA绝对拷贝数及mtDNA缺失异质性水平的实验方案。...

使用数字微滴聚合酶链式反应测量单细胞线粒体DNA拷贝数与异质性

焦磷酸测序分析可实现对异质性细胞或组织中线粒体DNA单核苷酸多态性的稳健且快速的基因分型。...

通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型

本方案提供了针对基于DNA条形码成像的小鼠FFPE黑色素瘤组织，设计多重免疫荧光抗体组合的逐步操作指南。我们还描述了使用开源工具进行图像分析的流程，以获得关于小鼠黑色素瘤肿瘤免疫微环境的空间蛋白质组学见解。...

基于DNA条形码的多重免疫荧光成像分析基因重编程小鼠黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本

了解微卫星DNA基因分型和流式细胞学分析方法，用于诊断水泡状胎块并减少母体DNA污染。该技术为病理学研究提供快速且经济有效的检测方案。

福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织微卫星DNA基因分型与流式细胞术倍性分析

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