使用天然多酚姜黄素对脑组织中淀粉样斑块进行标记与成像

与目前标记这些斑块的金标准——淀粉样蛋白特异性抗体相比，该方案是准确标记β-淀粉样蛋白斑块最高效且最具成本效益的方法。该技术所需时间更短，且效果与任何常用的淀粉样蛋白标记方法相当。姜黄素可强烈结合淀粉样蛋白斑块，既可在脑部PET扫描中用作成像探针，也可用于通过视网膜扫描进行相对无创的筛查。

姜黄素还可结合阿尔茨海默病中的神经纤维缠结或tau蛋白缠结、帕金森病中的α-突触核蛋白以及亨廷顿病中的突变亨廷顿蛋白。本次实验操作将由我实验室的研究生Zackary Bowers和研究科学家Alexandra Plemmons演示，Panchanan Maiti参与示范。在确认麻醉后的12月龄阿尔茨海默病模型小鼠对疼痛反射无反应后，将小鼠仰卧置于手术托盘上，切开腹部并穿过膈肌。

将21号灌注针插入切口，并在右心耳处做一小切口，以使灌注液从体内流出。使用重力驱动的灌注系统，使冰冻的0.1摩尔PBS溶液以每分钟20至25毫升的流速流入针头，持续5到6分钟。若灌注操作正确，可观察到肝脏变得透明。

正确的动物灌注至关重要，因为如果血液未被完全清除，姜黄素可能会与血管结合，导致产生绿色荧光背景信号。当所有 PBS 完全灌注完毕后，将缓冲液阀门切换至冰上预冷的 4% 多聚甲醛溶液，继续灌注 8 到 10 分钟，然后使用剪刀和镊子将脑组织从颅骨中取出。随后用刮勺将脑组织转移至含有至少 10 倍于组织体积的 4% 多聚甲醛的离心管中，于 4°C 条件下保存，直至后续处理。

为了获得用于冰冻切片的组织切片，将脑组织在4°C条件下依次浸入梯度蔗糖溶液中，每种浓度浸泡24小时，随后使用冰冻切片机在-22°C下切取40微米厚的切片，并在切片获取过程中将其每10至20片置于含PBS（添加0.02%叠氮化钠）的6孔板的各孔中。当所有样本切片均获取完毕后，将切片于4°C保存，直至进一步处理。为了获得用于石蜡包埋切片的组织切片，将灌注固定后的脑组织在室温下依次用梯度酒精溶液脱水，每种浓度处理2小时，随后进行两次100%酒精浸泡（每次1小时），再进行两次二甲苯浸泡（每次1小时）。

最后一次二甲苯浸润后，将组织置于二甲苯与石蜡体积比为1:1的混合溶液中，在56摄氏度条件下孵育两次，每次一小时，容器为铝箔包裹的玻璃锥形瓶；随后将组织浸入56摄氏度的石蜡中，持续四至六小时。孵育结束后，于室温下使用旋转式切片机切取厚度为5微米的切片，并在收集切片时将其放入45摄氏度的展片水浴中。对于冰冻切片中淀粉样蛋白β斑块的姜黄素标记，先用PBS缓冲液冲洗切片三次，每次五分钟；然后将切片在室温下浸入70%乙醇中两分钟。

在孵育切片的同时，将一毫摩尔的姜黄素储备液溶解于甲醇中，并用70%乙醇稀释至终工作浓度为10微摩尔。孵育结束后，将切片浸入姜黄素工作液中，在室温下以每分钟50转的速度染色10分钟。染色结束后，弃去姜黄素溶液，并用70%乙醇洗涤切片三次，每次两分钟。

最后一次洗涤后，将切片转移至多聚赖氨酸包被的玻片上，用适当的有机封片剂将盖玻片封固于每张玻片上。然后使用荧光显微镜，以10倍或20倍物镜以及相应的激发和发射滤光片观察切片。对于深部石蜡包埋组织切片的组织化学标记，将5微米厚的切片在室温下浸入二甲苯中两次，每次5分钟，随后通过梯度酒精溶液（每次1分钟）进行再水化。

孵育结束后，用梯度酒精溶液洗涤切片，每种浓度各洗涤两分钟，随后用二甲苯透明处理，每次二甲苯浸泡五分钟，共两次。第二次二甲苯浸泡后，将每张切片置于载玻片上，加盖盖玻片，并使用适合荧光显微成像的封片介质进行封片，操作如图所示。对于冷冻切片标本使用抗Aβ抗体标记，先在12孔板的各个孔中用新鲜PBS洗涤样品，每次洗涤更换PBS，共洗涤三次；然后在室温下用含10%正常山羊血清和0.5%Triton X-100的PBS溶液封闭非特异性结合位点，封闭时间为一小时。

孵育结束后，弃去封闭液，加入针对 a-beta 的特异性抗体，于 4°C、150 转/分钟条件下孵育过夜。次日早晨，用新鲜的 PBS 溶液洗涤切片，每次 10 分钟，共洗涤三次，随后在避光条件下加入与红色荧光染料偶联的适当二抗，室温孵育 1 小时。孵育结束后，用 PBS 洗涤切片三次，再用 70% 乙醇洗涤一次。

酒精洗涤后，将切片在室温下与10 µM姜黄素孵育10分钟，随后用70%酒精洗涤三次，每次一分钟。最后一次洗涤后，依次用90%和100%酒精脱水，每个浓度各一分钟，并用新鲜二甲苯浸洗两次，每次五分钟以透明切片。然后按照演示方法封片并成像。

对于细胞内淀粉样蛋白β的共定位，先用抗淀粉样蛋白β抗体对切片进行染色，随后在室温、避光条件下以每分钟50转的速度加入姜黄素染色，操作如图所示。孵育结束后，在室温、避光、每分钟50转的条件下用适当的细胞核染料复染10分钟，然后用PBS洗涤三次。随后，将切片封片，并按图示方法通过荧光显微镜成像。

尽管延长姜黄素孵育时间会略微增强Aβ斑块的荧光强度，但在染色1分钟与5分钟之间，所观察到的斑块数量并无显著差异。姜黄素可用于染色Aβ斑块，适用于冷冻切片、石蜡包埋以及人类阿尔茨海默病组织样本。在姜黄素染色前使用Aβ特异性抗体进行标记，结果显示姜黄素的信号与抗体结合的同一斑块处的Aβ完全共定位。

使用姜黄素标记的 Aβ 寡聚体染色后，可在 Aβ 斑块中观察到姜黄素与寡聚体的共定位。类似地，姜黄素在细胞内空间也与 Aβ 特异性抗体共定位，证实该染色方法可标记细胞内 Aβ。此外，姜黄素标记的效果比传统的淀粉样蛋白结合染料更为显著。

与姜黄素相比，姜黄提取物中的姜黄素衍生物在人阿尔茨海默病脑组织中对 Aβ 斑块的标记效果相当，且不受封片介质类型的影响。此外，即使在使用典型核染料和其他细胞标志物染色后，姜黄素的免疫荧光信号和复染强度仍得以保持。我们发现，切片厚度应恒定地小于 40 微米。

该训练程序应控制在30分钟以内，最佳姜黄素浓度为1至2微摩尔。可在同一样本组织上进行双重标记以检测延迟的生物标志物，从而更特异性地确定所标记的脑细胞类型。鉴于姜黄素能够减少淀粉样斑块负荷，目前正从细胞和分子水平上深入研究这一过程的具体机制。