一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

人脑类器官是一种重要的研究工具，可用于在易于操控且具有人类生理环境以及多种细胞类型相互作用的系统中研究疾病。该技术可应用于研究多种脑部疾病，包括神经发育障碍、毒性损伤以及脑肿瘤的生长与治疗。本方案的主要优势在于能够生成具有多种神经元细胞类型的高可重复性脑类器官。

此操作采用一种非常简化的流程，大多数实验室均可完成。这些操作以临时适宜的方式进行，无需使用特定生长因子或成分未定义的基质，因此该系统简单且成本低廉。首先，在15毫升锥形管中，将100微升基质与5.9毫升冰上预冷的DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基或F12培养基）混合。

在六孔板的每个孔中加入一毫升基底膜基质，用封口膜包裹后于4°C过夜孵育。次日，吸去各孔中的多余液体，用F12培养基清洗各孔，然后每孔加入总共两毫升mTeSR1培养基的H9 hESCs细胞。

逐周培养细胞。每天加入 2 mL mTeSR1 培养基，将培养板置于 37 °C、含 5% 氧气和 5% 二氧化碳的低氧培养箱中。传代期间使用玻璃工具剔除培养物中的分化细胞。

每天更换培养基。在使用H9细胞进行类器官培养前的四到六天，应传代细胞。传代时，先用DMEM/F12培养基清洗细胞，然后吸去多余液体。

洗涤后，加入蛋白酶溶液，将细胞置于培养箱中孵育40分钟，使细胞集落漂浮于孔内。接着使用DMEM/F12培养基洗涤细胞三次，必要时进行滴定以使组织块更小。然后以大约1:8的比例将细胞分种至四个六孔板中，将培养板放入培养箱，并每天换液。

培养四到六天后，细胞融合度达到约80%。将细胞转移至常规培养箱中。每六孔板的hESCs，用1毫升原液加入5毫升DMEM或F12培养基，将蛋白酶原液稀释至工作浓度。

吸去并移除细胞培养基，然后用蛋白酶溶液覆盖hESCs。将培养板放入培养箱中孵育10至15分钟，或直至克隆边缘变圆并开始从基质分离，但在其完全变圆之前停止。倾斜培养板，吸去蛋白酶溶液，并用每孔2毫升的DMEM或F12轻柔洗涤细胞，每孔洗涤三次。

确保克隆始终附着在基质上。因此，ES细胞团块的大小必须合适，同时要保证其在dispase中孵育的时间恰当。如果孵育时间过短，将很难将其冲洗下来并分散开。

如果它们在其中停留时间过长，在洗涤步骤中细胞可能会直接脱落。向每个孔中重新加入约1至1.5毫升新鲜的mTeSR培养基，用温和的移液操作将细胞从培养板上冲洗下来，收集至50毫升锥形管中。在培养板内反复吹打吸取和分配hESC，直至细胞团块大小约为原始尺寸的1/30。

此时菌落簇的大小约为250至350微米。将细胞转移至一个含有30毫升不含bFGF的mTeSR培养基的超低吸附T75培养瓶中。第二天，倾斜培养瓶，使活细胞聚集于瓶角。

如果大量细胞已贴附在培养瓶底部，可用10毫升移液管将细胞转移至新的培养瓶中。最初几天内，预计会有较高比例的死细胞。待细胞沉降后，吸除培养基和死细胞，保留约10毫升含有活细胞的培养基，并加入20毫升添加了30纳克/毫升bFGF的低浓度bFGF培养基。

两天后检查细胞。大多数细胞应呈现健康且透亮的状态。然而，如果超过三分之一的细胞看起来较暗，则倾斜培养瓶，弃去20毫升培养基，并加入20毫升添加了20纳克/毫升bFGF的低bFGF培养基。

第3天，移除一半培养基，并加入15毫升添加了10纳克/毫升bFGF的hESC培养基。第5天，用15毫升神经诱导培养基替换一半的培养基。此后每隔一天，用神经诱导培养基更换一半的培养基。

培养三周后，可根据需要向培养基中加入100倍浓度的青霉素-链霉素，使其终浓度为1倍浓度。每隔一天更换一半培养基。在本方案中，形成的脑类器官外观明亮，大小均一，类器官中心无暗色死亡细胞。

细胞被逐渐去除bFGF。在第5天，将细胞转入神经诱导培养基中，并在整个培养期间维持在此培养基中。尽管类器官随时间推移体积增大而颜色变深，但神经玫瑰花结样结构不断扩展，表明神经分化已启动，并具有胚胎神经管的特征。

为了更深入地分析细胞内的基因表达，进行了qPCR分析。谷氨酸转运体VLGUT1在培养两周半时表达，到五周时表达量增加，并在培养五个月内保持稳定。前脑标记物Foxg1在培养至五周前仅低水平表达。

深层标记物 Tbr1 在约五周时达到峰值，随后逐渐下降。而上层标记物 Satb2、腹侧标记物 Eng1、后脑脊髓标记物 Hoxb4 以及少突胶质细胞标记物 Olig2 的表达则随时间逐渐增加。相比之下，干细胞标记物 Sox2 的表达随时间逐渐减少。

胶质细胞标志物GFAP在五周时达到峰值，随后保持相对稳定。在处理早期类器官中的ES细胞时，务必格外小心，避免污染，因为这些细胞是在不含抗生素的条件下培养的；同时请务必按照时间表进行换液。通过本实验流程，可采用定量RT-PCR检测基因表达，以及免疫荧光染色检测蛋白质表达与定位等技术对类器官进行评估。

利用该技术，我们能够研究小分子在缺氧舱模型中缓解人类新生儿缺氧损伤某些方面的潜力。值得注意的是，这些人脑类器官的表现与体内小鼠实验结果相似。