Name: 一种从人类胚胎干细胞中生成脑器官的静态自导方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习一种从人类胚胎干细胞中生成脑器官的静态自导方法。该方案无需外源性生长因子或基底膜基质，可产生具有多种神经元细胞类型和细胞组织特征的高可重复性类器官，适用于研究神经发育障碍、毒性损伤和脑癌等疾病。

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感谢耶鲁干细胞中心（YSCC）和耶鲁癌症中心（YCC）提供的协助。感谢Jung Kim博士对神经病理学的审阅。本研究得到了康涅狄格州再生医学研究基金、March of Dimes基金会以及美国国立心肺血液研究所R01HL131793（S.G.K.）的资助，同时获得耶鲁癌症中心、耶鲁癌症生物学培训项目NCI CA193200（E.B.）以及Joseph和Lucille Madri夫妇慷慨的无限制捐赠支持。

1. 干细胞维持
<ol>
	<li>根据制造商说明，将 H9 hESC 在一层生长因子减少的基底膜基质（参见材料表，下文简称为基质）上进行培养。
	<ol>
		<li>为包被一个 6 孔板或一个 10 cm 培养皿，将 100 µL 基质与 5.9 mL 冰冷的 DMEM/F12 培养基混合。用封口膜包裹培养板，于 4 °C 过夜保存。次日吸除多余基质/培养基后用于细胞传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周以约 1:12 的分裂比例每 7 天传代一次。使用 mTESR-1 培养基，在 37 °C、低氧培养箱（5% O2、5% CO2）中培养细胞。每天更换培养基。在传代期间使用玻璃工具剔除正在分化的细胞。</li>
	<li>在用于类器官生成前 4 至 6 天应对 H9 细胞进行传代。细胞应以约 1:8 的细胞簇比例进行传代。具体操作如下：首先用 DMEM/F12 培养基冲洗细胞，然后用中性蛋白酶（例如 dispase，下文简称为蛋白酶）消化细胞，再用 DMEM/F-12 冲洗，并将 30–60 个细胞簇以约 20% 汇合度接种至 4 个培养板（6 孔板或 10 cm 培养皿）中。收获前两天，将细胞转移至常规培养箱（21% O2、5% CO2）。开始类器官形成时，培养板细胞汇合度应达到约 80%。</li>
</ol>
2. 类器官培养中 hESC 的解离
<ol>
	<li>分装蛋白酶储备液（5 U/mL）。 
	注意：我们通常将1 mL分装液在-20 °C下冷冻保存，可使用数月。</li>
	<li>将蛋白酶原液用DMEM/F12稀释至工作浓度，每处理1块6孔板或10 cm培养皿的hESCs，取1 mL原液加入5 mL DMEM/F12。</li>
	<li>吸弃培养基，用蛋白酶溶液覆盖hESCs。将培养板放入培养箱中孵育10–15分钟，或直至细胞集落边缘变圆并开始从基质上分离。</li>
	<li>倾斜培养板，吸出蛋白酶溶液，用DMEM/F12轻轻洗涤细胞三次。使用6孔板时，每次洗涤用2 mL；使用10 cm培养板时，每次用6 mL。操作此步骤时，确保细胞集落仍附着在基质上。</li>
	<li>向每个孔中加回约 1.5 mL 新鲜 mTESR 培养基（或每 10 cm 培养皿加 5 mL），并用移液器轻轻吹打使细胞脱离培养皿表面。</li>
	<li>使用10 mL移液管，轻柔地吸液和加样，使hESC在培养板中均匀分布，直至覆盖约1/30的面积th 为其原始大小。完成这些步骤后，菌落簇应呈现为约250–350 µm大小的方形。</li>
</ol>
3. 类器官的生成
<ol>
	<li>将细胞转移至一个含有30 mL mTESR培养基（不含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））的超低吸附T75培养瓶中。</li>
	<li>次日，倾斜培养瓶，使活细胞聚集于瓶角（第一天可能需要5–10分钟，但随着细胞团增大，聚集速度会加快）。 
	注意：如果在此步骤或后续任何步骤中，有大量细胞贴附在培养瓶底部，请将细胞转移至新的培养瓶。前两天出现大量死细胞属于正常现象。进行换液时，应尽可能去除细胞碎片。</li>
	<li>待细胞沉降后，吸除培养基和死细胞，保留约10 mL含有活细胞的培养基。</li>
	<li>加入约20 mL低浓度bFGF培养基（DMEM/F12，添加1x N2、1x B27、1x L-谷氨酰胺、1x NEAA、0.05%牛血清白蛋白（BSA）和0.1 mM单硫代甘油（MTG），并补充30 ng/mL bFGF）。</li>
	<li>在第2天观察细胞状态。如果大多数细胞形态健康、透亮，则无需处理。但如果超过三分之一的细胞呈现暗沉状态，则需使用与步骤3.2相同的倾斜方法，更换为约20 mL补充有20 ng/mL bFGF的低浓度bFGF培养基。</li>
	<li>第3天，使用步骤3.2中的倾斜方法，更换一半培养基，加入20 mL补充有10 ng/mL bFGF的低浓度bFGF培养基。</li>
	<li>第5天，使用步骤3.2中的倾斜方法，更换一半培养基，加入20 mL神经诱导培养基（NIM：DMEM/F12、1x N2添加剂、0.1 mM MEM NEAA、2 µg/mL肝素）。 
	注意：如果存在任何明显大于其他细胞团或类器官的大型聚集体，应将其从培养体系中移除。大小可通过显微镜下观察估计（例如使用带刻度目镜）。大多数类器官大小相近（约100 ± 20 µm）。我们移除了尺寸约为其他类器官两倍以上或一半以下的类器官。</li>
	<li>每隔一天使用倾斜法更换约一半（~15 mL）培养基，补充新鲜神经诱导培养基（NIM）。</li>
	<li>培养3周后，可根据需要向培养基（NIM：DMEM/F12、1x N2添加剂、0.1 mM MEM NEAA、2 µg/mL肝素）中加入100x青霉素/链霉素，使其终浓度为1x。每隔一天更新一次培养基。 
	注意：采用此方法，我们可将类器官在体外培养中维持长达6个月。</li>
</ol>
4. RNA 提取与制备
<ol>
	<li>使用 10 mL 移液管从培养瓶中轻柔地取出约 15 个类器官（根据大小而定），放入 1.5 mL 离心管中。
	<ol>
		<li>将类器官在离心机中轻柔地沉淀（200 × g 离心 1 分钟），并用 1× Dulbecco's PBS（DPBS）清洗三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用经过验证的系统或方案提取 RNA（例如 RNeasy 试剂盒）。</li>
	<li>测定每个样品在 260 和 280 nm 处的光密度值。</li>
	<li>使用经过验证的系统或方案制备 cDNA（例如 iScript cDNA 合成试剂盒）。</li>
	<li>使用预先验证的引物（表 1）进行 qRT-PCR，引物中应至少包含一个看家基因。</li>
</ol>
5. 免疫组织化学
<ol>
	<li>固定
	<ol>
		<li>配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，并置于 4 °C 预冷。</li>
		<li>使用无菌刀片将无菌移液管的管尖剪去。</li>
		<li>用剪去管尖的移液管轻柔吸取类器官，避免其破碎（尤其是当类器官较大时），并将它们转移至含有额外培养基或 DPBS 的 6 孔板中。</li>
		<li>倾斜培养板，吸去培养基，加入 1× DPBS。再用 1× DPBS 清洗细胞两次。</li>
		<li>将 DPBS 替换为 4% PFA 溶液，并置于 4 °C 摇床上固定。 
		注意：我们通常固定 2 天（小类器官）至 7 天（类器官 &#62;3 个月），但更短时间（例如 16–24 小时）也可能适用。</li>
		<li>在 DPBS 中配制 30%、20% 和 10% 的蔗糖溶液。</li>
		<li>PFA 固定完成后，吸去 PFA 溶液，加入 10% 蔗糖溶液，置于 4 °C 摇床上孵育 24 小时。</li>
		<li>将 10% 蔗糖溶液替换为 20% 蔗糖溶液，置于 4 °C 摇床上孵育 24 小时。</li>
		<li>将 20% 蔗糖溶液替换为 30% 蔗糖溶液，置于 4 °C 摇床上孵育 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻切片
	<ol>
		<li>准备一层平整的干冰，并将已标记的塑料包埋模具放置其上。</li>
		<li>向模具中倒入一层薄薄的包埋剂（OCT），静置数秒使其开始硬化。</li>
		<li>使用剪去管尖的移液管将数个类器官放置于模具内的 OCT 表面，并仔细记录类器官的位置。</li>
		<li>缓慢加入 OCT 至填满模具并完全覆盖类器官，继续完全硬化 10 分钟。 
		注意：虽然冷冻超过 10 分钟有助于确保多个类器官在切片时保持理想相对位置，但也可使用乙醇-干冰混合物或液氮进行快速冷冻。</li>
		<li>用记号笔标记类器官的相对位置，以便切片时更容易定位。</li>
		<li>将模具放入密封袋或盒子中，于 -80 °C 保存，直至准备切片。</li>
		<li>使用冷冻切片机切取 10 µm 厚的切片，并将组织贴附于已标记的带正电荷的载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色
	<ol>
		<li>配制封闭液（含 0.3% Triton X-100 和 4% 正常驴血清的 PBS 溶液）。</li>
		<li>使用疏水性绘图纸笔在组织周围画圈。</li>
		<li>用 PBS 漂洗载玻片，每次 5 分钟，共漂洗 3 次。</li>
		<li>吸去 PBS，加入封闭液，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>吸去封闭液，加入一抗溶液（含适当浓度的一抗、0.1% Triton X-100 和 4% 正常驴血清的 PBS 溶液），4 °C 孵育过夜。</li>
		<li>次日，用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>吸去 PBS，加入用抗体溶液稀释的适当浓度的二抗，室温孵育 1 小时。</li>
		<li>用 1× PBS 漂洗 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液染色，随后用 1× PBS 漂洗 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>用封片剂将盖玻片封固于载玻片正面，室温避光干燥后，于 4 °C 避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325(2019).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
<li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+vascularized+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li>
<li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li>
</ol>

S.G.K. 是 Dansar IT 和 Gene-in-Cell 的科学顾问委员会成员。

与其他类器官模型类似，这是一种存在若干局限性的人工系统。尽管在整体表达水平上批次间的差异较小，但各个类器官之间仍表现出个体差异。例如，Sox-2 阳性区域的位置在每个类器官中并不完全相同（图3）。虽然qPCR适用于检测细胞批次的整体变化，但未来的研究将采用单细胞RNA测序等其他技术，以获取单个细胞水平上的更详细信息。该系统的另一个局限性在于，类器官内部尚未整合血管系统，而这一点已在一些较新的研究中实现17,18,19。然而，将hESCs从低氧环境过渡到高氧环境，可能更接近于胚胎发育过程中从无氧到有氧的转变过程。
本方案中的关键步骤包括神经球的形成，以及适当的维持培养，包括使用合适的培养基进行换液，以确保类器官在生长过程中细胞健康且获得充足的营养，同时避免过度拥挤。若出现细胞增殖不足或分化不充分的问题，我们建议使用新批次的低代次胚胎干细胞（ESCs）以及 fresh...

由于存在诸多实际和伦理限制，研究人类大脑一直面临巨大困难。尽管利用啮齿类动物开展的研究对于理解人类大脑至关重要，但小鼠大脑与人类大脑存在许多差异1,2。有趣的是，小鼠的神经元密度至少比灵长类动物大脑低7倍以上3,4。虽然从进化角度来看，灵长类动物比啮齿类动物更接近人类，但对大多数研究人员而言，使用灵长类动物并不现实。本实验方案的目的是在维持脑细胞多样性和细胞组织结构的前提下，采用一种更简化且成本较低的方法，重现人类大脑的许多重要特征，而无需使用异源基底膜基质或外源性生长因子。
Sasai 实验室的开创性工作采用拟胚体无血清培养（SFEBq）方法，从经信号诱导的胚胎干细胞（ESCs）中生成二维和三维的神经细胞类型5,6。许多人类脑类器官方法也大致遵循了从经信号诱导的 ESCs 出发的技术路径7,8。相比之下，本实验方案起始于脱离培养的人类胚胎干细胞（hESCs）聚集体，类似于 Thomson 实验室和 Zhang 实验室在铺板步骤之前的开创性操作9,10，也类似于 Pasca 实验室脑类器官方案在添加外源性生长因子之前的初始步骤11。基底膜基质（例如 Matrigel）已被广泛应用于多种脑类器官实验方案中，并被证明是一种有效的支架材料8。然而，最常用的基底膜基质在使用中也存在若干问题，例如在生产过程中会伴随批次间差异，共纯化出未知浓度的生长因子12。此外，这些基质可能干扰成像效果，并增加污染风险和实验成本。
尽管人脑类器官可用于回答许多科学问题，但需注意其存在某些局限性。首先，由于类器官起源于胚胎干细胞，其结构更接近于未成熟的大脑而非衰老的大脑，因此可能并不适合作为研究老年期发病疾病（如阿尔茨海默病）的理想模型。其次，虽然本实验方案中检测到了前脑、中脑和后脑发育的相关标志物，可用于研究治疗手段或疾病对多种脑区细胞的综合影响，但若需专注于特定脑区，也可采用其他专门的实验方案13,14。最后，类器官模型的另一局限在于其尺寸：人类大脑的平均长度约为167 mm，而通过振荡培养生成的脑类器官最大仅可达4 mm8，本方案所生成的类器官在10周时生长至1–2 mm。尽管如此，本方案仍为研究人类脑组织及多种细胞类型之间的相互作用提供了重要的工具。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 山羊抗兔</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>PHG0263</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>BX43 显微镜</td><td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI 染色剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023&quot; target=&quot;_blank">10010023&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>FluroSave</td><td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>NeuroMab, Davis, CA</td><td>N206A/8</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型 Matrigel（Matrix）</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>H9 hESC</td><td>WiCell, Madison, WI, USA</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>巯基甘油</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTESR 培养基</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 NeuroPlex</td><td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td><td>400-163</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清（NDS）</td><td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121&quot; target=&quot;_blank">017-000-121&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 仪</td><td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 试剂盒</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td><td>AB5603</td><td></td></tr><tr><td>TMS-F 显微镜</td><td>Nikon, Melville, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附 T75 培养瓶</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>3814</td><td></td></tr></tbody></table>

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

由胚胎干细胞分化而来的人脑类器官为研究三维系统中多种细胞类型之间复杂的相互作用提供了独特的机会。本文介绍一种相对简单且成本较低的类器官制备方法。在本方案中，人多能干细胞被解离为小细胞团簇而非单细胞，并在不含异源基底膜基质或外源生长因子的基础培养基中培养，从而允许内在发育信号指导类器官的形成。该简易系统可产生多种脑细胞类型，包括胶质细胞和小胶质细胞、干细胞以及前脑、中脑和后脑的神经元。本方案生成的类器官还表现出适当的时间和空间结构特征，可通过明场成像、组织学、免疫荧光以及实时定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）加以验证。由于这些类器官包含来自大脑不同区域的细胞类型，因此可用于研究多种疾病。例如，在最近发表的一篇论文中，我们展示了利用本方案生成的类器官研究缺氧对人脑影响的应用。该方法可用于探究一系列以往难以研究的病理状态，如神经发育障碍、遗传性疾病和神经系统疾病。

图1展示了多个时间点的代表性明场图像，用以说明细胞/类器官在整个实验方案不同阶段的形态特征。人胚胎干细胞（hESCs）从组织培养板中被取出，分割成小块后，置于T75超低吸附培养瓶中，形成球状结构。需要注意的是，这些细胞明亮且大小均一，细胞团中心无发暗或死亡细胞。细胞逐渐撤除bFGF。在第5天，细胞被转入神经诱导培养基，并在整个培养期间持续使用该培养基。尽管类器官随时间推移逐渐增大而变暗，但需注意在整个脑类器官发育过程中出现并不断扩增的神经玫瑰花环样结构（黑色箭头）。这些玫瑰花环结构标志着神经分化的启动，具有胚胎神经管的特征，表现出上皮特性，并围绕一个顶端腔隙15。
培养5个月后，类器官经苏木精和伊红染色显示，即使在中心区域也未出现大量坏死，而这一点在最初使用静态培养系统时曾令人担忧（图2A）。经经验丰富的神经病理学家进...

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。

由胚胎干细胞分化而来的人类脑类器官为研究多种细胞类型之间的复杂相互作用提供了独特的机会……

人脑类器官是一种重要的研究工具，可用于在易于操控且具有人类生理环境以及多种细胞类型相互作用的系统中研究疾病。该技术可应用于研究多种脑部疾病，包括神经发育障碍、毒性损伤以及脑肿瘤的生长与治疗。本方案的主要优势在于能够生成具有多种神经元细胞类型的高可重复性脑类器官。此操作采用一种非常简化的流程，大多数实验室均可完成。这些操作以临时适宜的方式进行，无需使用特定生长因子或成分未定义的基质，因此该系统简单且成本低廉。首先，在15毫升锥形管中，将100微升基质与5.9毫升冰上预冷的DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基或F12培养基）混合。在六孔板的每个孔中加入一毫升基底膜基质，用封口膜包裹后于4°C过夜孵育。次日，吸去各孔中的多余液体，用F12培养基清洗各孔，然后每孔加入总共两毫升mTeSR1培养基的H9 hESCs细胞。逐周培养细胞。每天加入 2 mL mTeSR1 培养基，将培养板置于 37 °C、含 5% 氧气和 5% 二氧化碳的低氧培养箱中。传代期间使用玻璃工具剔除培养物中的分化细胞。每天更换培养基。在使用H9细胞进行类器官培养前的四到六天，应传代细胞。传代时，先用DMEM/F12培养基清洗细胞，然后吸去多余液体。洗涤后，加入蛋白酶溶液，将细胞置于培养箱中孵育40分钟，使细胞集落漂浮于孔内。接着使用DMEM/F12培养基洗涤细胞三次，必要时进行滴定以使组织块更小。然后以大约1:8的比例将细胞分种至四个六孔板中，将培养板放入培养箱，并每天换液。培养四到六天后，细胞融合度达到约80%。将细胞转移至常规培养箱中。每六孔板的hESCs，用1毫升原液加入5毫升DMEM或F12培养基，将蛋白酶原液稀释至工作浓度。吸去并移除细胞培养基，然后用蛋白酶溶液覆盖hESCs。将培养板放入培养箱中孵育10至15分钟，或直至克隆边缘变圆并开始从基质分离，但在其完全变圆之前停止。倾斜培养板，吸去蛋白酶溶液，并用每孔2毫升的DMEM或F12轻柔洗涤细胞，每孔洗涤三次。确保克隆始终附着在基质上。因此，ES细胞团块的大小必须合适，同时要保证其在dispase中孵育的时间恰当。如果孵育时间过短，将很难将其冲洗下来并分散开。 如果它们在其中停留时间过长，在洗涤步骤中细胞可能会直接脱落。向每个孔中重新加入约1至1.5毫升新鲜的mTeSR培养基，用温和的移液操作将细胞从培养板上冲洗下来，收集至50毫升锥形管中。在培养板内反复吹打吸取和分配hESC，直至细胞团块大小约为原始尺寸的1/30。此时菌落簇的大小约为250至350微米。将细胞转移至一个含有30毫升不含bFGF的mTeSR培养基的超低吸附T75培养瓶中。第二天，倾斜培养瓶，使活细胞聚集于瓶角。如果大量细胞已贴附在培养瓶底部，可用10毫升移液管将细胞转移至新的培养瓶中。最初几天内，预计会有较高比例的死细胞。待细胞沉降后，吸除培养基和死细胞，保留约10毫升含有活细胞的培养基，并加入20毫升添加了30纳克/毫升bFGF的低浓度bFGF培养基。两天后检查细胞。大多数细胞应呈现健康且透亮的状态。然而，如果超过三分之一的细胞看起来较暗，则倾斜培养瓶，弃去20毫升培养基，并加入20毫升添加了20纳克/毫升bFGF的低bFGF培养基。第3天，移除一半培养基，并加入15毫升添加了10纳克/毫升bFGF的hESC培养基。第5天，用15毫升神经诱导培养基替换一半的培养基。此后每隔一天，用神经诱导培养基更换一半的培养基。培养三周后，可根据需要向培养基中加入100倍浓度的青霉素-链霉素，使其终浓度为1倍浓度。每隔一天更换一半培养基。在本方案中，形成的脑类器官外观明亮，大小均一，类器官中心无暗色死亡细胞。细胞被逐渐去除bFGF。在第5天，将细胞转入神经诱导培养基中，并在整个培养期间维持在此培养基中。尽管类器官随时间推移体积增大而颜色变深，但神经玫瑰花结样结构不断扩展，表明神经分化已启动，并具有胚胎神经管的特征。为了更深入地分析细胞内的基因表达，进行了qPCR分析。谷氨酸转运体VLGUT1在培养两周半时表达，到五周时表达量增加，并在培养五个月内保持稳定。前脑标记物Foxg1在培养至五周前仅低水平表达。深层标记物 Tbr1 在约五周时达到峰值，随后逐渐下降。而上层标记物 Satb2、腹侧标记物 Eng1、后脑脊髓标记物 Hoxb4 以及少突胶质细胞标记物 Olig2 的表达则随时间逐渐增加。相比之下，干细胞标记物 Sox2 的表达随时间逐渐减少。胶质细胞标志物GFAP在五周时达到峰值，随后保持相对稳定。在处理早期类器官中的ES细胞时，务必格外小心，避免污染，因为这些细胞是在不含抗生素的条件下培养的；同时请务必按照时间表进行换液。通过本实验流程，可采用定量RT-PCR检测基因表达，以及免疫荧光染色检测蛋白质表达与定位等技术对类器官进行评估。利用该技术，我们能够研究小分子在缺氧舱模型中缓解人类新生儿缺氧损伤某些方面的潜力。值得注意的是，这些人脑类器官的表现与体内小鼠实验结果相似。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

一种从人类胚胎干细胞中生成脑器官的静态自导方法

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。...

一种体外生成人脑类器官的方法

本视频展示了一种利用人胚胎干细胞（hESCs）生成脑类器官的技术。将贴壁培养的人胚胎干细胞集落用酶处理，使其脱离并解离成细胞簇。这些细胞簇在悬浮培养中形成三维球体，随后被诱导分化为模拟大脑皮层结构的类器官，包含分层的神经元和胶质细胞。...

一种从人类胚胎干细胞生成脑类器官的技术

本视频概述了利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成前脑类器官的过程，展示了从干细胞聚集体发育为模拟大脑皮层的复杂结构，并进一步分化为多种神经元类型的全过程。...

利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。...

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。...

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

本方案将介绍从小鼠和人类胚胎干细胞中诱导获得心肌前体细胞的方法。该方案的主要策略是利用流式细胞术，通过在胚胎干细胞系中构建的荧光报告系统来富集心肌前体细胞。...

从胚胎干细胞中获取心脏前体细胞

腭发育研究的动力源于腭裂的发生率，腭裂是一种出生缺陷，会给患者带来巨大的健康负担，并可能导致持久的畸形。本文展示了一种培养腭突的技术，可用于研究参与腭发育及融合过程中的不同信号通路。...

利用静态器官培养研究腭融合的方法

学习一种从人类胚胎干细胞中生成脑器官的静态自导方法。该方案无需外源性生长因子或基底膜基质，可产生具有多种神经元细胞类型和细胞组织特征的高可重复性类器官，适用于研究神经发育障碍、毒性损伤和脑癌等疾病。

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

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