使用微孔培养法生成具有睾丸特定结构的猪睾丸组织

该协议是重要的，因为它允许睾丸有机体，它可以用作一个平台，研究睾丸形态发生和高特罗波药物和毒性筛查。该技术的主要优点是，它具有高度可重复性，需要相对较少的细胞数量，并可用于生成大量具有睾丸特异性结构的睾丸器官。该方法可用于研究其他系统，如多能干细胞或胰岛细胞与必要的优化。

展示睾丸组织酶消化程序将是安娜沃伊格特，一个博士生从我的实验室。将睾丸收集到无菌烧杯中，用含有1%青霉素链霉素的PBS清洗。洗涤后将睾丸转移到100毫米组织培养皿中，PBS含有1%青霉素链霉素。

使用自动剪剪刀和钳子去除阴道和表皮。将分离的睾丸转移到新的100毫米的盘子中，用含有1%青霉素链霉素的PBS彻底清洗。沿着直轴直接切割睾丸。

然后用两个钳子将睾丸从图尼卡中剥离出来，并放入含有1毫升DMEM的新的100毫米盘中，配以1%青霉素链霉素。用无菌剪刀将去皮的睾丸切成一到两毫米的组织碎片。切后使用无菌钳子去除结缔组织的白色片段。

将碎块转移到溶液A中，放入50毫升的管子中，用DMEM将其加到50毫升，获得每毫升0.4毫克的浓度，用于可乐酶4S，每毫升浓度为0.8毫克，用于11月4W。将含有组织碎片的管子放入37摄氏度的水浴中30分钟。每五分钟轻轻反转一次管子。

30分钟后，在90倍G下离心管，在25摄氏度下休息1.5分钟。丢弃上一杯，使用溶液B的40毫升，用DMEM加50毫升，获得每毫升可乐酶4W的浓度为1.2毫克。将管子放入37摄氏度的水浴中30分钟，每5分钟轻轻反转一次管。

在 90 倍 G 下离心管，在 25 摄氏度下中断 1.5 分钟。之后丢弃上经剂，用1%青霉素链霉素用PBS洗一次。小心地从顶部收集管，放入新的 50 毫升管中。

用 PBS 向上顶管，高达 50 毫升。将管块以 90 倍 G 离心，在 25 摄氏度下休息 1.5 分钟。丢弃上一液，并添加新鲜的 PBS 洗两次额外的时间。

上次 PBS 洗涤后，取出上经液，并在五毫升 PBS 中重新悬浮半阴性管。然后，在管子中加入15毫升0.25%的三辛埃德普辛EDTA。将管子放在37摄氏度的水浴中，每两分钟轻轻倒置一次。

五分钟后，用组织培养板上的10微升样品，评估在显微镜下将小管的酶消化到单个细胞。每两分钟将样品放在显微镜下观察。如果大多数单个细胞可以检测到停止反应与5毫升FBS和过滤通过70微米网格，然后通过40微米网格。

将单个细胞在500倍G下离心，在25摄氏度下中断5分钟。在50毫升富集介质中重新悬浮，并使用血细胞计计算可行细胞的数量。将2000万这种起始细胞种群转移到两个超低附着100毫米培养皿中，并在37摄氏度、5%的二氧化碳和21%的氧气下孵育，为期两天。

每100毫米组织培养培养皿中剩余的2000万至2500万个细胞，总体积为8毫升富集培养培养皿。将盘子放入培养箱中，1.5小时后确保大多数Sertoli细胞附着在盘子上。稍微倾斜两个板，收集并结合超级纳特到一个新的100毫米板，并放回孵化器。

一小时后，再次将两个板的超自然剂组合成一个新的100毫米板。将盘子放回孵化器过夜。然后收集两个分数中丰富的生殖细胞，非粘附分数和微粘附分数。

收集上一级作为非粘附分数。对于稍微粘附的馏分，用PBS轻轻清洗板，并在室温下用两毫升1至20稀释0.25%Trypsin EDTA进行5分钟的治疗。通过添加两毫升富集介质停止反应，并收集在非粘附分数管中。

将起始细胞制备和富集的生殖细胞结合在管中，获得含有25%生殖细胞的工作细胞制剂。在500倍G下离心，在25摄氏度下休息5分钟。丢弃上一级，将细胞重新悬浮在20毫升的有机形成介质中，达到每毫升240万个细胞的浓度。

在一个新的管子中加入含有细胞的溶液的一毫升。在微井板的每个井中加入0.5毫升表面活性剂冲洗溶液。确保井中没有气泡。

去除气泡，将板在2000倍G下离心，在25摄氏度下破裂两分钟。在低放大率倒置显微镜下观察板，以验证气泡是否已从微孔中去除。用盖子盖住盘子，在室温下孵育30分钟。

处理完成后，取出冲洗液，并立即用无菌水或PBS清洗板。在每个井中加入0.5毫升的有机形成介质，并在2000次G下离心，在25摄氏度的温度下休息两分钟，以清除任何捕获的气泡。在低放大率倒置显微镜下观察井，以验证气泡是否已清除。

加入 0.5 毫升的工作细胞悬浮液，通过上下移液轻轻混合。在500倍G下离心，在25摄氏度下休息5分钟。使用倒置显微镜验证细胞是否聚集在微孔内。

将盘子转移到细胞培养箱和培养机构五天。每隔一天更换一半的介质。为了恢复器官，使用宽嘴移液器轻轻地移液介质向上和向下。

这允许器官从微井中出来。收集器官，修复和执行免疫细胞化学的生殖细胞标记，Sertoli细胞标记，围膜阿米德细胞标记和Leydig细胞标记，并在共生显微镜下可视化。在这项研究中，从一周大的猪睾丸中分离出细胞，这些细胞在微井中自行培养成球体，具有划界和独特的外部和内部隔间。

两个隔间由胶原蛋白IV正底膜隔开。GATA4阳性的Sertoli细胞和UCHL1阳性生殖细胞位于地下室膜的外部隔间中。aSMA正围管状阿米德细胞沿地下室膜内侧进行局部化，而CYP450阳性的Leydig细胞位于中间体的中心。

这种结构类似于在原地条件，其中Leydig细胞，围管状的阿米德细胞，位于内层，在间层隔间和生殖细胞，Sertoli细胞位于半尼弗上皮。重要的是要确保用于生成器官的细胞具有最佳质量。在酶消化的三位一体阶段，应注意。

按照这个程序，器官可以长期培养，以研究生殖细胞分化或分析基因表达和分泌的蛋白质或激素。使用睾丸特异性细胞关联创建器官的能力为研究对睾丸发育和生殖细胞功能重要的细胞-细胞相互作用提供了一种新颖的体外系统。