Name: 使用微孔培养法生成具有睾丸特定结构的猪睾丸组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习使用微孔培养法生成猪睾丸类器官，建立具有睾丸特异性结构的体外模型。该方法可重复性强、细胞用量少，适用于研究生殖发育和药物毒性筛选。

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本工作由美国国立卫生研究院/儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD）资助，项目编号 HD091068-01，授予 Ina Dobrinski 博士。

注意：1周龄仔猪的睾丸来自商业养猪场，作为商品猪去势手术的副产品获得。睾丸的获取已获得卡尔加里大学动物护理委员会的批准。
1. 组织消化用酶溶液的制备
注意：需要三种不同的酶溶液，包括两种不同的胶原酶IV溶液（溶液A、B）和一种脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶液。
<ol>
	<li>配制溶液A：将20 mg胶原酶IV S（材料表）和40 mg胶原酶IV W（材料表）溶解于25 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，然后用0.22 µm滤器过滤除菌。向溶液A中加入0.4 mL胎牛血清（FBS），以抑制胰蛋白酶活性。</li>
	<li>配制溶液B：将80 mg胶原酶IV W（材料表）溶解于40 mL DMEM中，然后用0.22 µm滤器过滤除菌。</li>
	<li>配制DNase I溶液（7 mg/mL）：将70 mg DNase I溶解于10 mL DMEM中，然后用0.22 µm滤器过滤除菌。 
	注意：此处所述胶原酶IV溶液的酶浓度与原始文献14中所述浓度（2 mg/mL）不同。本方案获得的细胞活力略高，但两种方案分离的细胞均可形成具有相同组织结构的类器官。</li>
</ol>
2. 睾丸组织的酶消化
<ol>
	<li>将睾丸收集到无菌烧杯中，用含1%青霉素/链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。清洗后，将睾丸转移至含1% P/S的PBS的100 mm组织培养皿中，使用经高压灭菌的剪刀和镊子去除鞘膜和附睾。将分离的睾丸转移至新的100 mm培养皿中，并用含1% P/S的PBS充分清洗。</li>
	<li>为保持无菌状态，使用另一套无菌剪刀和镊子将睾丸实质从白膜中剥离。沿白膜正下方的纵轴方向切开睾丸，然后用两把镊子将睾丸组织从白膜中剥离，并放入含有1 mL DMEM和1% P/S的新100 mm培养皿中。</li>
	<li>用无菌剪刀将剥离的睾丸组织剪切成1–2 mm大小的组织块。剪碎后，用无菌镊子去除结缔组织的白色碎片。</li>
	<li>将剪碎的组织块转移至溶液A中，并用DMEM补至50 mL，使胶原酶IV S（材料表）终浓度为0.4 mg/mL，胶原酶IV W（材料表）终浓度为0.8 mg/mL。将含组织块的溶液A置于37 °C水浴中30分钟，每5分钟轻轻颠倒混匀一次，并肉眼观察是否有DNA释放。
	<ol>
		<li>若观察到游离DNA，加入500 µL DNase I。30分钟后，在25 °C下以90 x g离心1.5分钟（开启刹车），弃去上清液。 
		注：DNA表现为浑浊状物质。摇动试管时，组织块会沉降，而DNA则悬浮于液体中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向试管中加入溶液B，并用DMEM补至50 mL，使胶原酶IV W（材料表）终浓度为1.2 mg/mL。将试管置于37 °C水浴中30分钟，每5分钟轻轻颠倒混匀一次。若观察到游离DNA，加入500 µL DNase I。</li>
	<li>30分钟后，在25 °C下以90 x g离心1.5分钟（开启刹车），弃去上清液，并用含1% P/S的PBS洗涤一次。 
	注：溶液A和溶液B的废弃上清液主要含有间质细胞。</li>
	<li>用PBS将试管补至50 mL。小心从上层收集曲细精管，并转移至新的50 mL离心管中。 
	注：未消化的大组织碎片会迅速沉降至底部，而消化后的生精小管则保持悬浮状态。不应收集大块组织碎片。此步骤可重复多次，直至原试管中液体几乎澄清，仅剩未消化的组织碎片，可将其丢弃。</li>
	<li>将曲细精管在25 °C下以90 x g离心1.5分钟（开启刹车），弃去上清液。加入新鲜PBS后再次离心。重复此洗涤步骤两次。</li>
	<li>最后一次PBS洗涤后，弃去上清液，将生精小管重悬于5 mL PBS中。然后向其中加入15 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）。将试管置于37 °C水浴中，每2分钟轻轻颠倒混匀一次。若观察到大量游离DNA，加入500 µL DNase I和5 mL DMEM。</li>
	<li>在显微镜下评估曲细精管消化为单细胞的程度（首次在5分钟后，之后每2分钟一次）。若主要观察到单细胞，则加入5 mL胎牛血清（FBS）终止反应，并依次通过70 µm和40 µm细胞筛过滤。 
	注：应注意确保用于消化的50 mL离心管（溶液A、溶液B及0.25%胰蛋白酶-EDTA）的管盖拧紧。若担心水浴中发生污染，可在管盖外包裹石蜡膜以确保无菌。</li>
	<li>将单细胞在25 °C下以500 x g离心5分钟（开启刹车），重悬于富集培养基（含5% FBS和1% P/S的Dulbecco改良Eagle培养基F/12（DMEM/F12））中，计数活细胞数量。此即起始细胞群体。取100 × 103个细胞固定，并按文献所述12进行生殖细胞标志物UCHL1（泛素C末端水解酶L1）的免疫细胞化学染色，以确定该起始细胞群体中生殖细胞的比例。 
	注：也可使用生殖细胞标志物早幼粒细胞白血病锌指蛋白（PLZF）15作为UCHL1的合适替代。在起始细胞群体中，预期细胞产量约为每克组织700–800 × 109个细胞。该细胞群体中生殖细胞比例应为4–5%。</li>
	<li>将约20 × 106个起始细胞群体分别接种于两个超低吸附100 mm培养皿中（每皿含10 × 106个细胞，悬浮于10 mL含1% P/S的DMEM/F12中），在组织培养箱（37 °C，5% CO2，21%氧气）中培养2天。对剩余细胞进行生殖细胞富集。 
	注：为确保最佳细胞活力和质量，在进行生殖细胞富集及后续定量期间，将起始细胞群体在超低吸附组织培养皿中培养2天。</li>
</ol>
3. 生殖细胞富集
注意：上述步骤主要获得支持细胞和生殖细胞。利用不同的贴壁特性，可通过差速贴壁法分离支持细胞与生殖细胞。
<ol>
	<li>在100 mm组织培养皿中，用8 mL富集培养基（DMEM/F12，含5% FBS和1% P/S）接种起始细胞群体20–25 × 106个细胞，用于差异贴壁。将细胞放入培养箱（37 °C，5% CO2，21% O2）中，1.5小时后确保大多数支持细胞已贴壁。</li>
	<li>收集两个培养皿的上清液（主要含有生殖细胞），合并至一个新的100 mm培养皿中，并放回培养箱。1小时后，再次将两个培养皿的上清液合并至另一个新的100 mm培养皿中，将培养皿放回培养箱过夜。 
	注意：合并的上清液主要含有生殖细胞。随培养皿丢弃的贴壁细胞主要为睾丸体细胞，如支持细胞和管周肌样细胞。</li>
	<li>按以下方式收集富集的生殖细胞，分为两个组分： 
	注意：富集的生殖细胞贴壁能力不同，可分为非贴壁组分和轻微贴壁组分。这两个组分共同构成富集的生殖细胞群体。
	<ol>
		<li>非贴壁组分：收集上清液。</li>
		<li>轻微贴壁组分：用PBS轻轻洗涤培养皿，加入2 mL按1:20稀释的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，室温处理5分钟，用2 mL富集培养基终止反应，并将细胞收集至与非贴壁组分相同的离心管中。 
		注意：需用PBS将0.25%胰蛋白酶-EDTA稀释1:20，以获得工作浓度的胰蛋白酶溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细胞计数仪统计细胞总数，取100 × 103个细胞进行固定，并按照文献12所述方法进行生殖细胞标志物UCHL1的免疫细胞化学染色，以确定该富集细胞群体中生殖细胞的比例。 
	注意：该细胞群体中生殖细胞比例应至少达到60–70%。由于定量所需的免疫细胞化学染色需耗时1天，因此应将富集后的细胞置于超低吸附的100 mm培养皿中，使用添加1% P/S的DMEM/F12培养基维持培养，以确保细胞的最佳状态和活力。</li>
</ol>
4. 接种细胞的准备
<ol>
	<li>为获取起始细胞样本，从超低吸附100 mm培养皿中收集上清液至50 mL离心管中。用PBS剧烈冲洗培养皿以收集贴壁细胞。无需进行酶消化。 
	注意：部分睾丸细胞（主要是支持细胞）可能轻微贴附于超低吸附培养板上。</li>
	<li>将起始细胞样本与富集的生殖细胞混合，获得含25%生殖细胞的工作细胞悬液。在25 °C条件下，以500 x g离心5分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于类器官形成培养基中（DMEM/F12添加胰岛素10 µg/mL、转铁蛋白5.5 µg/mL、硒6.7 ng/mL、表皮生长因子20 ng/mL、1%青霉素-链霉素）。调整细胞密度至2.4 × 106 个/mL。 
	注意：本方案中使用的微孔板每孔含有1,200个微孔13。</li>
	<li>使用以下公式计算每孔所需的细胞数量，如下所述。 
	每孔细胞数 = 微孔数量 × 每个类器官拟聚集的细胞数。</li>
	<li>若要生成每个由1,000个细胞组成的类器官，则每孔接种量为（1,200 × 1,000 =）1.2 × 106 个细胞。调整细胞悬液的密度，使细胞以0.5 mL培养基体积接种。对于每个由1,000个细胞形成的类器官，使用2.4 × 106 个细胞/mL的密度（即0.5 mL中含1.2 × 106 个细胞）。</li>
</ol>
5. 准备受细胞的微孔
注意：为确保细胞不黏附于微孔表面，需使用制造商提供的表面活性剂冲洗溶液进行处理。
<ol>
	<li>向每个孔中加入 0.5 mL 洗涤液。确保孔内无气泡残留。若存在气泡，将板在 25 °C 下以 2,000 x g 离心 2 分钟（使用刹车）以去除气泡。</li>
	<li>在低倍倒置显微镜下观察板，确认微孔中的气泡已被完全去除。若仍观察到有气泡残留，再次在 25 °C 下以 2,000 x g 离心 2 分钟，以去除剩余气泡。</li>
	<li>用盖子盖好板，在室温下孵育 30 分钟。处理完成后，移除洗涤液，并立即用无菌水或 PBS 洗涤板。确保在洗涤液处理后，板内孔洞不发生干燥。</li>
</ol>
6. 睾丸类器官的生成
<ol>
	<li>向每个孔中加入 0.5 mL 器官oid形成培养基（不含任何细胞），在 25 °C 条件下以 2,000 x g 离心 2 分钟（开启刹车），以去除任何被困住的气泡。在低倍倒置显微镜下观察孔内情况，确认气泡已被完全去除。若仍观察到有气泡残留，请再次以 2,000 x g 在 25 °C 条件下离心 2 分钟，以去除剩余气泡。</li>
	<li>加入 0.5 mL 工作细胞悬液，并用移液器轻轻吹打混匀。在 25 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。使用倒置显微镜观察，确认细胞已在微孔中聚集。</li>
	<li>将培养板转移至细胞培养箱中，培养 5 天。每隔一天更换一半培养基。
	<ol>
		<li>为避免丢失任何器官oid，在更换培养基时，将移液器枪头轻触孔壁，缓慢下降至液面弯月面处，然后缓慢吸取培养基。务必随着液面下降同步移动枪头。添加新鲜培养基时，将枪头轻触与吸出培养基同一侧的孔壁，沿孔壁缓慢加入新鲜培养基，使其沿壁缓缓流下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为回收器官oid，使用宽口移液器枪头轻轻吹打培养基上下混合，使器官oid从微孔中释放出来。</li>
	<li>收集器官oid，用 PBS 洗涤，固定后按照文献12所述方法进行免疫细胞化学染色，检测生殖细胞标志物（UCH-L1）、支持细胞标志物（GATA 结合蛋白 4-GATA4）、管周肌样细胞标志物（α-平滑肌肌动蛋白-αSMA）以及 Leydig 细胞标志物（细胞色素 P450-CYP450），并在共聚焦显微镜下观察成像。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+testicular+organoid%3A+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li>
<li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li>
<li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li>
<li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665(2013).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li>
<li>González, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+Mouse+Monopoly%3A+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li>
<li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li>
</ol>

Ungrin 博士作为 AggreWell 技术的发明人，对该技术拥有经济利益。

我们建立了一种简单的方法，能够稳定、可重复地生成大量具有类似于体内睾丸组织结构的睾丸类器官12。尽管该方法最初是利用猪睾丸细胞开发的，但也同样适用于小鼠、非人灵长类动物和人类的睾丸组织12。已有多种不同的方法被报道用于制备睾丸类器官8,9,10,11。Baert 等人通过将成人和青春期前的人类睾丸细胞与来自成人人类睾丸脱细胞后获得的细胞外基质（ECM）共同培养，成功生成了人类睾丸类器官11。尽管该模型未形成明显的睾丸形态结构，但类器官能够分泌睾酮和细胞因子11。Pendergraft 等人报道了另一种人类类器官模型，采用悬滴培养法，利用溶解的睾丸ECM蛋白，所生成的类器官也能够产生睾酮<sup ...

近年来，人们对三维（3D）类器官重新产生了浓厚兴趣。已有研究成功建立了肠道1、胃2、胰腺3,4、肝脏5和脑6等不同器官的三维类器官系统。这些类器官在结构和功能上均与体内真实器官具有相似性，相较于单层细胞培养系统，更适用于组织微环境的生物学研究7。因此，睾丸类器官也逐渐引起关注8,9,10,11,12。目前报道的大多数方法较为复杂，通量低10，且需要添加细胞外基质（ECM）蛋白8,10，这增加了实验的复杂性，也导致可重复性差。因此，亟需一种简单且可重复的方法，以生成细胞相互作用方式类似于体内睾丸的睾丸类器官。
我们最近报道了一种满足这些要求的系统12。以猪为模型，我们在微孔系统中采用了离心力驱动的聚集方法。该微孔系统中，每个孔包含大量相同的微小孔13，从而能够生成大量大小均一的球形结构。该微孔系统可高效生成具有睾丸特异性结构的均一类器官。该系统操作简便，且无需添加细胞外基质蛋白。

<table><tbody><tr><td>100 mm 超低吸附组织培养皿</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>防粘附冲洗液</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>来自溶组织梭菌的 IV 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>简称 Collagenase IV S</td></tr><tr><td>Worthington IV 型胶原酶</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td><td>简称 Collagenase IV W</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 - 高糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>R&amp;D Systems</td><td>#236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>FisherScientific</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>FisherScientific</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#12483-020</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒</td><td>Gibco</td><td>#41400-045</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>猪睾丸组织</td><td>Sunterra Farms Ltd (加拿大阿尔伯塔省)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 无菌离心管顶部滤器装置</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微孔培养法生成具有睾丸特异性结构的猪睾丸类器官

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

类器官是由多种细胞类型组成的三维结构，能够模拟体内器官的组织结构和功能。类器官的形成开辟了基础研究和转化研究的多种途径。近年来，睾丸类器官在男性生殖生物学领域引起了广泛关注。睾丸类器官可用于研究细胞间相互作用、组织发育以及生殖细胞微环境，并有助于高通量的药物筛选和毒性检测。目前亟需一种能够稳定、可重复地生成具有睾丸特异性组织结构的类器官的方法。微孔培养系统包含密集排列的金字塔形微孔阵列。将来自青春期前睾丸的睾丸细胞离心进入这些微孔中进行培养，可形成具有睾丸特异性组织结构和细胞排列的类器官。通过该方法可生成数千个均一的类器官。本文所报道的实验方案将对从事男性生殖研究的科研人员具有广泛的应用价值。

来自1周龄猪睾丸的分离细胞在微孔中培养后可自组织形成球状结构（图1A、图2），具有界限清晰且分隔明显的外部（生精上皮）和内部区域（间质）（图1B、图2）。这两个区域由一层IV型胶原阳性（collagen IV+ve）的基底膜分隔。UCH-L1+ve 生殖细胞和GATA4+ve 支持细胞位于基底膜上的外部区域（图1B、图2）。α-SMA+ve 管周肌样细胞定位于基底膜内侧，而细胞色素P450+ve 间质细胞则位于...

本文介绍了一种利用市售微孔培养系统可重复地生成具有睾丸特异性组织结构的猪睾丸类器官的实验方案。

类器官是由多种细胞类型组成的三维结构，能够重现器官的组织结构和功能……

本方案具有重要意义，因为它能够生成睾丸类器官，可用于研究睾丸形态发生过程，以及进行高通量药物筛选和毒性检测。该技术的主要优势在于其高度可重复，所需细胞数量相对较少，并可用于生成大量具有睾丸特异性结构的睾丸类器官。通过必要的优化，该方法还可应用于研究其他系统，例如多能干细胞或胰岛细胞。本实验睾丸组织的酶消化步骤将由我实验室的博士生 Anna Voigt 演示。将睾丸组织收集至无菌烧杯中，用含 1% 青霉素-链霉素的 PBS 洗涤。洗涤后，将睾丸组织转移至含有 1% 青霉素-链霉素的 PBS 的 100 毫米组织培养皿中。使用已灭菌的剪刀和镊子去除阴囊鞘膜和附睾。将分离出的睾丸转移至新的100毫米培养皿中，并用含有1%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液充分洗涤。沿睾丸鞘膜下方的纵轴方向将睾丸剪开。然后用两把镊子将睾丸从白膜中剥离，放入一个新的100毫米培养皿中，培养皿内含有1毫升添加1%青霉素-链霉素的DMEM。用无菌剪刀将剥离的睾丸剪切成1至2毫米大小的组织块。剪碎后，使用无菌镊子去除结缔组织的白色碎片。将剪碎的组织块转移至50毫升离心管中的A溶液中，并用DMEM补至50毫升，使胶原酶4S的终浓度为0.4毫克/毫升，胶原酶4W的终浓度为0.8毫克/毫升。将含有组织块的离心管置于37摄氏度水浴中孵育30分钟，每5分钟轻轻颠倒混匀一次。30分钟后，将离心管在37摄氏度下以90 × g离心1.5分钟，设置25摄氏度刹车。弃去上清液，加入40毫升溶液B，并用DMEM补至50毫升，得到浓度为1.2毫克/毫升的胶原酶4W溶液。将离心管置于37摄氏度水浴中30分钟，每隔5分钟轻轻倒置混匀一次。在25摄氏度下，以90 × g离心1.5分钟。随后弃去上清液，并用含1%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。小心收集上层的管状结构，转移至新的50毫升离心管中。用 PBS 补充至 50 毫升。在 25 摄氏度下以 90 ×g 离心 1.5 分钟（带刹车）。弃去上清液，并加入新鲜 PBS 再洗涤两次。最后一次 PBS 洗涤后，去除上清液，并将曲细精管重悬于 5 mL PBS 中。然后，向组织中加入 15 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。将离心管置于 37 °C 水浴中，每 2 分钟轻轻颠倒混匀一次。在组织培养板上取10微升样品，于显微镜下观察肾小管消化为单细胞的情况，消化5分钟后进行评估。每隔2分钟将样品置于显微镜下观察一次。若观察到大部分为单细胞，则加入5毫升胎牛血清（FBS）终止反应，随后依次通过70微米和40微米的细胞筛过滤。将单细胞在500 × g、25摄氏度条件下离心5分钟。用50毫升富集培养基重悬，并使用血细胞计数板计数活细胞数量。将2000万个起始细胞群体转移至两个超低吸附的100毫米培养皿中，于37摄氏度、5%二氧化碳和21%氧气的组织培养孵箱中孵育2天。将剩

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利用微孔培养法生成具有睾丸特异性结构的猪睾丸类器官

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