天然聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹分析内源性IRF5二聚化

本方案采用一种广泛应用的技术，结合可商业获取的试剂和工具，用于评估刺激早期内源性IRF5的激活情况。该方法可轻松应用于其他细胞背景下IRF5生物学功能的研究。尽管非变性PAGE是一种常用技术，但要获得清晰、稳定、可解释且可重复的结果在技术上具有挑战性。

使用商用的电泳运行缓冲液和凝胶系统有助于最大限度地减少实验变异性。关注实验细节至关重要，而丰富的经验是获得良好结果的关键。该改良的非变性PAGE实验方案包含多个步骤，其中许多细微之处对实验成功至关重要。

视觉演示可以展示这些对研究人员有益的细节。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，使用完全RPMI 1640培养基在T75培养瓶中维持CAL-1细胞培养。当准备刺激细胞时，将细胞转移至50毫升锥形管中，并在200 × g下离心5分钟。

弃去上清液，用培养基重悬沉淀，以获得均一的单细胞悬液。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以每孔1,000,000个细胞的密度将细胞接种至六孔板中，每孔加入4毫升预热的培养基。将细胞培养20至24小时，使细胞融合度达到90%至95%。次日，通过每孔加入4微升浓度为1毫克/毫升的R848刺激细胞，同时设置对照孔，仅含细胞而不加R848处理。

轻轻左右摇动培养板，使 R848 均匀分散，然后将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 2 至 16 小时。孵育结束后，将细胞悬液从培养板转移至 5 毫升离心管中。在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 毫升 PBS 中。

将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度下以12,000 × g离心30至60秒，然后小心吸去上清液。根据论文所述方法配制裂解缓冲液，并置于冰上预冷备用。用30微升预冷的裂解缓冲液重悬细胞沉淀，上下吹打混匀。

然后将离心管置于冰上孵育15至20分钟。在4°C条件下，以12,000 × g离心15至20分钟，澄清裂解液，并将上清液转移至预冷的1.5毫升离心管中，确保提取物始终置于冰上。随后，使用Bradford试剂测定蛋白质浓度。

根据文稿说明配制上层和下层电泳缓冲液，并用水彻底冲洗一块3-12%的天然PAGE凝胶，注意不要破坏加样孔。操作脱氧胆酸钠时需格外小心。处理该化学品时必须佩戴个人防护装备，如实验服、护目镜和口罩。随后将凝胶安装至Mini Gel Tank中，取出梳子，加入已配制的上层和下层电泳缓冲液，并在4摄氏度的冷室或冰上以150伏电压预电泳30分钟。

同时，在冰上将细胞蛋白与4×天然样品缓冲液混合，以准备上样。预电泳完成后，向每个加样孔中加入10至15微克蛋白，在85伏电压下电泳30分钟，随后在150伏电压下继续电泳2小时。然后将凝胶置于SDS电泳缓冲液中，室温下浸泡30分钟。

将聚偏二氟乙烯膜浸入甲醇中约五分钟以激活。在膜的一角剪去一小角以标记其方向，然后根据制造商说明书组装转膜夹心结构。将转膜夹板放入转膜槽中，在冰上以20伏电压转膜1小时。

然后用塑料镊子从胶片盒中取出膜，并在室温下于封闭缓冲液中于摇床上封闭45分钟。接着，将膜与一抗在4摄氏度孵育过夜，或在室温孵育2小时，随后在摇床上用1×TBST洗涤缓冲液洗涤3分钟。然后，在室温下用1×TBST洗涤缓冲液将膜与二抗再次孵育45分钟，并重复洗涤步骤。

然后使用适当的凝胶成像系统扫描印迹。采用本实验方案，对经R848刺激或未刺激的CAL-1细胞进行免疫印迹分析。在未刺激的CAL-1细胞中，IRF5在非变性PAGE上表现为单一条带，对应其单体形式。

对于刺激后的细胞，IRF5 单体水平降低，而二聚体水平升高。在转染了不同构建体的IRF5过表达293T细胞上，使用抗IRF5抗体进行了免疫印迹实验。未转染的对照组中未检测到IRF5，证明了抗IRF5抗体的特异性。

仅在过表达IRF5的293T细胞中检测到一条对应于IRF5单体的条带。当共转染编码IRF5激活蛋白的质粒时，出现了一条迁移较慢、对应于IRF5二聚体形式的条带。然而，与RIG-I相关的蛋白NMDA5并不能诱导IRF5发生二聚化。

使用 Bis-Tris 梯度凝胶至关重要，这可能是由于该凝胶电泳系统的特定 pH 值和化学组成能够分离 IRF5 的单体和二聚体形式。此外，使用非变性天然样品缓冲液裂解并保存细胞裂解物可保留蛋白质的天然结构。本实验中，我们使用了一种市售的、专为天然 PAGE 酸设计的缓冲液。

另一种与此方法高度互补的技术是利用 ImageStream 成像流式细胞术系统来评估 IRF5 的核转位，这是 IRF5 二聚化后激活过程中的关键事件。与本方案结合使用时，该方法可作为验证 IRF5 激活过程中各步骤的另一种检测手段。作为炎症反应的关键调控因子，IRF5 在感染与免疫、自身免疫性疾病、癌症以及多种影响人类健康的重要疾病中发挥着重要作用。

目前也有致力于开发靶向IRF5及相关转录因子的治疗手段。本方案将帮助不同领域的研究人员理解并深入探究IRF5的生物学特性。