Name: 分析泛性基质和泛性基质样的依从性转化后修饰和重大改变的识别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学习利用慢病毒构建稳定细胞系和双标签纯化技术，分析泛素及类泛素翻译后修饰谱，识别与疾病相关的蛋白质修饰改变，为诊断和预后提供分子靶点。

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本工作由法国抗癌联盟（La Ligue Contre le Cancer）资助HV和MS，由抗癌研究协会（ARC）资助PS，由法国国家癌症研究院（INCa）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸癌症研究中心（Canceropole PACA）资助JI。马赛蛋白质组学质谱平台（marseille-proteomique.univ-amu.fr）得到了IBISA（生物、健康与农学基础设施）、艾克斯-马赛技术平台、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸癌症研究中心（Cancéropôle PACA）、普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区、帕奥利-卡尔梅特研究所（Institut Paoli-Calmettes）以及马赛癌症研究中心（Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille）的支持。

1. 生成稳定表达6His-Flag-Ubl的细胞系
注意：将 pCCL-6HF-Ubl、pVSVG 和 delta-Helper 质粒共同转染至 HEK-293T 细胞中。
<ol>
	<li>第0天：将293T细胞接种于6孔板中，使次日细胞融合度达到50-70%。</li>
	<li>第1天：使用慢病毒生产用的转染试剂和方案，将50-70%融合度的细胞与转染混合物共转染，混合物包含1 µg pCCL-6HF-Ubl或pCCL-GFP、1 µg pVSVG和1 µg delta-Helper载体。转染6小时后，更换为适合待转导细胞的新鲜培养基。将待转导的细胞接种于6孔板中，使次日（开始转导当天）细胞融合度达到10-20%。</li>
	<li>第2天：转染24小时后，收集含有慢病毒颗粒的培养基，并用0.45 µm滤器过滤。如需，此时可加入新鲜培养基以生产第二批慢病毒。将含有慢病毒的培养基替换待转导细胞（10-20%融合度）的原有培养基。 
	注意：慢病毒培养基可在+4 °C保存数天，或在-80 °C长期保存数月。</li>
	<li>将细胞在标准培养箱（37 °C，5% CO2）中与慢病毒共同孵育24至72小时，然后更换为新鲜的标准培养基。若条件允许，使用倒置荧光显微镜观察GFP表达，以评估转导效率：包括表达细胞的百分比及单个细胞的相对表达水平。若未检测到荧光信号，可再等待2-3天，因表达时间可能因待转导细胞类型而延长。</li>
	<li>若GFP对照组结果为阳性，则继续培养所有细胞，直至获得足够数量，用于通过抗Flag抗体进行免疫荧光和Western blot检测6HF-Ubl的表达情况。</li>
</ol>
2. 修饰蛋白的双重纯化
注意：缓冲液 1：6 M 盐酸胍，0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4，pH 8.0，0.5% Triton X-100。 
缓冲液 2：50 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，1% Tween20，5% 甘油，pH 8.0。 
缓冲液 3：100 mM NH4HCO3，pH 8.0。
<ol>
	<li>细胞裂解：准备就绪后，先用磷酸盐缓冲液（PBS）在室温（RT）下至少洗涤培养皿一次，随后进行细胞裂解；或者，也可选择在液氮中快速冷冻2 并储存于 -80 °C在室温下，每15 cm培养皿加入2 mL裂解缓冲液1，用细胞刮刀将所有裂解物收集至50 mL锥形离心管中（终体积约20 mL）。</li>
	<li>将裂解液超声处理三次，每次30秒，每次间隔1分钟。</li>
	<li>将超声处理后的裂解液在15,000 x g下离心 g 15分钟。</li>
	<li>使用细胞滤筛将上清液转移至新管中40 µm).</li>
	<li>确定样品浓度，如有必要，进行调整以获得相同量的蛋白质和相同体积。总蛋白量应控制在50至100 mg之间（适用于MiaPaCa-2细胞的10个直径15 cm的培养皿）。</li>
	<li>加入 Ni2+-NTA 磁珠，使用 2 µL 每毫克蛋白质对应的珠子数量。</li>
	<li>室温下以 30 rpm 转速旋转 2.5 小时。</li>
	<li>500 x g 离心使珠粒沉淀 g 5 分钟。</li>
	<li>用1 mL缓冲液1洗涤磁珠，将样品转移至1.5 mL微量离心管中，然后将管子置于冰上。后续所有步骤均在冰上或4 °C条件下进行。 4 °C.</li>
	<li>用含有 10 mM 咪唑的 1 mL 冰冷缓冲液 2 洗涤两次。</li>
	<li>为洗脱结合的蛋白质，加入 600 µL 含250 mM咪唑的缓冲液2，旋转孵育2小时 4 °C.</li>
	<li>通过离心沉淀珠子，离心条件为 500 x g 1 分钟。将上清液转移至新的预冷 1.5 mL 离心管中，并加入 50 µL 抗Flag M2抗体偶联微珠</li>
	<li>以 30 rpm 转速旋转 2.5 h，温度为 4 °C，然后用 500 µL 缓冲液2，然后用2次 500 µL 缓冲液3</li>
	<li>对于最终洗脱，加入 100 µL 含 Flag 肽的缓冲液 3 0.1 µg/µL 并旋转 4 °C 1.5 小时。</li>
	<li>以 500 x 离心 g 孵育1分钟，然后将上清液转移至新的预冷离心管中。</li>
	<li>取10%（10 µL) 上样至SDS-PAGE并进行银染以检测纯化质量。若纯化效果良好，则对剩余的90%样品进行LC-MS/MS分析。</li>
</ol>
3. 处理质谱数据以生成泛素/类泛素蛋白修饰谱，并鉴定它们之间的显著差异
注意：质谱分析结果包含多种信息，包括每份样品中鉴定出的蛋白质所对应的肽段总数以及每种蛋白质的峰面积值（每个蛋白质前3个肽段面积的平均值10）。这些数据可采用肽段计数、峰面积值或两者结合的方式进行处理。在使用峰面积进行计算时，由于这些数值通常在106数量级，因此在应用以下公式之前，需先将其除以该数量级。两种计数方法所得结果通常应呈现高度相关性。针对每个鉴定出的蛋白质，使用以下公式，其中： 
v1 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="静力平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；带矢量箭头的受力分析。" data-altupdatedat="1788282455000"> 未处理泛素样品中的肽段数值（例如，Ub - 药物） 
v2 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="静力平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；带矢量箭头的受力分析。" data-altupdatedat="1788282455000"> 吉西他滨处理的泛素样品中的肽段数值（例如，Ub + 药物） 
k1 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="静力平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；带矢量箭头的受力分析。" data-altupdatedat="1788282455000"> 未处理对照GFP样品中的肽段数值（例如，GFP - 药物） 
k2 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="静力平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；带矢量箭头的受力分析。" data-altupdatedat="1788282455000"> 吉西他滨处理的对照GFP样品中的肽段数值（例如，GFP + 药物）。
<ol>
	<li>归一化：使用以下公式对经药物处理细胞与未处理细胞的泛素（Ubiquitin）和绿色荧光蛋白（GFP）数值进行归一化。归一化后的 v = V，归一化后的 k = K。 
	V1 = v1 × (∑v1 + ∑v2) / (2 × ∑v1)；V2 = v2 × (∑v1 + ∑v2) / (2 × ∑v2) 
	K1 = k1·(∑k1 + ∑k2) / (2·∑k1)；K2 = k2·(∑k1 + ∑k2) / (2·∑k2)</li>
	<li>背景去除：使用以下公式，从泛素样本的数值中减去对照样本（GFP）的数值，得到两种条件下每种鉴定蛋白的特异性数值（V'1 和 V'2）。 
	V'1 = V1 - K1，如果 V1 - K1 ≥ 0；V'1 = 0，如果 V1 - K1 < 0&lt;0 
	V'2 = V2 - K2 当 V2 - K2 ≥ 0；V'2 = 0 当 V2 - K2 < 0&lt;0</li>
	<li>泛素化修饰的变异度（Var）。为获得药物诱导的翻译后修饰（PTMs）正向与负向变异的评分（介于 -100 至 +100 之间），使用以下公式：将处理组与未处理组样本的特定数值之差除以所有数值的总和（包括对照组中的数值，以对在对照组GFP中同样被鉴定出的蛋白质进行惩罚），再乘以100。 
	Var = (V'2 - V'1) / (V1 + K1 + V2 + K2) × 100；-100&lt;变量&lt;100 ; 
	低于 -50（PTM 抑制）或高于 50（PTM 诱导）的变化通常被视为具有显著性。</li>
	<li>置信度（Conf）。使用以下公式计算 0 到 100% 之间的置信度值： 
	Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ；若为0则 &lt;0 
	50 以上的数值通常被视为具有可信度。</li>
	<li>为了获得更理想的诱导/抑制值分布，并同时考虑变异性和置信度参数，使用以下公式对 Var 和 Conf 值进行乘法运算，其中 V <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="静力平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；用矢量箭头进行受力分析。" data-altupdatedat="1788282455000"> Var 和 C <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg" alt="静力平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；用矢量箭头进行受力分析。" data-altupdatedat="1788282455000"> 会议 
	=SI(V2&gt;0;((V2*C2)^2)/(10^6);-((V2*C2)^2)/(10^6) 
	注意：由于峰面积值通常比肽段计数更准确，因此可以使用专门用于解读此类数据的特定软件，例如 Perseus（https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus），并遵循其使用建议。</li>
</ol>

<ol><li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification%3A+Nature%27s+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li>
<li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li>
<li>Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li>
<li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li>
<li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li>
<li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE%3A+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已开发出一种稳健且可靠的方法，用于生成由泛素家族主要成员修饰的蛋白质谱型。事实上，我们已成功应用该方案生成了泛素、SUMO和Nedd8介导的翻译后修饰谱型，并检测了与治疗相关的改变7，以及在特定基因过表达或敲低（数据未显示）情况下，或在获得对多种化疗药物耐药表型的细胞中所发生的修饰变化。
在实验过程中，操作者需特别注意的步骤并不多。在吸取珠子（Ni-NTA 或抗 Flag 偶联珠）时，必须充分重悬珠子，尤其是抗 Flag 珠子，因其悬浮于黏稠的甘油缓冲液中；同时应剪去吸头末端一小段以增大孔径。另一个注意事项是应缓慢移液，以避免珠子堆积。其他关键步骤包括使用咪唑和 Flag 肽进行洗脱。洗脱后，必须使用洁净的汉密尔顿注射器收集上清液，以尽可能避免吸到仍结合有非特异性蛋白的珠子。
根据细胞类型和质谱分析所需的最终材料量，可相应增加或减少起始材料的用量。此时唯一需要调整的是镍珠的体积，应按照每1 mg裂解液蛋白使用2 µL镍珠的比例进行。有时纯化得到的蛋白量可能过低，此时应检测带标...

本文提出的方法旨在研究培养的哺乳动物细胞中由泛素家族成员介导的蛋白质翻译后修饰（PTMs），以鉴定与特定条件（如处理、分化等）相关的潜在改变。PTMs是蛋白质功能调控的最终步骤1。事实上，一旦通过翻译机制生成，大多数甚至所有蛋白质都会经历不同类型的PTMs，这些修饰可调节其活性、分子相互作用以及细胞内定位1。在众多PTMs中，由泛素蛋白家族介导的修饰尤为关键，包括泛素本身及所有类泛素蛋白，它们具有调控所有细胞内或部分胞质蛋白的潜力2。由于这些分子本身也是蛋白质，它们可以彼此共价连接，形成具有不同拓扑结构的同源或异源链，每种结构均与特定的调控功能相关联2。因此，亟需开发工具来解析并理解这一复杂的调控系统。目前全球已发展出多种方法，各有优缺点，本文所提出的方法性能优越，适用于培养细胞体系。
该方法的主要优势在于其准确性。事实上，通过联合使用两种标签（6His 和 Flag）以及两步纯化流程，分离得到的修饰蛋白纯度显著提高，因此比单一标签融合Ub/Ubl3,4更具选择性。6His标签的存在使得可在完全变性条件下进行第一步纯化，从而避免了含有泛素结合结构域的蛋白或其他与泛素化蛋白结合的蛋白共纯化。这是目前基于亲和纯化泛素化蛋白质组的多种方法所面临的技术难题，例如使用特异性抗体5或串联泛素结合元件（TUBEs）6的方法。重要的是，该技术不会偏向于某一种特定类型泛素化的纯化，而某些其他方法可能存在此类偏倚，因为该方法已成功鉴定出单泛素化及多种不同类型的多泛素化修饰7。因此，一旦发现泛素化发生改变，还需通过标准的生物化学方法对其进行更深入的研究，以确定所涉及的泛素化具体类型。
最后，本方案的另一项技术优势在于使用慢病毒，可快速、高效地建立稳定表达细胞系，使带标签的修饰因子以合理水平表达，同时不干扰细胞的正常生物学行为。
泛素化的一个重要功能是靶向蛋白质以进行蛋白酶体降解，但目前已知它还具有多种其他调控功能，可能影响大多数细胞内或部分细胞内的蛋白质1。由于存在多种泛素样蛋白，这一功能家族进一步扩大，这些蛋白共同构成一个几乎调控所有细胞机制的蛋白家族1。这些蛋白的异常改变可能对细胞生物学产生严重影响，并可能导致或参与病理状态8，例如癌症9。因此，需要开发相关工具来探索这一广阔领域，识别与病理状态相关的改变，从而为发现新的治疗靶点提供依据。
本方案专用于培养细胞，因为需要对这些细胞进行转导以表达外源性带标签的泛素（Ub）或类泛素蛋白（Ubl）。一旦构建成功，这些稳定细胞系可用于从二维或三维培养体系或异种移植模型中获取Ubl修饰谱，从而拓展可用于研究蛋白质翻译后修饰谱的不同实验模型范围。

<table><tbody><tr><td>ANTI-FLAG M2 亲和凝胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220-5ML</td><td>可结合所有 Flag 标签蛋白</td></tr><tr><td>抗 Flag M2 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td>用于检测 6His-Flag 标签的泛素/泛素样蛋白表达</td></tr><tr><td>细胞筛网 40 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>用于从盐酸胍裂解的细胞中去除漂浮的沉淀物</td></tr><tr><td>Flag 肽段</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3290</td><td>从抗 Flag 珠粒中洗脱 Flag 标签蛋白</td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td>变性剂，用于使细胞裂解液中的所有蛋白质变性</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td>从 Ni-NTA 珠粒中洗脱 6His 结合蛋白</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td>用于转染 HEK-293T 细胞以产生慢病毒</td></tr><tr><td>低吸附管（Lobind 管）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666491</td><td>避免珍贵样品的吸附损失</td></tr><tr><td>膜滤器，0.45 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700F1</td><td>用于过滤慢病毒上清液</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>用于纯化 6His 标签蛋白</td></tr></tbody></table>

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

泛素（ub）和泛素样蛋白（ubl）介导的蛋白质翻译后修饰通过调控蛋白质的稳定性、活性、相互作用以及细胞内定位，在细胞内发挥重要的生物学调控作用。这些修饰使细胞能够响应信号并适应环境变化。这些机制的异常可导致严重的病理状况，例如神经退行性疾病和癌症。本文所述技术的目的是从培养的细胞系中快速、准确地建立依赖于泛素/泛素样蛋白的翻译后修饰谱。通过比较不同条件下获得的修饰谱，可以鉴定出特定的改变，例如由某种处理所诱导的变化。采用慢病毒介导的细胞转导方法，构建稳定表达双标签（6His 和 Flag）修饰蛋白（如泛素或 SUMO1、Nedd8 等泛素样蛋白）的细胞系。这些标签可用于从细胞中纯化泛素及其修饰的蛋白质。纯化过程分为两步：第一步利用 6His 标签在变性条件下进行，第二步利用 Flag 标签在天然条件下进行。该方法可实现对修饰蛋白的高度特异性和高纯度分离，随后通过液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）对这些蛋白进行鉴定和半定量分析。使用 Excel 软件对质谱数据进行简便的生物信息学分析，可通过去除背景信号建立翻译后修饰谱。通过比较不同条件下的修饰谱，识别出特异性改变，并进一步采用常规生物化学技术对其进行验证和深入研究。

转导培养的哺乳动物细胞以构建表达 GFP 和 6HF-Ub 的细胞 
为制备后续用于转导 MiaPaCa-2 细胞的慢病毒，将 70% 汇合度的 HEK-293T 细胞与等量的三种质粒共转染，即 pCCL-6HF-Ubiquitin 或 GFP/Delta-Helper/pvSvG。慢病毒产生 24 小时后，收集含病毒颗粒的培养基并进行过滤。此时可通过倒置显微镜观察表达 GFP 的 293T 细胞的绿色荧光，以检测转染效率，荧光阳性细胞比例应接近 100%。将 MiaPaCa-2 细胞与慢病毒上清共孵育 1 至 3 天。首先通过观察 GFP 转导细胞的 GFP 荧光来检测慢病毒转导效率（图 1A 上图）。GFP 表达水平在不同细胞间可能有所差异，但所有细胞均应呈现荧光。完成该检测后，还需检测 Flag-泛素的表达情况，可通过使用抗 Flag 抗体（通常为 M2 单克隆抗体）进行免疫荧光染色来实现（图...

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。

泛素（ub）和泛素样蛋白（ubl）依赖的蛋白质翻译后修饰在……中发挥重要的生物学调控作用

该方案通过鉴定和半定量特定的已识别蛋白质，简便地生成泛素及泛素样蛋白翻译后修饰的谱型。该技术的主要优势在于利用慢病毒在一周内建立稳定表达的细胞系，并使用双标签特异性纯化蛋白质。事实上，这类翻译后修饰参与了绝大多数生物学功能，且该机制的异常在大多数疾病中均有发现。因此，识别这些改变可作为预后和/或诊断标志，当然也可作为分子靶点。泛素是真核细胞中最为保守的蛋白质之一，对细胞的存活至关重要。因此，这类方法可应用于从哺乳动物到酵母的任何真核生物模型。然而，我们的慢病毒系统仅限于细胞研究。由于整个实验流程较长，有时需要长时间孵育，因此可以将实验分为两天完成，而不是在一天内完成。镍珠洗脱液可在加入Flag珠之前于-20°C保存。本方案包含多个步骤，其中某些步骤对于确保纯化最终成功以及准确建立翻译后修饰谱至关重要。实验操作将由本实验室的两名博士生 Mirna Swayden 和 Aurelie Dobric 演示。首先，在六孔板中每孔加入 0.5 × 10⁶ 个 HEK 293T 细胞，每孔加入 2 毫升含 10% FBS 的 DMEM 培养基进行接种，并在 37 °C、5% CO₂ 和 100% 湿度条件下培养。次日，细胞融合度达到50%至70%。使用慢病毒生产用的转染试剂和方案，将细胞与以下混合物共转染：1微克pCCL-6HF泛素样蛋白质粒或pCCL-GFP质粒、1微克PBS VG质粒以及1微克delta辅助载体质粒。转染6小时后，更换为适用于待转导细胞的新鲜培养基。将待转导的细胞以标准培养基接种于六孔板中，使次日细胞汇合度达到10%至20%。转染24小时后，收集含有慢病毒颗粒的培养基，并使用0.45微米滤器过滤。用含有慢病毒的过滤培养基替换待转导细胞的原有培养基。将细胞与慢病毒在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育24至72小时，然后更换为新鲜的标准培养基。使用倒置荧光显微镜检测GFP表达，以评估转导效率。若未检测到荧光信号，可再等待额外两到三天。如果GFP对照组显示出绿色荧光且结果为阳性，则继续培养所有细胞，直至获得足够数量，以进行6-His-FLAG泛素样蛋白的表达对照检测，检测方法包括免疫荧光（如图所示）以及使用抗FLAG抗体的蛋白质印迹（western blot）。当细胞在直径15厘米的培养皿中生长至所需量后，用室温的磷酸盐缓冲液至少清洗培养皿一次。开始细胞裂解时，向每个直径15厘米的培养皿中加入2毫升缓冲液一，室温下进行。使用细胞刮刀将所有裂解液收集至50毫升锥形离心管中。对裂解液进行超声处理，每次30秒，共三次，每次间隔一分钟。将超声处理后的裂解液在15,000 × g离心15分钟。通过40微米细胞滤筛将上清液转移至新离心管中。在超声处理和离心后过滤裂解液非常重要。若不进行此步骤，可能导致大量非特异性蛋白共纯化，从而增加背景信号并显著减小翻译后修饰谱的规模。将50至100毫克等量的蛋白质转移至新的Falcon管中。每毫克蛋白质加入2微升镍离子NTA磁珠，加入各管中。将各管置于旋转仪上，于室温下以30 rpm转速旋转2.5小时。然后在500 × g离心5分钟，使磁珠沉淀。用1毫升缓冲液一洗涤磁珠，并将样品转移至1.5毫升微量离心管中。将试管置于冰上。用1毫升含10毫摩尔咪唑的预冷缓冲液2洗涤两次。为洗脱结合的蛋白质，加入600微升含250毫摩尔咪唑的缓冲液2，在4摄氏度下旋转孵育2小时。在500 × g离心1分钟使磁珠沉淀后，将上清液转移至新的预冷1.5毫升离心管中，并加入50微升与抗FLAG M2抗体偶联的磁珠。在 4 摄氏度下以 30 rpm 转速旋转 2.5 小时。然后用 500 微升缓冲液二洗涤两次，再用 500 微升缓冲液三洗涤两次。最后洗脱时，加入含 FLAG 肽（浓度为 0.01 微克/微升）的 100 微升缓冲液三，在 4 摄氏度下旋转 1.5 小时。在500 × g条件下离心1分钟后，将上清液转移至新的预冷离心管中。取10 µL用于SDS-PAGE电泳，并对凝胶进行银染，以检测纯化质量。若纯化效果良好，则对剩余的90%样品进行LC-MS分析。为了进行归一化处理，使用公式对药物处理组细胞与未处理组细胞的泛素化和GFP信号值进行归一化。为消除背景干扰，从泛素化样本的数值中减去对照样本GFP的数值，从而获得两种条件下每种鉴定蛋白的特异性数值。为了获得泛素化修饰的变化程度，计算一个介于-100到+100之间的评分，用于表示药物诱导的蛋白质翻译后修饰（PTMs）的正向或负向变化。将处理组与未处理组样本的特定数值之差除以所有数值的总和（包括对照组的数值），再乘以100。变化值低于-50（表示PTM被抑制）或高于50（表示PTM被诱导）被视为具有显著性。使用此公式可获得0%至100%之间的置信值，通常认为高于50的值具有较高可信度。为了获得更理想的诱导与抑制值分布，并同时考虑变异性和置信度参数，可使用此公式将方差与置信度值相乘。在本研究中，通过转导培养的哺乳动物细胞，构建了表达GFP和6-组氨酸FLAG泛素的细胞。首先通过观察GFP转导细胞的GFP荧光来检测慢病毒转导的效率。通过使用抗FLAG抗体进行免疫荧光染色来检测FLAG-泛素的表达，以显示转导细胞的百分比。为了控制外源性FLAG-泛素的表达水平，对转导细胞的裂解液进行SDS-PAGE电泳，随后用抗FLAG抗体进行蛋白质印迹分析。在纯化泛素化蛋白后，取最终洗脱液的10%用于通过SDS-PAGE及银染检测纯化材料的量和完整性。通过减去背景GFP样本，鉴定出364种显著发生泛素化修饰的蛋白质，其评分高于50%。对这些泛素化蛋白进行基因集富集分析，以揭示其参与的生物学过程。吉西他滨诱导的泛素化改变可能形成的潜在相互作用网络。这有助于鉴定出受相关蛋白泛素化水平升高或降低显著影响的功能性相互作用网络。还证实了吉西他滨处理后PCNA的泛素化增加。在两次洗脱步骤后，必须避免某些微珠的转移，因为这可能导致背景信号显著升高。该实验流程将产生特异的翻译后修饰，通过比较不同条件，可鉴定出特异的修饰改变。下一步将是基于生物化学方法验证至少是感兴趣的那些改变。我们开发了这一方法，用于探索泛素相关的翻译后修饰，以期发现胰腺癌细胞的新途径和新机制。由于本方案以及全球开发的其他类似方案已成功用于解析不同的生物学过程。慢病毒至少必须在生物安全二级实验室中使用。胍是一种强效变性剂，必须小心使用。超声破碎仪也可能对听力造成损害，必须按照推荐方法操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

分析泛性基质和泛性基质样的依从性转化后修饰和重大改变的识别

泛素化是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰过程。参与该修饰过程的基因突变与多种人类疾病相关。本文中，我们描述了在培养细胞中进行体内（in vivo）以及在试管中进行体外（in...

蛋白质泛素化检测

本方案详细描述了一种用于检测功能同源去泛素化酶活性的方法。特异性探针可共价修饰该酶，从而实现检测。该方法有望用于发现新的治疗靶点。...

细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

针对目标蛋白的多种内源性翻译后修饰进行研究可能极具挑战性。本文所述技术采用优化的裂解缓冲液和滤膜系统，并结合特异性靶向特定翻译后修饰的亲和基质，利用单一、简化的系统即可检测目标蛋白的乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化修饰。...

利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

泛素化是一种翻译后修饰，在细胞过程中发挥重要作用，并受到去泛素化的严密调控。这两种反应的异常与人类疾病密切相关。我们提供了使用纯化组分在体外进行泛素化和去泛素化反应的实验方案。...

体外核小体组蛋白泛素化与去泛素化实验

该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。...

泛素链的平行反应监测分析

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。...

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。...

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

本实验采用分子对接结合探针技术的方法，预测并验证中药小分子与蛋白质靶标之间的相互作用。...

基于分子对接与去泛素化酶探针技术筛选抑制UCHL3活性的中药化合物

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。...

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

学习利用慢病毒构建稳定细胞系和双标签纯化技术，分析泛素及类泛素翻译后修饰谱，识别与疾病相关的蛋白质修饰改变，为诊断和预后提供分子靶点。

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

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