泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

该方案通过鉴定和半定量特定的已识别蛋白质，简便地生成泛素及泛素样蛋白翻译后修饰的谱型。该技术的主要优势在于利用慢病毒在一周内建立稳定表达的细胞系，并使用双标签特异性纯化蛋白质。事实上，这类翻译后修饰参与了绝大多数生物学功能，且该机制的异常在大多数疾病中均有发现。

因此，识别这些改变可作为预后和/或诊断标志，当然也可作为分子靶点。泛素是真核细胞中最为保守的蛋白质之一，对细胞的存活至关重要。因此，这类方法可应用于从哺乳动物到酵母的任何真核生物模型。

然而，我们的慢病毒系统仅限于细胞研究。由于整个实验流程较长，有时需要长时间孵育，因此可以将实验分为两天完成，而不是在一天内完成。镍珠洗脱液可在加入Flag珠之前于-20°C保存。

本方案包含多个步骤，其中某些步骤对于确保纯化最终成功以及准确建立翻译后修饰谱至关重要。实验操作将由本实验室的两名博士生 Mirna Swayden 和 Aurelie Dobric 演示。首先，在六孔板中每孔加入 0.5 × 10⁶ 个 HEK 293T 细胞，每孔加入 2 毫升含 10% FBS 的 DMEM 培养基进行接种，并在 37 °C、5% CO₂ 和 100% 湿度条件下培养。

次日，细胞融合度达到50%至70%。使用慢病毒生产用的转染试剂和方案，将细胞与以下混合物共转染：1微克pCCL-6HF泛素样蛋白质粒或pCCL-GFP质粒、1微克PBS VG质粒以及1微克delta辅助载体质粒。转染6小时后，更换为适用于待转导细胞的新鲜培养基。

将待转导的细胞以标准培养基接种于六孔板中，使次日细胞汇合度达到10%至20%。转染24小时后，收集含有慢病毒颗粒的培养基，并使用0.45微米滤器过滤。用含有慢病毒的过滤培养基替换待转导细胞的原有培养基。

将细胞与慢病毒在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育24至72小时，然后更换为新鲜的标准培养基。使用倒置荧光显微镜检测GFP表达，以评估转导效率。若未检测到荧光信号，可再等待额外两到三天。

如果GFP对照组显示出绿色荧光且结果为阳性，则继续培养所有细胞，直至获得足够数量，以进行6-His-FLAG泛素样蛋白的表达对照检测，检测方法包括免疫荧光（如图所示）以及使用抗FLAG抗体的蛋白质印迹（western blot）。当细胞在直径15厘米的培养皿中生长至所需量后，用室温的磷酸盐缓冲液至少清洗培养皿一次。开始细胞裂解时，向每个直径15厘米的培养皿中加入2毫升缓冲液一，室温下进行。

使用细胞刮刀将所有裂解液收集至50毫升锥形离心管中。对裂解液进行超声处理，每次30秒，共三次，每次间隔一分钟。将超声处理后的裂解液在15,000 × g离心15分钟。

通过40微米细胞滤筛将上清液转移至新离心管中。在超声处理和离心后过滤裂解液非常重要。若不进行此步骤，可能导致大量非特异性蛋白共纯化，从而增加背景信号并显著减小翻译后修饰谱的规模。

将50至100毫克等量的蛋白质转移至新的Falcon管中。每毫克蛋白质加入2微升镍离子NTA磁珠，加入各管中。将各管置于旋转仪上，于室温下以30 rpm转速旋转2.5小时。

然后在500 × g离心5分钟，使磁珠沉淀。用1毫升缓冲液一洗涤磁珠，并将样品转移至1.5毫升微量离心管中。将试管置于冰上。

用1毫升含10毫摩尔咪唑的预冷缓冲液2洗涤两次。为洗脱结合的蛋白质，加入600微升含250毫摩尔咪唑的缓冲液2，在4摄氏度下旋转孵育2小时。在500 × g离心1分钟使磁珠沉淀后，将上清液转移至新的预冷1.5毫升离心管中，并加入50微升与抗FLAG M2抗体偶联的磁珠。

在 4 摄氏度下以 30 rpm 转速旋转 2.5 小时。然后用 500 微升缓冲液二洗涤两次，再用 500 微升缓冲液三洗涤两次。最后洗脱时，加入含 FLAG 肽（浓度为 0.01 微克/微升）的 100 微升缓冲液三，在 4 摄氏度下旋转 1.5 小时。

在500 × g条件下离心1分钟后，将上清液转移至新的预冷离心管中。取10 µL用于SDS-PAGE电泳，并对凝胶进行银染，以检测纯化质量。若纯化效果良好，则对剩余的90%样品进行LC-MS分析。

为了进行归一化处理，使用公式对药物处理组细胞与未处理组细胞的泛素化和GFP信号值进行归一化。为消除背景干扰，从泛素化样本的数值中减去对照样本GFP的数值，从而获得两种条件下每种鉴定蛋白的特异性数值。为了获得泛素化修饰的变化程度，计算一个介于-100到+100之间的评分，用于表示药物诱导的蛋白质翻译后修饰（PTMs）的正向或负向变化。

将处理组与未处理组样本的特定数值之差除以所有数值的总和（包括对照组的数值），再乘以100。变化值低于-50（表示PTM被抑制）或高于50（表示PTM被诱导）被视为具有显著性。使用此公式可获得0%至100%之间的置信值，通常认为高于50的值具有较高可信度。

为了获得更理想的诱导与抑制值分布，并同时考虑变异性和置信度参数，可使用此公式将方差与置信度值相乘。在本研究中，通过转导培养的哺乳动物细胞，构建了表达GFP和6-组氨酸FLAG泛素的细胞。首先通过观察GFP转导细胞的GFP荧光来检测慢病毒转导的效率。

通过使用抗FLAG抗体进行免疫荧光染色来检测FLAG-泛素的表达，以显示转导细胞的百分比。为了控制外源性FLAG-泛素的表达水平，对转导细胞的裂解液进行SDS-PAGE电泳，随后用抗FLAG抗体进行蛋白质印迹分析。在纯化泛素化蛋白后，取最终洗脱液的10%用于通过SDS-PAGE及银染检测纯化材料的量和完整性。

通过减去背景GFP样本，鉴定出364种显著发生泛素化修饰的蛋白质，其评分高于50%。对这些泛素化蛋白进行基因集富集分析，以揭示其参与的生物学过程。吉西他滨诱导的泛素化改变可能形成的潜在相互作用网络。这有助于鉴定出受相关蛋白泛素化水平升高或降低显著影响的功能性相互作用网络。

还证实了吉西他滨处理后PCNA的泛素化增加。在两次洗脱步骤后，必须避免某些微珠的转移，因为这可能导致背景信号显著升高。该实验流程将产生特异的翻译后修饰，通过比较不同条件，可鉴定出特异的修饰改变。

下一步将是基于生物化学方法验证至少是感兴趣的那些改变。我们开发了这一方法，用于探索泛素相关的翻译后修饰，以期发现胰腺癌细胞的新途径和新机制。由于本方案以及全球开发的其他类似方案已成功用于解析不同的生物学过程。

慢病毒至少必须在生物安全二级实验室中使用。胍是一种强效变性剂，必须小心使用。超声破碎仪也可能对听力造成损害，必须按照推荐方法操作。