在Vitro重建空间细胞接触模式与孤立的Caenorhabditis elegans胚胎冲击器和粘性聚苯乙烯珠
2019年11月26日
多细胞系统的组织复杂性混淆了细胞外线索与单个细胞行为之间的因果关系的识别。在这里，我们提出了一种方法，研究接触依赖线索和分裂轴之间的直接联系使用C.elegans胚胎胚芽和粘合聚苯乙烯珠子。
多细胞组织复杂，此协议以简化的方式重组细胞行为。有一件事是这种技术来研究细胞导体质子和细胞反应之间的直接关系。该协议使用化学功能聚苯乙烯珠子来重组细胞导体质子。
珠子可以与任何感兴趣的质子切割，以测试它们对细胞反应的影响。我们在小鼠胚胎上的C-优雅中使用过这种方法。因此，该协议可以直立于对广泛生物的研究。
由于胚胎在高全氯处理后很脆弱，因此在成功分离异丙酮之前，需要大量实践。视觉演示将加深对在风波分离方法期间如何处理毛细管的理解。首先，在1.5毫升微型离心管中，重达10毫升的碳氧酸酯改性聚苯乙烯珠。
将一毫升 MES 缓冲液加入管中进行清洗。旋转管混合珠子。通过台式离心机在 2000XG 下旋转管 60 秒。
通过小心地移出缓冲液，将上看液去掉。用一毫升的 MES 缓冲液再次清洗珠子。洗涤后，将含有10毫升EDAC的1毫升 MES 缓冲液加入管中，激活表面的箱状组。
旋转管混合珠子。在室温下旋转并孵育管子15分钟。在 2000XG 下旋转珠子 60 秒。
通过小心地将缓冲液点出，用一毫升 PBS 清洗，丢弃上流水线。漩涡管混合珠子，重复PBS洗涤一次。从 0.65 毫升罗达明红-X 库存溶液中准备一毫升的一升、10、100 和千倍稀释系列的罗达明红-X。
皮佩特20微升珠到每个串行稀释管。在室温下旋转并孵育管子五分钟。用一毫升 PBS 清洗珠子两次。
洗涤后，将一毫升PBS加入管子，并在4摄氏度下储存长达六周。在用于实时成像的显微镜下检查珠子的荧光强度。用右手和左手将微型毛细管的每一端握住，容量为 10 微升。
将微毛细管拉向两端，以施加张力，并将毛细管的中心放在燃烧器上，使两个手动拉毛细管。在解剖显微镜下，用钳子修剪手拉毛细管的尖端。使两个尖端开口大小大约两倍，并分别是用于胚胎移植和蛋壳去除的C-优雅胚胎的短访问长度的一倍。
将拉扯的毛细管连接到口蹄疫装置中。Pippette 45 微升蛋盐溶液放到多井滑梯的井上。将5至10名成人C-优雅放在井上。
为了获得早期的C-优雅胚胎，通过将两根针定位到C-Elegance身体的左右两根针，然后互相滑动针头，将成人切成碎片。皮佩特45微升次氯酸盐溶液到井旁边的井含有蛋盐溶液和皮佩特45微升谢尔顿的生长介质到随后的三口井。将一个细胞阶段和早期两个细胞阶段胚胎转移到次氯酸盐溶液中，用较大的开口，等待40至55秒。
用谢尔顿的生长介质将胚胎移植到接下来的三口井中，以清洗胚胎。前两口井各有一到两秒。使用手绘毛细管与较小的开口仔细重复管道胚胎的蛋壳去除。
之后，用手绘毛细管连续分离双细胞阶段胚胎胚胎。去除蛋壳后，尽量减少上下对胚胎进行管道的力，以防止破裂。通过将盖玻片放在盖玻片支架上，并胶带固定盖玻片的边缘来稳定其，来准备成像室。
翻转盖玻片支架，用疏水笔在盖玻片上画一个圆圈。在疏水标记绘制的圆内添加 Shelton 的生长介质，并将隔离的爆炸体转移到圆内的成像室。现在，使用具有较大开口的手绘毛细管将少量化学功能化珠子分配到盖玻片上。
通过吹入手绘毛细管，直到珠子附着在孤立的气管上，控制珠子的位置。安装盖玻片，以避免介质蒸发，并使用倒置显微镜进行实时成像。在这项研究中，用0.005微克处理的珠子的荧光信号，用于表达GP miosin-2和M-cherihistone的转基因菌株。
另一方面，从珠子处理五微克每毫升罗达明红-X苏西尼米基酯的荧光信号太强。罗达明红-X苏西尼米基酯的浓度为0.5微克每毫升是最佳的这种特殊的转基因菌株。在实时成像过程中，识别到两个中心垂直对齐的平面。
此平面的正负 90 度角的平面是主轴平面。细胞因子后相对于细胞/珠接触界面的主轴方向角度显示，两个子细胞在通过两个接触眼的线中连接到珠子，用作接触方向。人们需要了解胚胎和蛋壳对嘴嘴皮盘施加的某些外力的反应。
从理论上讲，任何细胞反应都可以研究，例如，硫酸盐规格可以通过培养细胞和接触胶粘珠长期研究。此技术已用于了解接触依赖细胞分裂方向机制。PTF过滤器用于防止通过口蹄疫吸入次氯酸盐溶液的烟雾。
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概述
本研究提出了一种方法，用于研究接触依赖性线索与细胞行为之间的直接联系，使用秀丽隐杆线虫胚胎分裂细胞和粘附性聚苯珠。该协议简化了多细胞系统的复杂性，以更好地理解细胞对细胞外信号的响应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 多细胞组织表现出复杂的相互作用。
- 理解细胞响应对发育生物学至关重要。
- 接触依赖性线索在细胞行为中起着重要作用。
- 重建细胞行为可以帮助研究这些相互作用。
研究目的
- 建立一种研究细胞对细胞外线索响应的方法。
- 利用聚苯珠重建细胞环境。
- 将此方法应用于秀丽隐杆线虫胚胎，以获得更广泛的生物学见解。
使用的方法
- 使用化学功能化的聚苯珠。
- 以简化方式重建细胞行为。
- 将该方法应用于秀丽隐杆线虫胚胎。
- 测试各种线索对细胞响应的影响。
主要结果
- 证明了接触线索与细胞行为之间的直接关系。
- 验证了聚苯珠在研究细胞响应中的使用。
- 提供了适用于一系列生物体的见解。
- 促进了对多细胞相互作用的更好理解。
结论
- 该方法有效地将细胞外线索与细胞行为联系起来。
- 聚苯珠是这类研究的多功能工具。
- 这种方法可以增强发育和细胞生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct interrogation of contact-dependent signaling in a controlled in vitro system, reducing confounding variables from multicellular complexity. By isolating blastomeres and using adhesive beads to define precise spatial contact patterns, researchers can establish causal links between extracellular cues and cellular responses such as division orientation. This supports mechanistic de-risking in early target validation by clarifying how physical microenvironmental inputs regulate cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests hypotheses about how specific cell-contact geometries influence division axis orientation and downstream fate specification.
- Operational Value: Provides a reductionist platform to deconvolute contact-mediated signaling from soluble factor effects.
- Predictive Value: Enables quantitative correlation of contact pattern parameters with cellular phenotypic outputs for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible cell-bead interfaces for consistent phenotypic readouts across experimental replicates.
- Scalability: Supports preparation of bead libraries with graded ligand densities to probe dose-dependent contact responses.
- Workflow Integration: Outputs such as spindle orientation angles or division symmetry serve as quantifiable endpoints for automated image-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Findings on contact-dependent division orientation inform models of tissue patterning defects relevant to congenital disorders.
- Translational Continuity: Establishes a bridge from in vitro contact mechanism discovery to in vivo validation in developing embryos.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct contact modulation versus secondary signaling cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where understanding spatial regulation of cellular behavior informs target selection and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how adhesive interface composition and geometry regulate mitotic spindle alignment.
- Screening: Enables assay standardization via fluorescently tagged beads and controlled contact geometry for reproducible phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative spatial readouts (e.g., division axis angle relative to contact plane) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links in vitro contact response data to in vivo spatial patterning outcomes in embryonic development.
- Enterprise Reuse: The bead functionalization and blastomere isolation workflow can be adapted to other model systems for cross-species target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in attributing cellular responses to specific spatial contact cues.
- Operational Value: Delivers a robust, reproducible system for generating defined cell-contact microenvironments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating targets within physiologically relevant spatial contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on evidence of contact-dependent mechanism validity.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgical techniques for blastomere isolation and capillary handling.
- Access to fluorescence microscopy and microfluidic-compatible imaging chambers for live-cell analysis.
- Standardization of bead functionalization protocols (e.g., EDAC activation, Rhodamine labeling) across users and batches.
- Adaptation considerations for applying the method to non-nematode blastomeres or alternative adhesive substrates.
- Practical limitations include embryo fragility post-isolation and the need for optimization of bead concentration and ligand density per cell type.
