Name: 原发性慢性淋巴细胞白血病细胞的细胞次细胞分段监测核/细胞质蛋白贩运 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学习从原发性慢性淋巴细胞白血病细胞中快速分离核质组分的方法，用于研究蛋白质定位与转运。该技术支持Western blot和蛋白质组学分析，助力揭示治疗对蛋白核质穿梭的影响。

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作者感谢 Natasha Malik 博士对稿件的审阅。本研究由 Bloodwise 项目基金资助，授予 AMM（编号 18003）。FACS 分析设施由 Howat 基金会资助。MWM 获得了 Paul O’Gorman 白血病研究中心之友提供的博士生奖学金资助，JC 由 Paul O’Gorman 白血病研究中心之友资助，JH 获得 Bloodwise 项目基金（编号 18003）资助。

本研究所使用的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者原代样本已获得英国大格拉斯哥及克莱德NHS下属的苏格兰西部研究伦理服务机构批准，所有实验均依照批准的指南进行。
1. 从患者血液样本中分离CLL细胞
<ol>
	<li>从已签署知情同意书的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者处获取来自诊所的外周血样本，样本保存于EDTA采血管中，并附有白细胞计数（WCC）。根据WCC值纯化外周血CLL样本。若WCC &#60; 40 × 106 个细胞/mL，进行步骤1.1.1；若WCC ≥ 40 × 106 个细胞/mL，进行步骤1.1.2。
	<ol>
		<li>将所有EDTA采血管中的内容物倒入一个50 mL锥形离心管中，每1 mL血液加入50 µL人B细胞富集混合液。室温（RT）孵育20分钟。进入步骤1.1.2。</li>
		<li>用室温CLL洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS），含0.5%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA）按1:1比例稀释样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据样本体积，将适量室温密度梯度介质分装至适当大小的锥形离心管中（30 mL样本使用50 mL管加10 mL介质，或10 mL样本使用15 mL管加4 mL介质）。</li>
	<li>小心地将样本叠加在密度梯度介质上方，于室温以400 × g 离心30分钟。 
	注意： 离心前确保离心机处于室温，温度变化会影响单个核细胞的富集效果；同时关闭离心机刹车功能，因为突然制动可能破坏液体界面。</li>
	<li>使用塑料巴氏吸管，轻轻吸取聚集在密度梯度介质与CLL洗涤缓冲液界面处的白色单个核细胞层，转移至新的50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>向分离得到的细胞层中加入40 mL CLL洗涤缓冲液以洗涤细胞，于室温以300 × g 离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，通过轻弹管底重悬细胞沉淀，然后重复步骤1.5中的洗涤步骤。</li>
	<li>弃去上清液，按步骤1.6所述方法重悬细胞沉淀，再将其重悬于一定体积的CLL洗涤缓冲液中（最多40 mL，具体体积取决于细胞沉淀的大小）。</li>
	<li>使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞进行计数，随后进行流式细胞术检测CLL细胞纯度。 
	注意： 此时CLL细胞可在实验所需培养基中以10 × 106 个细胞/mL的浓度进行培养，和/或以最高100 × 106 个细胞/管的浓度悬浮于含10%二甲基亚砜（DMSO）/FBS的冻存液中，用于后续实验的冷冻保存。</li>
</ol>
2. 慢性淋巴细胞白血病细胞的流式细胞术
<ol>
	<li>按照表1所述标记12 mm × 75 mm的圆底聚苯乙烯管。</li>
	<li>在2–5号管中各加入一滴补偿微珠，并置于冰上保存。向2–5号管中分别加入1 µL相应的抗体（抗CD5、CD19、CD23或CD45，具体见表1），冰上避光孵育20分钟（可用锡箔纸包裹冰桶以避光）。 
	注意：这些管用于流式细胞术模板设置时的补偿对照。</li>
	<li>将最多1 × 106个CLL细胞分别加入1、6和7号管中，每管加入2 mL FACS缓冲液（PBS + 2% FBS），在室温下以300 × g离心5分钟以洗涤细胞。弃去上清液，将含有细胞沉淀的管置于冰上保存。
	<ol>
		<li>重悬细胞沉淀，根据表1指示，将适当组合的抗体加入7号管细胞中，用FACS缓冲液调整终体积至100 µL。抗体使用浓度应符合制造商推荐。</li>
		<li>用100 µL FACS缓冲液重悬2号和6号管中的细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞与2–5号管中已染色的微珠一起，在冰上避光孵育20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育结束后，向所有管中加入2 mL FACS缓冲液，在室温下以300 × g离心5分钟洗涤细胞。弃去上清液，通过轻轻弹动管壁重悬微珠/细胞沉淀。</li>
	<li>用100 µL FACS缓冲液重悬1–5号管中的沉淀，置于冰上，待流式细胞仪分析时使用。</li>
	<li>使用前立即用FACS缓冲液将DAPI溶液稀释至0.05–0.2 µg/mL。最佳浓度可能因情况而异，建议进行滴定优化。</li>
	<li>用100 µL稀释后的DAPI溶液重悬6号和7号管中的细胞，冰上孵育至少5分钟，使细胞充分染色。 
	注意：无需进一步洗涤，因为必须在缓冲液中保留DAPI以确保死细胞持续标记。加入DAPI后，细胞必须在4小时内完成流式细胞仪分析。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析细胞。</li>
</ol>
3. 慢性淋巴细胞白血病细胞亚细胞组分的制备
注意：在规划实验设置时，应包含一孔未刺激/未处理的细胞，用于制备全细胞提取物。
<ol>
	<li>对 MEC1 CLL 细胞系或分离的原代 CLL 细胞进行所需的刺激和/或药物处理，使用 10 – 20 x 106 细胞/条件。随后将细胞用于亚细胞分级分离（步骤3.4） &amp;#38; 3.5）或制备全细胞提取物（步骤 3.6）。</li>
	<li>溶液/试管的准备： 在收获细胞前，于分馏当天新鲜配制所有溶液/缓冲液。配制后的溶液需置于冰上保存，并在4小时内使用。
	<ol>
		<li>PBS/磷酸酶抑制剂溶液：将磷酸酶抑制剂用1×PBS按1:20的比例稀释（例如，0.5 mL磷酸酶抑制剂加入9.5 mL 1×PBS中）配制而成。 
		注意： 确保磷酸酶抑制剂未发生沉淀。若出现沉淀，于50 °C加热10分钟。</li>
		<li>低渗缓冲液：通过将10倍浓度低渗缓冲液用蒸馏水按1:10稀释配制1倍浓度低渗缓冲液（例如，将50 μL 10x低渗缓冲液加入450 μL去离子水中）。2O)</li>
		<li>10 mM 二硫苏糖醇（DTT）：通过将1 M DTT用蒸馏水按1:100比例稀释配制10 mM DTT（即10 μL 1 M DTT加入990 μL dH₂O中）2O 
		注意： DTT 极不稳定，每次使用时需新鲜配制。避免反复冻融。</li>
		<li>完全裂解缓冲液：根据每个实验所需确定缓冲液体积。每个样本需要50 μL完全裂解缓冲液，因此将5 μL的10 mM DTT（步骤3.2.3）加入44.5 μL裂解缓冲液中，再加入0.5 μL蛋白酶抑制剂混合液。根据实验中样本数量可按比例放大该体积。</li>
		<li>为每种刺激和/或药物处理分别标记四组1.5 mL微量离心管，用于盛装 freshly stimulated cells（步骤3.3）、新制备的胞质组分（步骤3.4.3）、新制备的核组分（步骤3.5.3）以及全细胞裂解液（步骤3.6.3）。将这些微量离心管预先置于冰上冷却，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞转移至分别标记的1.5 mL离心管中，于200 x g离心收集细胞沉淀 g 4 °C下离心5分钟。弃上清液，将细胞重悬于1 mL预冷的含磷酸酶抑制剂的PBS中（步骤3.2.1）。在200 x g条件下离心收集细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。</li>
	<li>细胞质组分的制备： 轻轻重悬用于亚细胞组分分离的细胞沉淀物于50 μL 1×低渗缓冲液中（步骤3.2.2）。将细胞置于冰上孵育15分钟，使细胞充分肿胀。 
	注意： 低渗缓冲液体积可根据细胞数量凭经验适当增加。
	<ol>
		<li>向每个样本中加入 0.8 - 2.5 μL（1:20 至 1:60）去垢剂，并以最高转速涡旋震荡 10 秒。
		<ol>
			<li>为确定用于特定细胞类型以分离核与胞质组分的最适去垢剂浓度，应首先进行去垢剂浓度梯度实验。建议的浓度范围为1:20至1:60（即将2.5 μL至0.8 μL去垢剂加入50 μL低渗缓冲液中）即可满足需求。 
			注意：如果调整步骤 3.4 中低渗缓冲液体积，需确保维持适当的去垢剂比例。</li>
			<li>使用相差显微镜在加入去垢剂前后观察细胞，以验证细胞裂解效果。完整细胞体积较大，细胞核致密且呈深色，细胞质则表现为围绕细胞核的明亮晕轮。 
			注意： 通过使用蛋白质印迹法分析去垢剂梯度产生的裂解组分中的特定蛋白质，进一步确认裂解是否充分。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>裂解后，将样品在14,000 x g 4 °C下持续30秒。</li>
		<li>小心地将上清液转移至预冷的、已标记的微量离心管中。 细胞质组分 可保存于 -80 °C，待后续分析时使用。剩余沉淀物含有细胞核组分（步骤 3.5）。 
		注意： 避免对样本进行反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞核组分的制备： 将每个细胞核沉淀物用50 μL完全裂解缓冲液（步骤3.2.4）通过反复吹打重新悬浮。 
	注意： 完全裂解缓冲液的体积可根据起始细胞数量进行经验性调整。
	<ol>
		<li>加入2.5 μL去垢剂以溶解与核膜相关的蛋白质，并在最高转速下涡旋震荡10秒。将样品置于冰上孵育30分钟。</li>
		<li>在最高转速下涡旋振荡30秒，然后以14,000 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至预冷的、已标记的微量离心管中。 细胞核组分 可保存于 -80 °C，待需要进一步分析时使用。 
		注意： 避免样本反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢性淋巴细胞白血病细胞全细胞裂解液的制备 
	注意： 全细胞提取物的制备可与核组分的制备（步骤3.5）同时进行。
	<ol>
		<li>将全细胞提取物沉淀用100 μL完全裂解缓冲液（步骤3.2.4中配制）通过反复吹打重悬，然后加入5 μL去垢剂以确保细胞完全裂解。将样品置于冰上孵育30分钟。</li>
		<li>在最高转速下涡旋振荡30秒，然后以14,000 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至预冷的微量离心管中。这 全细胞裂解液 可保存于 -80 °C，直至需要进行后续分析。 
		注意： 避免样本反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞亚组分的下游分析
注意： 在本方案中，使用标准方案通过蛋白质印迹法分析所获得的细胞组分，核组分和胞质组分每泳道上样等量细胞数（相当于约 10 µg 蛋白质）。
<ol>
	<li>核质与胞质组分间蛋白质转运的定量分析： 使用免费的Western blot分析软件，通过信号强度定量或密度测定法进行定量Western blot分析。</li>
	<li>导入图像： 由不同成像仪器生成的 Western 印迹图像必须以 JPG、PNG 或 TIFF 文件格式导入。建议使用 16 位深度的 RAW 文件。要导入图像，请点击软件图标并悬停于“Import”选项，然后点击“Third-Party Images”。选择图像文件并点击 打开.</li>
	<li>显示图像： 在图像功能区中，单击 选择 按钮在 显示 组。该 调整显示 对话框将打开，以便在必要时进行进一步调整。实施额外的优化，包括 亮度 或 对比 使用可调节的滑块 图像查找表 标签。使用该 曲线 用于精细调节的选项卡。</li>
	<li>数据分析（通道取消选择）：单击“分析”选项卡。若仅分析一个通道，请取消选择不参与分析的通道。在图像LUT中，单击相应通道的“不显示通道”缩略图，仅保留目标通道显示。以JPG、PNG或TIFF文件格式导入的图像可能需要取消选择多个不需要的RGB通道。
	<ol>
		<li>添加形状： 为了量化信号强度，请单击 添加矩形 在图像上添加一个矩形。单击某一特征的中心（例如，一条蛋白质条带），以在其周围放置一个矩形。或者，若要手动绘制形状，请选择 绘制矩形添加所有需要的图形后，单击 选择 将光标返回到选择工具。 
		注意： 按逻辑顺序添加多个形状，因为数据是按照按顺序生成的 ID 号进行排序的。</li>
		<li>背景扣除： 为消除背景噪声，请点击第一个按钮 背景 组和选择 中位数 从下拉菜单中选择。将边框宽度设置为 3 背景 对话并选择用于背景计算的片段。在选择片段时，应选取最能代表图像背景的片段。 
		注意： 背景噪声可能影响信号的定量分析，因此必须将其扣除，以准确计算目标区域的信号。</li>
		<li>裁剪信号和裁剪背景 - 可选： 以 JPG、PNG 或 TIFF 格式导入的文件可能出现像素饱和现象：蛋白质条带内出现高亮/明亮区域。 信号剪切 和 裁剪背景 （背景）从分析中移除饱和像素。要查看这些数值，请添加 Trim信号 和 背景修剪 点击表格 柱 表格视图右侧的按钮。 
		注意： 像素饱和可能导致定量结果不可靠。仅当一个区域内饱和像素的比例低于5%时，才可将其移除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导出数据： 点击 形状 表格上方的标签。进行密度测定法时，表格中的数值 信号 需要该列。信号值等于某一区域的像素强度总和（Total）减去背景值（Bkgnd）与面积（Area）的乘积。单击“报告”按钮。单击 另存为 或 启动电子表格. 
	信号 = 总值 – (背景 × 面积) 
	注意： “形状”选项卡提供了一个包含信号、总计、面积和背景等定量值的表格。</li>
	<li>量化蛋白质表达： 在已保存的电子表格中，通过将目标蛋白的获得值除以相应条带或变量的内参蛋白值，计算每个条带或变量的目标蛋白标准化表达量 信号 目标蛋白 信号 用于相应的蛋白质上样对照条带。 
	注意： 由于用于区分核组分与胞质组分的上样对照不同，因此不能直接比较核组分与胞质组分中目标蛋白的标准化含量。然而，在同一组分内进行比较（例如，药物处理后）是合理的。</li>
	<li>导出图像用于出版或展示： 点击 图像 位于表格上方的标签，然后点击要导出的图像。如果将图像用于幻灯片演示或其他数字格式，请点击软件图标，将鼠标悬停在 导出 并点击 图像 用于 数字媒体根据需要将图像保存为 JPG、PNG 或 TIFF 文件。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种快速高效的方法，用于从原代慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中分离核与胞质组分，并在细胞受到刺激或药物处理后，定量分析蛋白质在核与胞质组分之间的转运情况。所展示的数据表明，在使用双重mTOR抑制剂AZD8055处理的同时，结合或不结合F(ab')2片段介导的B细胞受体（BCR）交联刺激，能够检测到特定蛋白（例如FOXO1）在核与胞质组分之间的转运（图3 和 图4）。将此类实验与来自单个CLL患者样本的Western blot定量结果相结合，可对所获得的数据进行客观分析，并验证该检测方法在量化来自患者队列的CLL细胞中蛋白质定位整体变化方面的稳健性（图4）。数据表明，在胞质组分中，约五个患者样本的平均结果接近显著性水平。鉴于CLL患者在临床上具有高度异质性11，通常应在更大规模的患者队列中开展此类分析，和/或聚焦于特定的预后亚组患者，以更全面地理解CLL细胞对特定药物治疗的细胞反应。
上述数据表明，选择仅存在于细胞质或细胞核组分中的蛋白质标记物至关重要，因为组分分离的纯度将通过这些标记物得以确认。本研究选用β-tubulin作为细胞质组分的验证标记，Lamin A/C作为细胞核标记。其他常用于识别细胞质组分的蛋白包括GAPDH和α-tubulin，而用于验证细胞核组分纯度的蛋白则包括Brg1（SMARCA4）、TFIID和RNA聚合酶II4,5。然而，在选择标记蛋白时必须谨慎，应避免使用在两种组分中均存在的蛋白，而应选择在特定组分中高度富集的蛋白（例如γ-tubulin）（图2C）9。事实上，尽管GAPDH和actin通常被视为细胞质蛋白，但它们也可定位于细胞核12,13，这凸显了在对细胞施加刺激或处理时，选择不会发生转位的组分标记物的重要性。此外，通过将全细胞裂解液（WCL）与亚细胞组分分离样品一同进行检测，以确认所选蛋白标记物在目标细胞中确实表达，这一步骤也十分重要。
在所示的代表性实验中，每种条件（刺激/药物处理）使用了相同数量的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，随后立即制备分馏样品。每泳道上样10 µg分馏蛋白可为检测目标蛋白提供足够的材料。由于这些样品仅接受了短期药物处理和刺激（最长4小时），因此假设各样品中的蛋白水平保持不变，故未进行蛋白定量检测。然而，若细胞处理时间延长（18–72小时），细胞死亡或增殖的程度可能因所用药物或细胞刺激方式的不同而显著改变所提取蛋白的质量和数量，从而影响处理/刺激样品中的蛋白水平。在此类长期药物处理的情况下，建议在进行Western blot前，使用Bradford法或等效方法进行蛋白定量，以确保每个免疫印迹泳道中上样等量的蛋白。某些去垢剂可能干扰特定的蛋白定量检测14，可通过稀释细胞分馏蛋白样品来降低此类干扰。此外，应使用与待测样品相同稀释倍数的完整裂解缓冲液作为空白对照。
为了为本文所述结果提供支持性证据，可采用荧光显微镜进行平行实验，以分析FOXO1在慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞内的定位，从而直观展示这些发现5。此外，所获得的亚细胞组分还可用于后续下游分析中的酶活性测定或蛋白质组学分析。

大分子在细胞核与细胞质之间的转运已被证实对正常细胞功能具有关键作用，而在癌细胞中这种转运常常发生失调1,2。此类失调可能源于调控核输出的蛋白质发生过表达或突变。其中一种蛋白——输出蛋白-1（Exportin-1, XPO1）是一种转运受体，可将超过&#62;200种含有核输出信号（NES）的蛋白质从细胞核转运至细胞质2。XPO1的转运底物包括p53、FOXO家族成员和IB，通过抑制其作用机制导致这些蛋白失活1,2,3。当微环境信号作用于癌细胞时，还可能进一步引起蛋白质的错误定位，从而激活细胞内信号通路（如磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt通路），导致FOXO家族成员失活并随之从细胞核中被输出4,5。这种肿瘤抑制蛋白的错误定位已被证实与多种血液系统肿瘤及实体瘤的发生发展相关1,2,6。
开发用于血液系统恶性肿瘤（急性髓系白血病（AML）/慢性淋巴细胞白血病（CLL））临床治疗的小分子抑制剂，这些抑制剂可结合并选择性抑制XPO1功能，凸显了建立适当技术以评估药理学试剂对蛋白质在细胞核与细胞质之间穿梭影响的重要性6,7,8。成像技术已取得显著进展，能够在药物处理等外界刺激条件下识别蛋白质在亚细胞区室中的定位；然而，建立可靠且具有支持性的平行技术对于向科学界准确传达研究结果的有效性至关重要。
从患者血液样本中分离的静息淋巴细胞和恶性慢性淋巴细胞白血病B细胞（CLL-B细胞）在制备核与胞质组分时面临挑战，原因在于其核质比极高。为了规划未来的实验方案，优化实验条件以获得稳定且可靠的实验数据至关重要。本文所述方法可实现对核和胞质组分中蛋白质的定量，并确定细胞刺激和/或药物处理如何影响这些蛋白质的分布与表达水平。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Griener Bio one</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>3 mL巴斯德吸管</td><td>格里纳生物一号</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm FACS 管</td><td>Elkay</td><td>2052-004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Griener Bio one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Griener Bio one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD5 FITC 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555352</td><td>表型表面标志物</td></tr><tr><td>抗-CD19 PE Cy7 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>表型表面标志物</td></tr><tr><td>抗-CD23 APC 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>558690</td><td>表型表面标志物</td></tr><tr><td>抗-CD45 APC Cy7 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>表型表面标志物</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-微管蛋白抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>2146</td><td>细胞质标记物</td></tr><tr><td>抗-&amp;gamma;微管蛋白小鼠抗体（克隆号 GTU-88）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5326</td><td></td></tr><tr><td>抗-FoxO1（C29H4）兔抗体</td><td>细胞信号转导</td><td>2880</td><td></td></tr><tr><td>抗Lamin A/C抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>2032</td><td>核标记物</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体</td><td>细胞信号转导</td><td>7076</td><td>二抗</td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>7074</td><td>二抗</td></tr><tr><td>抗Rpb1 CTD抗体（克隆4H8）</td><td>细胞信号转导</td><td>2629</td><td>核标记物</td></tr><tr><td>BDFACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>按需提供</td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>DAPI 溶液</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>活/死细胞鉴别剂</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>能量色散X射线光谱</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermofisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>Histopaque1077 密度梯度培养基</td><td>Sigma</td><td>H8889</td><td></td></tr><tr><td>HyperPAGE 10 - 190 kDa 蛋白分子量标准</td><td>Bioline</td><td>BIO-33066</td><td>分子量标记物</td></tr><tr><td>Image Studio Lite（版本 5.2.5）</td><td>LI-COR</td><td>www.licor.com</td><td>软件</td></tr><tr><td>Labnet VX100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>涡旋震荡</td></tr><tr><td>核提取试剂盒</td><td>Active Motif</td><td>40010</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Thermofisher</td><td>01-111-42</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus 预染蛋白质标准品</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26619</td><td>分子量标记物</td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep 人B细胞富集试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 3-16P</td><td>SciQuip</td><td></td><td>离心</td></tr><tr><td>Sigma 1-15PK</td><td>SciQuip</td><td></td><td>离心</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

大分子物质的核输出在癌细胞中常常发生失调。肿瘤抑制蛋白（如p53）可能因异常的细胞定位而失活，从而破坏其作用机制。慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞以及其他癌细胞的存活，在一定程度上依赖于核质间转运的失调，这至少部分归因于转运受体XPO1的失调以及PI3K介导信号通路的持续激活。要深入理解这些蛋白在疾病病理生物学中的作用，必须明确各蛋白在其细胞内定位背景下的功能。此外，在亚细胞蛋白转运的背景下，识别细胞刺激所涉及的过程以及特定药理学抑制剂的作用机制，将有助于更全面地理解其作用机理。本文所述方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效、优化地制备细胞核和细胞质组分。这些组分可用于检测细胞刺激和药物处理后，蛋白在细胞核与细胞质组分之间转运的变化情况。所得数据可进行量化分析，并与免疫荧光图像平行呈现，从而提供可靠且可量化的结果。

在设计针对原代CLL细胞的实验时，如果检测需要大量细胞（&gt;50 × 106 细胞），优先使用新鲜分离的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，而非需要解冻的冻存细胞，尽管这并不总是可行。这是因为冻融过程可能导致高达50%的CLL细胞死亡，但具体比例取决于样本。使用白细胞富集（WCC）进行CLL细胞富集 &gt;40 x 106/mL，通过此处所述的密度梯度离心法（步骤1.3–1.5）可实现高细胞回收率，并获得高纯度（≥95%）的原代CLL细胞。在所示样本中，WCC = 177 × 106/mL：从30 mL血液样本中获得5 × 109 回收了细胞，占总细胞数的94%。通过流式细胞术分析该样品，结果显示CLL细胞纯度为 &gt;经FSC/SSC设门后，DAPI阴性（活细胞）的单个细胞中CLL细胞标志物CD19和CD5双表面表达显示比例为95%图1).
通过在制备胞质组分期间使用不同比例的去垢剂（1:20 至 1:60）对亚细胞分级分离步骤进行了优化（步骤 3.4）。随后，制备核组分和全细胞裂解液（WCLs）（分别为步骤 3.5 和 3.6）。对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞系 MEC1 所得的各组分进行免疫印迹分析图2A）以及原代CLL细胞（图2B）。通过检测核标记物Lamin A/C（核内；74/63 kDa）和细胞质标记物β-tubulin（细胞质内；55 kDa）来验证细胞分馏是否成功。分馏结果表明，MEC1细胞的最佳去垢剂稀释度为1:60图2A)，而慢性淋巴细胞白血病（CLL）原代细胞的最佳稀释度为1:30（图2B如组分中核蛋白富集而胞质蛋白缺乏，反之亦然. WCLs 代表总蛋白，可作为用于检测亚细胞组分的抗体的阳性对照。选择合适的蛋白质作为组分标记物至关重要： 图2C 显示了从MEC1细胞制备的核/胞质组分的免疫印迹结果，其中RNA聚合酶II（Rpb1 CTD；250 kDa）和Lamin A/C作为核组分标志物进行检测，而β-tubulin和γ-tubulin（50 kDa）则用作胞质标志物。结果清楚表明γ-tubulin在胞质中富集，但其在细胞核中亦有明显表达，与先前研究结果一致。9.
一旦实验条件得到优化，即可进行实验。在所示示例中，通过在存在或不存在mTORC1/2双抑制剂AZD8055的情况下刺激B细胞抗原受体（BCR），检测了MEC1细胞（图3A）和原代CLL细胞（图3B）中FOXO1在核与胞质组分中的亚细胞定位5,10。在这两个示例中，均成功获得了高度富集的核与胞质组分，表现为核组分中Lamin几乎专一性表达，而β-tubulin则仅在胞质组分中表达。在两种细胞类型中，与无药物对照（NDC）相比，经AZD8055处理后胞质中FOXO1表达水平降低，同时核内FOXO1表达增加，从而证明了蛋白的转位现象（图3）。为消除数据解读的主观性，对来自五个原代CLL样本的独立免疫印迹结果在亚细胞组分中进行了定量分析（步骤4；图4A），以各样本相应的核或胞质蛋白作为内部上样对照，并将每个组分归一化至未刺激（US）无药物对照（NDC）组。所得图表显示了FOXO1在核与胞质组分之间的迁移趋势：AZD8055降低了胞质中FOXO1的表达水平，同时增加了其在细胞核中的表达。此外，在BCR交联后，胞质中FOXO1的表达水平明显升高。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试管</td>
			<td>试管名称</td>
			<td>细胞/微珠</td>
			<td>抗原</td>
			<td>荧光素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>未染色</td>
			<td>细胞</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>单染</td>
			<td>微珠</td>
			<td>CD5</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>单染</td>
			<td>微珠</td>
			<td>CD19</td>
			<td>PE-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>单染</td>
			<td>微珠</td>
			<td>CD23</td>
			<td>APC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>单染</td>
			<td>微珠</td>
			<td>CD45</td>
			<td>APC-Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>单染</td>
			<td>细胞</td>
			<td>活力</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>CLL 染色</td>
			<td>细胞</td>
			<td>CD5、CD19、CD23、CD45 及活力</td>
			<td>FITC、PE-Cy7、APC、APC-Cy7 及 DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：显示慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞流式细胞术所需理想样本管组合的表格。 每项实验必须包含所有适当的对照，以准确分析所获得的结果。
<img alt="流式细胞术分析示意图；使用CD标记物鉴定淋巴细胞；散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本的代表性流式细胞术分析图。 从一名CLL患者的外周血中富集得到的单个核CLL细胞，首先通过FSC-A vs. SSC-A设门，随后利用FSC-A vs. FSC-H排除双联体（A）。使用未染色细胞（第1管）和补偿对照（第2–6管）对流式细胞仪进行设置，以识别细胞并完成荧光通道间的补偿，从而确保荧光信号被准确检测（B）。图中显示了CD19和CD5荧光通道中阴性染色（未染色细胞；第1管）的示例（C）。对活细胞（DAPI阴性）且CD45阳性的细胞进行设门后，进一步确定DAPI-CD45+细胞群体中CD19+CD5+细胞（95.5%）和CD19+CD23+细胞（91.2%）的比例（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Western blot 结果；核蛋白与胞质蛋白水平；Lamin、Tubulin；蛋白表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：核/胞质分馏的优化。 从慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞系（A）MEC1 或（B）从患者外周血中富集的原代 CLL 细胞（如步骤 3 所述）的细胞沉淀（10 – 20 × 106 个细胞）中制备胞质和核组分以及全细胞裂解液（WCL）。通过在制备胞质组分时使用不同比例的去垢剂（1:20 至 1:60）（如步骤 3.4 所述）对亚细胞分馏条件进行优化。将所得样品进行免疫印迹，并用抗-Lamin A/C（核）和抗-β-tubulin（胞质）抗体探针检测，以确认分馏成功，并与 WCL 对照。分子量标记物显示在印迹左侧（M）。* 表示细胞裂解的最佳去垢剂条件。（C）MEC1 细胞在对照条件（NDC）或药物处理（8055）下，有或无刺激（分别表示为 + 或 – BCR 交联）时的核和胞质组分的免疫印迹。印迹使用抗-Rbp1 CTD（克隆 4H8；识别 RNA 聚合酶 II 亚基 B1）、抗-Lamin A/C、抗-β-tubulin 或抗-γ-tubulin（克隆 GTU-88）抗体进行探针检测，以鉴定亚细胞组分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="核/胞质组分中BCR、FOXO1的Western印迹分析，以及Lamin A/C、β-Tubulin对照。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：亚细胞组分分离显示FOXO1在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中于细胞核与胞质之间的穿梭。（A）MEC-1细胞和（B）原代CLL细胞按所示，经100 nM AZD8055（8055）预处理30分钟或不作处理（NDC），随后进行BCR交联1小时或保持未刺激（US）。然后制备核与胞质组分并进行免疫印迹。通过抗-Lamin A/C（核）和抗-β-tubulin（胞质）抗体检测确认组分分离效果后，使用抗-FOXO1抗体评估药物处理和BCR交联对FOXO1蛋白表达的影响。M表示分子量标记物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="FOXO1表达的蛋白质印迹及柱状图，包括细胞质和细胞核部分的密度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60426/60426fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：定量蛋白质印迹分析（密度测定）的示例。（A）使用在线可用的蛋白质印迹分析软件进行密度测定。简而言之，在“分析”工具栏中，围绕图像中的蛋白条带绘制矩形以计算信号强度。图中显示的是来自一名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本的代表性蛋白质印迹图像的密度测定结果，该样本经过了细胞质/细胞核分馏处理。细胞质和细胞核组分通过细胞质标志物（β-微管蛋白）和核标志物（Lamin A/C）的表达加以区分。特定条件下FOXO1的归一化表达可通过将FOXO1的信号强度除以相应细胞组分中β-微管蛋白或Lamin A/C的信号强度来计算。相对于未处理（US）载体对照的相对FOXO1表达，可通过将特定条件下的归一化FOXO1表达除以特定细胞组分中未处理载体对照的归一化FOXO1表达来计算。（B）图示在各细胞组分内相对于未处理-NDC（US-NDC）对照归一化的细胞质（左）或细胞核（右）组分中FOXO1的表达水平。图中的红点表示所示的计算示例。该数据显示了与US-NDC相比FOXO1表达的平均倍数变化（±SEM）。P值采用双尾配对Student t检验确定。n = 5个独立的CLL患者样本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60426/60426fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效制备细胞核与细胞质组分，并对其进行优化。这些样品可用于确定蛋白质的定位，以及在细胞受到刺激或药物处理后，蛋白质在细胞核与细胞质区室之间转运发生的变化。

大分子的核输出在癌细胞中常常发生失调。肿瘤抑制蛋白（如p53）可能因异常的核输出而失活。

开发研究大分子在细胞核与细胞质之间转运的技术，并鉴定肿瘤抑制蛋白的异常定位，对于深入理解慢性淋巴细胞白血病（CLL）的发病机制以及推动新型疗法的研发至关重要。本实验方案提供了一种快速高效的方法，用于从原代CLL细胞中分离细胞核和细胞质组分。这些组分可用于后续实验，包括酶活性测定、蛋白质组学分析以及蛋白质印迹（western blotting）。该技术将拓展我们对治疗手段及肿瘤微环境信号如何影响慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞以及潜在的其他B细胞恶性肿瘤中蛋白质在细胞核与细胞质之间转运的理解。此方法可用于确定蛋白质的位置和/或诱导蛋白质的移动（视具体情况而定）。对计划使用的每种细胞系进行去垢剂梯度处理，以确保获得高度富集的细胞核和细胞质组分。本实验操作将由我实验室的技术员 Jennifer Cassels 与 Jodie Hay 和 Michael Moles 一同示范。从已签署知情同意书的慢性淋巴细胞白血病患者处采集外周血样本，置于含EDTA的采血管中，并获取白细胞计数。人类血液样本应被视为具有潜在危险性，因其可能含有经血液传播的病毒。请确保在二级生物安全柜中处理这些样本，且操作人员始终穿戴实验服和手套。将被血液污染的材料丢弃至消毒液中。如果白细胞计数等于或大于每毫升4000万个细胞，需以1:1的比例用室温CLL洗涤缓冲液稀释样本。然后将RT密度梯度介质分装至适当大小的锥形离心管中，用于样品处理。小心地将样品叠加在介质上方，并在室温下以400 × g离心30分钟。使用塑料巴斯德吸管，轻轻收集位于密度梯度介质界面处的单个核细胞白色层，并将其转移至CLL洗涤缓冲液中。将分离得到的单层细胞转移至一个新的50毫升锥形离心管中。为了洗涤细胞，向该单层细胞中加入 40 毫升 CLL 洗涤缓冲液，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，轻弹管底以重新悬浮沉淀，重复此洗涤步骤一次。再次弃去上清液，再次轻弹管底，然后根据沉淀的大小，用一定体积的 CLL 洗涤缓冲液重新悬浮细胞沉淀。在计数细胞并进行流式细胞术检测细胞纯度后，将细胞以所需的细胞密度接种于组织培养板中，准备进行刺激或药物处理。刺激和/或药物处理后，完成孵育。将细胞转移至分别标记的1.5毫升微量离心管中，在4摄氏度下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 1 毫升预冷的含磷酸酶抑制剂的 PBS 中。在 4°C 条件下，以 200 × g 离心 5 分钟。吸去上清液，并将所得的全细胞提取物沉淀置于冰上，用于后续操作。为制备细胞质组分，用 50 微升 1× 高渗缓冲液轻柔重悬细胞沉淀。将细胞置于冰上孵育 15 分钟，使其充分膨胀。在通过去垢剂梯度实验确定适用于特定细胞类型的去垢剂最佳浓度后，向每个样品中加入 0.8 至 2.5 微升去垢剂，并在最高转速下涡旋振荡 10 秒。为验证细胞裂解，在加入去垢剂前后，使用相差显微镜观察细胞。所有细胞均具有致密、深色的细胞核，周围被呈亮环状的细胞质包围。裂解完成后，在4°C条件下，以14,000 × g离心30秒。小心操作，不要扰动沉淀，将上清液转移至预冷的带标签微量离心管中，并将此细胞质组分保存在 -80 摄氏度，直至进一步分析。确保完全移除细胞质组分，以防止污染核组分。向含有核组分的剩余沉淀中加入 50 µL 完全裂解缓冲液，通过反复吹打重悬沉淀。为了溶解与核膜相关的蛋白质，加入 2.5 µL 去垢剂，以最高速度涡旋振荡 10 秒，然后在冰上孵育 30 分钟。再以最高速度涡旋振荡 30 秒，随后离心。将上清液转移至预冷的带标记的微量离心管中，并将此核组分于 -80 °C 保存，直至进一步分析。对于全细胞裂解液，用移液器反复吹打，将全细胞提取物沉淀重悬于100微升完全裂解缓冲液中。为确保细胞完全裂解，加入5微升去垢剂，冰上孵育30分钟。在最高转速下涡旋振荡30秒，然后在4°C下以14,000 × g离心20分钟。将上清液转移至预冷的微量离心管中，并将此全细胞裂解液在 -80 摄氏度保存，直至进一步分析。为了定量分析细胞核与细胞质组分之间的蛋白质转运，进行定量 Western 印迹分析并导入图像。要在图像功能区中显示图像，请点击显示组中的“选择”按钮，然后点击“Chemi 通道”。将打开“选择显示”对话框，以便在必要时进行进一步调整。可通过图像查找表（LUT）选项卡上的可调节滑块，实施额外的增强操作，如亮度或对比度调整。使用“曲线”选项卡进行更精细的调节。进行数据分析时，首先点击“分析”选项卡。若仅需分析一个通道，请点击不需要分析的通道的“不显示通道”缩略图以取消选择，仅保留需要分析的通道显示。为量化信号强度，请点击“添加矩形”以在图像上添加矩形区域。单击某一特征（例如蛋白质条带）的中心位置，以在其周围放置一个矩形。添加完所需的图形后，单击“选择”以将光标恢复为选择工具。为扣除背景噪声，请单击“背景”组中的第一个按钮，然后从下拉菜单中选择“中值”。在“背景”对话框中将边框宽度设置为三，并选择最能代表用于背景计算的图像背景的区域。要导出数据，请点击表格上方的“形状”选项卡。进行密度测定分析时，需要信号列中的数值。信号是某个区域的像素强度值总和或特定形状的总值减去该区域背景值的乘积。然后点击“报告”按钮，再点击“另存为”或“启动电子表格”。在保存的电子表格中，若要计算每个层面或变量中目标蛋白的归一化表达量，需将目标蛋白测得的信号值除以相应蛋白上样对照条带的信号值。要导出图像，请点击表格上方的“图像”标签，然后点击要导出的图像。如果将图像用于幻灯片演示或其他数字格式，请点击软件图标，将鼠标悬停在“导出”上，点击“用于数字媒体的图像”，然后按需保存图像。通过密度离心法富集白细胞计数（WCC）大于每毫升4000万个的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，可实现较高的细胞回收率。通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门后，流式细胞术分析显示，慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的纯度超过95%，表现为CLL细胞表面标志物CD19和CD5的共表达。对CLL细胞系Mac-1及原代CLL细胞的分馏组分进行免疫印迹分析时，分馏结果表明，Mac-1细胞的最佳去垢剂稀释度为1:60，而原代CLL细胞则为1:30。在Mac-1细胞和原代CLL细胞中检测转录因子FOXO1在核组分和胞质组分中的亚细胞定位时，核组分中层蛋白（lamin）几乎专一性表达，而胞质组分中β-微管蛋白（beta Tubulin）的特异性表达表明已成功获得高度富集的细胞组分。与NDC相比，经AZD 8055处理后，细胞质中FOXO1的表达水平降低，同时细胞核区室中FOXO1的表达增加，表明发生了蛋白转位。对五个原代CLL样本的各亚细胞组分中的单个免疫印迹进行定量后发现，AZD 8055可降低细胞质中FOXO1的表达水平，并增加细胞核中的表达水平。BCR交联则增加了细胞质中FOXO1的表达。请始终将所有试剂和样品置于冰上，以防止蛋白质降解。本实验步骤所获得的亚细胞组分也可用于酶活性检测，例如 FOXO 活性检测，从而可以关联 FOXO1 的细胞定位与其 DNA 结合活性之间的关系。该技术的建立使我们能够研究慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中特定蛋白质在选择性抑制剂作用下的转运情况，并支持我们开展平行的免疫荧光研究，以获得可靠且可量化的数据集。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

原发性慢性淋巴细胞白血病细胞的细胞次细胞分段监测核/细胞质蛋白贩运

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本视频介绍了从外周血中分离慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的技术。通过本方案，我们将从人类患者血液样本中分离CLL细胞，用于后续高效制备细胞核和细胞质组分。...

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本视频介绍了白血病细胞亚细胞组分的制备方法，该方法可用于从白血病细胞中分离获得细胞质和细胞核组分。所获得的细胞核和细胞质组分可用于后续下游分析。...

白血病细胞亚细胞组分的制备：一种从白血病细胞制备细胞组分与核组分的方法

本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。...

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

本文所述方案是一种简便且可重复的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来检测在不同培养条件下慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的嘌呤代谢情况。...

基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

本方案描述了一种通过定量分析NLS-NES-GFP蛋白核输入的实时变化，来灵敏检测运动神经元样NSC-34细胞内核质运输速率的方法。...

在运动神经元样NSC-34细胞中实时测量核质运输的检测方法

本方案描述了使用离心淘析法将原代急性淋巴细胞白血病细胞按不同细胞周期时相进行分离的方法。...

通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的白血病类型。NFAT转录因子在多种细胞类型的发育和活化过程中发挥重要的调控作用。本文介绍了一种在人类CLL细胞中应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术的实验方案，用于鉴定NFAT2的新型靶基因。...

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。...

无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

该分级分离方案可使研究人员从哺乳动物细胞中分离出细胞质、细胞核、线粒体和膜蛋白。后两种亚细胞组分通过等密度梯度离心进一步纯化。...

通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞组分分离

本实验方案提供了一种高效且灵活的方法，利用培养细胞分离核和细胞质组分中的RNA，并通过qPCR进行验证。该方法可有效替代其他RNA提取试剂盒。...

从原代细胞和培养细胞中制备细胞质和细胞核长链RNA

学习从原发性慢性淋巴细胞白血病细胞中快速分离核质组分的方法，用于研究蛋白质定位与转运。该技术支持Western blot和蛋白质组学分析，助力揭示治疗对蛋白核质穿梭的影响。

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