原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

开发研究大分子在细胞核与细胞质之间转运的技术，并鉴定肿瘤抑制蛋白的异常定位，对于深入理解慢性淋巴细胞白血病（CLL）的发病机制以及推动新型疗法的研发至关重要。本实验方案提供了一种快速高效的方法，用于从原代CLL细胞中分离细胞核和细胞质组分。这些组分可用于后续实验，包括酶活性测定、蛋白质组学分析以及蛋白质印迹（western blotting）。

该技术将拓展我们对治疗手段及肿瘤微环境信号如何影响慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞以及潜在的其他B细胞恶性肿瘤中蛋白质在细胞核与细胞质之间转运的理解。此方法可用于确定蛋白质的位置和/或诱导蛋白质的移动（视具体情况而定）。对计划使用的每种细胞系进行去垢剂梯度处理，以确保获得高度富集的细胞核和细胞质组分。

本实验操作将由我实验室的技术员 Jennifer Cassels 与 Jodie Hay 和 Michael Moles 一同示范。从已签署知情同意书的慢性淋巴细胞白血病患者处采集外周血样本，置于含EDTA的采血管中，并获取白细胞计数。人类血液样本应被视为具有潜在危险性，因其可能含有经血液传播的病毒。

请确保在二级生物安全柜中处理这些样本，且操作人员始终穿戴实验服和手套。将被血液污染的材料丢弃至消毒液中。如果白细胞计数等于或大于每毫升4000万个细胞，需以1:1的比例用室温CLL洗涤缓冲液稀释样本。

然后将RT密度梯度介质分装至适当大小的锥形离心管中，用于样品处理。小心地将样品叠加在介质上方，并在室温下以400 × g离心30分钟。使用塑料巴斯德吸管，轻轻收集位于密度梯度介质界面处的单个核细胞白色层，并将其转移至CLL洗涤缓冲液中。将分离得到的单层细胞转移至一个新的50毫升锥形离心管中。

为了洗涤细胞，向该单层细胞中加入 40 毫升 CLL 洗涤缓冲液，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，轻弹管底以重新悬浮沉淀，重复此洗涤步骤一次。再次弃去上清液，再次轻弹管底，然后根据沉淀的大小，用一定体积的 CLL 洗涤缓冲液重新悬浮细胞沉淀。

在计数细胞并进行流式细胞术检测细胞纯度后，将细胞以所需的细胞密度接种于组织培养板中，准备进行刺激或药物处理。刺激和/或药物处理后，完成孵育。将细胞转移至分别标记的1.5毫升微量离心管中，在4摄氏度下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于 1 毫升预冷的含磷酸酶抑制剂的 PBS 中。在 4°C 条件下，以 200 × g 离心 5 分钟。吸去上清液，并将所得的全细胞提取物沉淀置于冰上，用于后续操作。

为制备细胞质组分，用 50 微升 1× 高渗缓冲液轻柔重悬细胞沉淀。将细胞置于冰上孵育 15 分钟，使其充分膨胀。在通过去垢剂梯度实验确定适用于特定细胞类型的去垢剂最佳浓度后，向每个样品中加入 0.8 至 2.5 微升去垢剂，并在最高转速下涡旋振荡 10 秒。

为验证细胞裂解，在加入去垢剂前后，使用相差显微镜观察细胞。所有细胞均具有致密、深色的细胞核，周围被呈亮环状的细胞质包围。裂解完成后，在4°C条件下，以14,000 × g离心30秒。

小心操作，不要扰动沉淀，将上清液转移至预冷的带标签微量离心管中，并将此细胞质组分保存在 -80 摄氏度，直至进一步分析。确保完全移除细胞质组分，以防止污染核组分。向含有核组分的剩余沉淀中加入 50 µL 完全裂解缓冲液，通过反复吹打重悬沉淀。

为了溶解与核膜相关的蛋白质，加入 2.5 µL 去垢剂，以最高速度涡旋振荡 10 秒，然后在冰上孵育 30 分钟。再以最高速度涡旋振荡 30 秒，随后离心。将上清液转移至预冷的带标记的微量离心管中，并将此核组分于 -80 °C 保存，直至进一步分析。

对于全细胞裂解液，用移液器反复吹打，将全细胞提取物沉淀重悬于100微升完全裂解缓冲液中。为确保细胞完全裂解，加入5微升去垢剂，冰上孵育30分钟。在最高转速下涡旋振荡30秒，然后在4°C下以14,000 × g离心20分钟。

将上清液转移至预冷的微量离心管中，并将此全细胞裂解液在 -80 摄氏度保存，直至进一步分析。为了定量分析细胞核与细胞质组分之间的蛋白质转运，进行定量 Western 印迹分析并导入图像。要在图像功能区中显示图像，请点击显示组中的“选择”按钮，然后点击“Chemi 通道”。

将打开“选择显示”对话框，以便在必要时进行进一步调整。可通过图像查找表（LUT）选项卡上的可调节滑块，实施额外的增强操作，如亮度或对比度调整。使用“曲线”选项卡进行更精细的调节。

进行数据分析时，首先点击“分析”选项卡。若仅需分析一个通道，请点击不需要分析的通道的“不显示通道”缩略图以取消选择，仅保留需要分析的通道显示。为量化信号强度，请点击“添加矩形”以在图像上添加矩形区域。

单击某一特征（例如蛋白质条带）的中心位置，以在其周围放置一个矩形。添加完所需的图形后，单击“选择”以将光标恢复为选择工具。为扣除背景噪声，请单击“背景”组中的第一个按钮，然后从下拉菜单中选择“中值”。

在“背景”对话框中将边框宽度设置为三，并选择最能代表用于背景计算的图像背景的区域。要导出数据，请点击表格上方的“形状”选项卡。进行密度测定分析时，需要信号列中的数值。

信号是某个区域的像素强度值总和或特定形状的总值减去该区域背景值的乘积。然后点击“报告”按钮，再点击“另存为”或“启动电子表格”。在保存的电子表格中，若要计算每个层面或变量中目标蛋白的归一化表达量，需将目标蛋白测得的信号值除以相应蛋白上样对照条带的信号值。

要导出图像，请点击表格上方的“图像”标签，然后点击要导出的图像。如果将图像用于幻灯片演示或其他数字格式，请点击软件图标，将鼠标悬停在“导出”上，点击“用于数字媒体的图像”，然后按需保存图像。通过密度离心法富集白细胞计数（WCC）大于每毫升4000万个的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，可实现较高的细胞回收率。

通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门后，流式细胞术分析显示，慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的纯度超过95%，表现为CLL细胞表面标志物CD19和CD5的共表达。对CLL细胞系Mac-1及原代CLL细胞的分馏组分进行免疫印迹分析时，分馏结果表明，Mac-1细胞的最佳去垢剂稀释度为1:60，而原代CLL细胞则为1:30。在Mac-1细胞和原代CLL细胞中检测转录因子FOXO1在核组分和胞质组分中的亚细胞定位时，核组分中层蛋白（lamin）几乎专一性表达，而胞质组分中β-微管蛋白（beta Tubulin）的特异性表达表明已成功获得高度富集的细胞组分。

与NDC相比，经AZD 8055处理后，细胞质中FOXO1的表达水平降低，同时细胞核区室中FOXO1的表达增加，表明发生了蛋白转位。对五个原代CLL样本的各亚细胞组分中的单个免疫印迹进行定量后发现，AZD 8055可降低细胞质中FOXO1的表达水平，并增加细胞核中的表达水平。BCR交联则增加了细胞质中FOXO1的表达。

请始终将所有试剂和样品置于冰上，以防止蛋白质降解。本实验步骤所获得的亚细胞组分也可用于酶活性检测，例如 FOXO 活性检测，从而可以关联 FOXO1 的细胞定位与其 DNA 结合活性之间的关系。该技术的建立使我们能够研究慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中特定蛋白质在选择性抑制剂作用下的转运情况，并支持我们开展平行的免疫荧光研究，以获得可靠且可量化的数据集。