Name: 用于打印 3D 细胞-拉丹胰腺组织构造的胰腺组织衍生细胞外基质生物墨水 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 了解使用胰腺组织衍生细胞外基质生物墨水进行3D生物打印的方法，用于构建可移植胰腺组织以治疗1型糖尿病。该技术保留组织特异性成分，为胰岛细胞提供最佳微环境。

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本研究由 Bio 资助 &amp;#38; 国家研究基金会（NRF）资助的韩国政府（MSIT）医疗技术开发项目（2017M3A9C6032067） &#34;ICT融合创新计划&#34; （IITP-2019-2011-1-00783），由IITP（信息传输处理研究所）监督 &amp;#38; 通信技术规划 &amp;#38; 评估）

猪的胰腺组织取自当地屠宰场。动物实验已获得韩国首尔峨山医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 组织脱细胞
<ol>
	<li>准备脱细胞化所需的溶液。 
	注意：所有溶液配制中使用的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）均通过将蒸馏水加入 10× PBS 中稀释获得。
	<ol>
		<li>配制 1% Triton-X 100 溶液时，将 100 mL 的 100% Triton-X 100 溶液加入 900 mL 的 1× PBS 中，使用磁力搅拌器以 150 rpm 的速度搅拌 6 小时。在使用前，取 40 mL 的 10% Triton-X 100 溶液与 360 mL 的 1× PBS 混合，配制 400 mL 的 1% Triton-X 100 溶液。 
		注意：10% Triton-X 100 溶液可在室温下储存，直至使用。</li>
		<li>配制 0.1% 过氧乙酸溶液时，在使用前将 8.5 mL 的 4.7% 过氧乙酸加入 22.8 mL 的 70% 乙醇和 368.7 mL 的蒸馏水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在脱细胞化前去除胰腺的周围组织并进行切片。
	<ol>
		<li>用流动的自来水冲洗切除的猪胰腺，并使用灭菌剪刀去除周围组织。</li>
		<li>用镊子将胰腺转移至塑料袋中，在 -80 °C 下冷冻 1 小时，以便在下一步中更有效地切割胰腺。</li>
		<li>使用擦丝器将冷冻的胰腺切成 1 mm 厚的片状。</li>
		<li>将 50 g 切好的组织转移至一个 500 mL 的塑料容器中。 
		注意：建议使用带盖的塑料容器，以防止组织污染并减少溶液蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试剂处理。 
	注意：整个脱细胞化过程应在 4 °C 下，于数字轨道摇床上以 150 rpm 的速度进行。在所有脱细胞化步骤中，需使用镊子进行物理分离，以防止胰腺切片粘连。每次更换试剂前，需用蒸馏水清洗容器，以彻底清除容器中残留的试剂。
	<ol>
		<li>在进行任何试剂处理前，将 50 g 切好的胰腺组织与 300 mL 蒸馏水一起置于摇床上洗涤。</li>
		<li>以 150 rpm 持续搅拌，直至浑浊的水消失（约 12 小时后）。每 2 小时更换一次蒸馏水。 
		注意：为提高效率，建议每小时更换一次蒸馏水，以更快地清除浑浊液体。</li>
		<li>弃去水溶液，将 50 g 组织用 400 mL 的含 1% Triton-X 100 的 1× PBS 溶液处理 84 小时。每 12 小时更换一次溶液。 
		注意：此时组织量会减少，因为细胞成分开始被去除。</li>
		<li>用 400 mL 异丙醇（IPA）处理 2 小时，以去除胰腺中残留的脂肪。 
		注意：在此过程中，由于脂肪被去除，组织变硬是正常现象。</li>
		<li>2 小时后，移除 IPA，并用 400 mL 的 1× PBS 洗涤组织 24 小时。每 12 小时更换一次 1× PBS。</li>
		<li>为对脱细胞化组织进行灭菌，弃去前一步溶液，加入 400 mL 含 0.1% 过氧乙酸的 4% 乙醇溶液处理 2 小时。</li>
		<li>为去除残留的去垢剂，用 400 mL 的 1× PBS 洗涤组织 6 小时。每 2 小时更换一次溶液。</li>
		<li>用镊子将脱细胞化的组织收集至 50 mL 锥形管中。</li>
		<li>将样品在 -80 °C 下冷冻 1 小时。用无尘擦拭布覆盖锥形管口，代替盖子，并用橡皮筋固定，以利于高效冻干。</li>
		<li>在 -50 °C 下对脱细胞化组织进行冻干处理，持续 4 天。 
		注意：对于步骤 1.3，也应在相同条件下对 1 g 未脱细胞化的组织进行冷冻干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脱细胞组织的评估
注意：为了评估脱细胞组织中双链DNA（dsDNA）、糖胺聚糖（GAGs）和胶原蛋白的残留量与天然组织相比的情况，每批次检测至少需要1 g未脱细胞组织（天然组织）和1 g脱细胞组织。dsDNA、GAGs和胶原蛋白的含量可根据组织的干重进行计算。
<ol>
	<li>准备生化检测用溶液。
	<ol>
		<li>制备用于样品消化的木瓜蛋白酶溶液。 
		注意：缓冲液的配制量可根据样品数量进行调整。
		<ol>
			<li>将119 mg的0.1 M磷酸二氢钠、18.6 mg的0.5 mM Na₂-EDTA和8.8 mg的5 mM盐酸半胱氨酸溶解于10 mL灭菌水中。</li>
			<li>加入10 M NaOH溶液，调节溶液pH至6.5。</li>
			<li>向上述溶液中加入125 µL的10 mg/mL木瓜蛋白酶储备液，涡旋混匀，使各组分充分混合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备二甲基亚甲蓝（DMMB）检测用溶液。
		<ol>
			<li>配制DMMB染料：将8 mg的1,9-二甲基亚甲蓝氯化锌复盐、1.52 g甘氨酸和1.185 g NaCl溶解于500 mL灭菌水中。使用台式pH计监测pH变化，滴加0.5 M HCl溶液调节pH至3。随后通过500 mL瓶顶真空滤器过滤该溶液。</li>
			<li>配制15 µL的10 mg/mL硫酸软骨素A溶液作为标准品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备羟脯氨酸检测用溶液。
		<ol>
			<li>配制氯胺工作液：将2.4 g醋酸钠、1 g柠檬酸和0.68 g氢氧化钠溶解于24 mL蒸馏水中，加入240 µL冰醋酸、10 µL甲苯和6 mL异丙醇。 
			注意：使用涡旋混合器溶解所有粉末。氯胺工作液可在4 °C保存最多三个月。</li>
			<li>配制氯胺T溶液：将0.35 g氯胺T溶解于20 mL氯胺工作液中，加入2.5 mL异丙醇，涡旋混匀。 
			注意：需在使用前立即配制。</li>
			<li>配制P-DAB溶液：将3.75 g P-DAB溶于6.5 mL高氯酸和15 mL异丙醇中，用铝箔包裹。 
			注意：需在使用前立即配制。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，向10 mg冻干组织加入1 mL木瓜蛋白酶溶液，涡旋混匀以促进样品消化。</li>
	<li>将1.5 mL微量离心管置于橡胶架中，放入含有300 mL水的500 mL烧杯内，在60 °C条件下消化16小时。</li>
	<li>在9,500 x g条件下离心20分钟，收集上清液并转移至新管中。</li>
	<li>定量脱细胞组织中残留的DNA和主要蛋白质。
	<ol>
		<li>取1 µL消化后的样品加入分光光度计，按照制造商说明书测定双链DNA含量。 
		注意：实验人员应将头发扎起并佩戴口罩，以避免样品污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行DMMB检测以定量脱细胞组织中残留的糖胺聚糖（GAGs）含量。
	<ol>
		<li>取1 µL硫酸软骨素A溶液与499 µL 1x PBS混合配制标准品。用蒸馏水将硫酸软骨素A溶液稀释为0、4、8、12、16和20 µg/mL等不同浓度。</li>
		<li>将各浓度标准品及消化后样品各取50 µL，每组设三个复孔，加入96孔板中。</li>
		<li>使用多通道移液器向每孔加入200 µL DMMB染料。</li>
		<li>立即在酶标仪上读取525 nm处的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行羟脯氨酸检测以定量胶原蛋白含量。
	<ol>
		<li>取250 µL消化后的样品，加入等体积盐酸，在120 °C条件下孵育16小时。</li>
		<li>室温下干燥残余物3小时以冷却样品，然后用1 mL 1x PBS重新溶解样品。</li>
		<li>在4 °C条件下，以2,400 x g离心10分钟。</li>
		<li>配制100 µg/mL羟脯氨酸溶液作为标准品。</li>
		<li>用蒸馏水将羟脯氨酸标准品稀释为0、1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、30 µg/mL等不同浓度。</li>
		<li>将样品和标准品各取50 µL，每组设三个复孔，加入96孔板中。</li>
		<li>每孔加入50 µL氯胺T溶液，室温孵育20分钟。</li>
		<li>每孔加入50 µL p-DAB溶液，60 °C孵育30分钟。 
		注意：操作应在避光环境中分装。加样后用铝箔包裹96孔板。</li>
		<li>室温孵育30分钟。</li>
		<li>冷却后，在酶标仪上测定540 nm处的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生物墨水制备
注意：pdECM 粉末可在 -80 °C 下稳定保存至少一年。在调节 pH 值之前，消化后的 pdECM 溶液可在 -20 °C 下保存一个月。使用前，将冷冻的 pdECM 溶液样品在 4 °C 下过夜解冻。调节 pH 后的 pdECM 溶液可在 4 °C 下保存最多一周。消化后的 pdECM 溶液可在 4 °C 下保存至少数天，但不应超过一周。
<ol>
	<li>用胃蛋白酶消化冻干的 pdECM。
	<ol>
		<li>为了有效消化生物墨水，使用研钵和研杵在液氮中将冻干的 pdECM 粉碎。</li>
		<li>在 50 mL 锥形管中收集 200 mg pdECM 粉末，并加入 20 mg 胃蛋白酶和 8.4 mL 0.5 M 乙酸（终浓度为 2 w/v%）。</li>
		<li>将磁力搅拌子放入 50 mL 锥形管中，在 300 rpm 条件下搅拌 96 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节消化后 pdECM 溶液的 pH 值。 
	注意：为避免在调节 pH 前发生凝胶化，该步骤应在冰上进行。
	<ol>
		<li>在冰上使用正向置换移液器，通过 40 µm 细胞筛过滤 pdECM 溶液中的未消化颗粒，以获得最佳的消化效果。</li>
		<li>加入 1 mL 10x PBS，并在使用 NaOH 前进行涡旋振荡。</li>
		<li>使用 pH 指示试纸监测，用 10 M NaOH 将 pH 值调节至 7。 
		注意：每次加入 NaOH 后均需涡旋振荡，以确保生物墨水与其他试剂充分混合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流变学分析
<ol>
	<li>实验设置
	<ol>
		<li>制备1.5%（w/v）的pdECM生物墨水，用于评估其流变性能。</li>
		<li>在流变仪的速率控制模式下，建立20 mm锥板几何结构（锥板直径为20 mm，角度为2°）。</li>
		<li>在安装的软件（TRIOS）中创建实验序列，以测量pdECM生物墨水的黏度、凝胶动力学和动态模量。
		<ol>
			<li>黏度：将pdECM生物墨水置于平板上，在15 °C恒温条件下，以剪切速率从1至1,000 s-1递增的方式，测量pdECM生物墨水的复数黏度（Pa·s）。</li>
			<li>凝胶动力学：将pdECM生物墨水置于平板上，通过在4–37 °C范围内以5 °C/min的递增速率（时间扫描模式）测量pdECM生物墨水的储能模量和损耗模量，计算其复数模量（G*）。</li>
			<li>动态模量：将pdECM生物墨水在37 °C条件下预置于平板上60分钟，随后在2%应变条件下，测量其在0.1–100 rad/s频率范围内的储能模量（G'）和损耗模量（G''）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 利用胰岛进行胰腺组织构建物的3D细胞打印
<ol>
	<li>分离胰岛的制备
	<ol>
		<li>根据先前研究中描述的方案，从大鼠中分离原代胰岛5。</li>
		<li>为去除分离胰岛中的碎片和死细胞，将细胞悬液通过70 µm细胞筛。直径小于70 µm的胰岛被视为死亡或异常。</li>
		<li>将分离的胰岛悬浮于RPMI-1640培养基中，并置于培养皿内。在生物安全柜中，使用显微镜（4倍物镜）和P200移液器去除直径大于300 µm的胰岛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰岛包埋于pdECM生物墨水
	<ol>
		<li>制备pH调整后的pdECM生物墨水和分离的胰岛。 
		注意：为避免在pH调整前发生凝胶化，该步骤应在冰上进行。</li>
		<li>使用正向置换移液器轻轻混合pdECM生物墨水与含胰岛的培养基（比例为3:1），直至均匀混合。 
		注意：pdECM生物墨水的最终浓度为1.5%，胰岛在生物墨水中的密度为3,000 IEQ/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰腺组织构建物的3D细胞打印
	<ol>
		<li>准备一支灭菌注射器和22 G喷嘴。 
		注意：该规格喷嘴适用于打印直径为100–250 µm的胰岛。</li>
		<li>将负载胰岛的pdECM生物墨水装入注射器中。</li>
		<li>在18 °C条件下，以优化的打印参数（进给速率：150 mm/min；气动压力：15 kPa）打印成格子形状。</li>
		<li>为交联生物墨水，将打印后的构建物置于培养箱中孵育30分钟。</li>
		<li>将打印的构建物浸入胰岛培养基中，该培养基为添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 具有图案化结构的胰腺构建物的3D细胞打印
<ol>
	<li>两种生物墨水的制备
	<ol>
		<li>为验证使用多种生物墨水的打印通用性，制备两组pdECM生物墨水，并分别以1:20的比例向每种pdECM生物墨水中加入0.4%的台盼蓝和玫瑰红溶液进行染色。 
		注意：为避免在pH调节前发生凝胶化，该步骤应在冰上进行。</li>
		<li>使用正向置换移液器将pdECM生物墨水与悬浮有胰岛的培养基（比例为3:1）轻轻混合，直至均匀混合。 
		注意：pdECM生物墨水的最终浓度为1.5%，细胞密度为3,000 IEQ/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于多材料的胰腺组织构建物的3D细胞打印
	<ol>
		<li>准备灭菌的注射器和25 G喷嘴。</li>
		<li>将每种生物墨水（蓝色和红色）分别装入两个不同的注射器中。</li>
		<li>在18 °C条件下，以优化的打印参数（进给速率：150 mm/min；气动压力：15 kPa）打印生物墨水，形成蓝色与红色交替线条的晶格结构。</li>
		<li>为交联生物墨水，将打印后的构建物置于培养箱中孵育30分钟。</li>
		<li>将打印后的构建物浸入胰岛培养基中，该培养基为添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

本方案描述了pdECM生物墨水的制备以及利用3D细胞打印技术构建三维胰腺组织结构的方法。为了在三维工程化组织结构中重现目标组织的微环境，生物墨水的选择至关重要。在之前的研究中，我们已证实组织特异性的脱细胞细胞外基质（dECM）生物墨水有助于促进干细胞的分化与增殖10。与合成聚合物相比，由于dECM具有组织特异性的成分和结构，可为细胞提供更有利的微环境11。因此，脱细胞过程应被充分考虑，以最大程度保留dECM中的主要成分。
选择不同的去污剂对胰腺组织进行脱细胞处理，会影响残留细胞外基质（ECM）成分的组成12。在脱细胞过程中，我们注意到十二烷基硫酸钠（SDS）的使用可能导致ECM蛋白的丢失13。因此，我们对先前的方案进行了改进，去除了SDS溶液处理步骤。SDS是一种离子型表面活性剂，常用于多种清洗和脱细胞过程，但与其他去污剂（如Triton-X 100或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙...

近年来，胰岛移植已被视为治疗1型糖尿病患者的一种有前景的治疗方法。该治疗具有相对安全性和微创性，这是其显著优势1。然而，该方法仍存在若干局限性，例如胰岛分离的成功率较低以及免疫抑制药物带来的副作用。此外，由于移植后所处环境不利，移植胰岛的数量在术后持续减少2。为了克服这些困难，已将多种生物相容性材料应用于胰岛移植，如海藻酸盐、胶原蛋白、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）或聚乙二醇（PEG）。
由于具有巨大的潜力和高性能，3D细胞打印技术正在组织工程领域迅速发展。毋庸置疑，生物墨水被认为是提供适宜微环境、促进打印组织结构中细胞过程改善的关键组分。大量剪切稀化水凝胶，如纤维蛋白、海藻酸盐和胶原蛋白，已被广泛用作生物墨水。然而，与天然组织中的细胞外基质（ECM）相比，这些材料在结构、化学、生物学和力学复杂性方面仍显不足3。微环境信号（如胰岛与细胞外基质之间的相互作用）是增强胰岛功能的重要信号。脱细胞ECM（dECM）能够重建包含胶原蛋白、糖胺聚糖（GAGs）和糖蛋白等多种ECM组分的组织特异性组成。例如，保留其周围ECM（如I型、III型、IV型、V型和VI型胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白）的原代胰岛表现出较低的凋亡水平和更好的胰岛素敏感性，这表明组织特异性的细胞-基质相互作用对于增强其功能、使其更接近原始组织至关重要4。
本文阐述了制备源自胰腺组织的脱细胞细胞外基质（pdECM）生物墨水的方案，以提供有利于增强胰岛细胞活性与功能的微环境信号，随后介绍了利用基于微挤出的生物打印技术生成三维胰腺组织构建物的过程（图1）。

<table><tbody><tr><td>生物安全柜</td><td>CRYSTE</td><td>PURICUBE 1200</td><td></td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>957</td><td></td></tr><tr><td>数字式轨道摇床</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>DH.WSO04010</td><td></td></tr><tr><td>干燥箱</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WON-155</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>LABCONCO</td><td>7670540</td><td></td></tr><tr><td>冰箱</td><td>SAMSUNG</td><td>CRFD-1141</td><td></td></tr><tr><td>研磨器</td><td>ABM</td><td>1415605793</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>CRYSTE</td><td>PURISPIN 17R</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan GO</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>CF-5</td><td></td></tr><tr><td>多孔加热磁力搅拌器</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SMHS-6</td><td></td></tr><tr><td>纳米分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>pH 台式计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>流变仪</td><td>TA Instrument</td><td>Discovery HR-2</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Hirose</td><td>HC.13-122</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>HC.203-30</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 玻璃瓶</td><td>Scilab</td><td>SL.VI1243</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 L 烧杯</td><td>Dong Sung Science</td><td>SDS 2400</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 烧杯</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>KA.23-08</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 瓶顶式真空滤器</td><td>Corning</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 塑料容器</td><td>LOCK&amp;amp;LOCK</td><td>INL301</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>DAEKYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>擦镜纸</td><td>Kimtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>BA.37110-0003</td><td></td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SC.MG100</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4982000314</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>SPL</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1095350001</td><td></td></tr><tr><td>筛网滤器</td><td>DAIHAN Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脱细胞处理&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>4.7% 过氧乙酸</td><td>Omegafarm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>E0220 SAM</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（IPA）</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>samchun I0348</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Biosesang</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生化检测&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,9-二甲基亚甲蓝氯化锌复盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2018</td><td></td></tr><tr><td>氯胺-T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857319</td><td></td></tr><tr><td>硫酸软骨素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4384</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Supelco</td><td>46933</td><td></td></tr><tr><td>半胱氨酸盐酸盐（Cysteine-HCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Merok</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Na₂-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>S2097</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p4762</td><td></td></tr><tr><td>对苯二胺（P-DAB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2004</td><td></td></tr><tr><td>高氯酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Supelco</td><td>SX0607N</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生物墨水&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>特征明确的胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7215</td><td></td></tr><tr><td>玫瑰红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198250</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

源自胰腺组织的细胞外基质生物墨水用于打印三维含细胞胰腺组织构建物

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

胰岛移植是治疗伴有低血糖及继发性并发症的1型糖尿病患者的一种有前景的疗法。然而，胰岛移植仍存在若干局限性，例如由于胰岛植入效果不佳及所处微环境不利，导致移植胰岛的存活率较低。此外，由人多能干细胞分化而来的胰岛素生成细胞分泌足量激素以调节血糖水平的能力有限；因此，迫切需要通过在适当的微环境信号刺激下培养细胞来促进其成熟。本文详细阐述了制备来源于胰腺组织的脱细胞化细胞外基质（pdECM）生物墨水的实验方案，以提供有利于增强胰岛葡萄糖敏感性的微环境，随后描述了利用基于微挤出的生物打印技术构建三维胰腺组织结构的操作流程。

胰腺组织的脱细胞处理 
我们开发了制备胰腺脱细胞外基质（pdECM）生物墨水的流程，旨在为3D生物打印组织构建物中的胰岛提供胰腺组织特异性的微环境，以增强其功能（图2A）。经过脱细胞处理后，双链DNA（dsDNA）被去除97.3%，而胶原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）等代表性细胞外基质成分分别保留至原胰腺组织的1278.1%和96.9%（图2B）。
生物墨水制备 
为了在打印过程中应用pdECM，将pdECM粉末在弱酸中加入胃蛋白酶溶解，并使用10 M NaOH溶液中和。消化后的pdECM溶液可通过与细胞培养基或1×PBS混合进行稀释。在本研究中，我们制备了终浓度为1.5%的pdECM生物墨水...

脱细胞细胞外基质（dECM）可提供适宜的微环境信号，以在工程化结构中重现目标组织的固有功能。本文详细阐述了胰腺组织脱细胞的方案、来源于胰腺组织的dECM生物墨水的评估方法，以及利用生物打印技术构建三维胰腺组织结构的步骤。

胰岛移植是一种有前景的治疗方法，适用于伴有低血糖及继发性并发症的1型糖尿病患者。

pdECM生物墨水可通过组织特异性成分和结构为胰岛提供有利的微环境，并具有理想的神经生物学特性，可减少细胞死亡并提高其可打印性。该技术的主要优势在于，pdECM生物墨水中可保留组织特异性成分，促进三维胰腺组织构建物与包封胰岛之间的有益交互作用。将胰岛包封于pdECM生物墨水中的技术发展，可应用于可移植胰腺组织构建物的制备，用于治疗1型糖尿病。这种生物墨水可用于拓展可移植构建物以及用于糖尿病、糖尿病相关并发症和胰腺癌的体外组织模型的应用。对于冷冻猪胰腺组织样本的脱细胞处理，使用擦丝器将冷冻胰腺切成一毫米厚的片状，并将50克切好的组织转移至一个500毫升的塑料容器中。在4摄氏度下，用300毫升蒸馏水在数字轨道摇床上以每分钟150转的速度洗涤组织，持续约12小时。当浑浊的水消失后，将水替换为400毫升含1% Triton-X 100的PBS溶液，处理84小时。去污剂处理结束后，用400毫升异丙醇孵育组织2小时，以去除胰腺中残留的脂肪，随后用400毫升PBS洗涤24小时。洗涤结束后，用400毫升含0.1%过氧乙酸和4%乙醇的溶液对脱细胞组织进行2小时的灭菌处理，然后用400毫升新鲜PBS洗涤6小时，以彻底清除残留的去污剂。洗涤结束后，使用镊子将组织块转移至一个50毫升的锥形管中，并在-80 °C条件下重新冷冻样品1小时。然后用橡皮筋固定无尘擦拭布覆盖锥形管，并在-50 °C条件下对脱细胞组织进行为期四天的冷冻干燥。为制备生物墨水，将200毫克冻干的pdECM转移至一个新的50毫升锥形管中，加入20毫克胃蛋白酶和8.4毫升0.5摩尔的乙酸溶液至组织样品中。然后将一个磁力搅拌子放入管中，在300转/分钟的条件下进行96小时的搅拌孵育。孵育结束后，使用40微米细胞滤筛和正向置换移液器将溶液过滤至预置冰上的新管中，以去除未消化的颗粒，并向管中加入1毫升10X PBS。涡旋混匀后，用氢氧化钠调节溶液pH至7。为了制备具有图案化结构的胰腺构建物的3D细胞打印用生物墨水，将一份pdECM生物墨水 aliquot 用0.4%台盼蓝染色，另一份aliquot 按1:20比例加入玫瑰红溶液染色。然后使用正向置换移液器，将每种生物墨水溶液与含有悬浮胰岛的培养基按3:1比例轻柔混合，最终获得浓度为1.5%的生物墨水，细胞密度为每毫升3×10³胰岛当量。对于基于多材料的胰腺组织构建物的3D细胞打印，将每种生物墨水-胰岛混合物分别装入配备25号喷嘴的无菌注射器中，并在18 °C优化打印条件下进行3D打印，形成蓝色与红色交替线条的晶格结构。为交联生物墨水，将打印好的结构置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育30分钟。随后将打印结构浸入添加了10%胎牛血清以及每毫升100单位青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中。脱细胞处理后，双链DNA被去除97.3%，而胶原蛋白和糖胺聚糖等代表性细胞外基质成分则分别保留至天然胰腺组织的1278.1%和96.9%。在此代表性分析中，pdECM 生物墨水表现出剪切稀化行为，在剪切速率为每秒1次时，其值约为10帕斯卡每秒，表明该生物墨水具备通过喷嘴挤出所需的适宜流变特性。此外，当温度达到15摄氏度时，该生物墨水的复数模量开始上升，并在温度维持在37摄氏度时迅速增加，表明溶液发生了溶胶-凝胶转变。在生理相关温度下检测了pdECM生物墨水的动态储能模量（G′）和损耗模量（G″），以确保其在打印过程后的稳定性，结果表明在频率扫描条件下可获得稳定的模量。利用多喷头打印系统，可制备多种类型的3D结构，如使用所开发的pdECM所展示的那样，体现了pdECM在3D生物打印中的多功能性，可用于在类组织结构中协调两种或多种活体组织。将生物墨水与细胞混合时应轻柔操作，避免细胞死亡和气泡形成，因为气泡的存在会降低打印分辨率并减少细胞存活率。可通过免疫荧光染色或葡萄糖耐受试验评估3D胰腺组织构建物中包封的胰岛细胞的功能性。这种pdECM生物墨水和3D生物打印技术有望用于组织工程领域功能性胰腺组织构建物的开发。研究人员在操作锋利的研磨器和试剂时，应佩戴适当的个人防护装备，以防止受伤。

pancreatic-tissue-derived-extracellular-matrix-bioink-for-printing-3d

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于打印 3D 细胞-拉丹胰腺组织构造的胰腺组织衍生细胞外基质生物墨水

设计并制造了一种笛卡尔式生物打印机，可实现多种材料在精确且可重复的几何形状中的沉积，同时允许对环境因素进行控制。利用该三维生物打印机，可打印出复杂且具有活性的结构，并能够轻松实现重复制备。...

使用三喷头笛卡尔打印机进行细胞构建物生物打印的活性研究

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外...

使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

本文介绍了一种制备胰腺癌细胞与成纤维细胞三维（3D）球体共培养物的方法，随后利用细胞外通量分析仪测定其代谢功能。...

胰腺癌细胞与成纤维细胞三维球体共培养物的制备及代谢分析

使用基于纳米纤维素-海藻酸盐的生物墨水对软骨和皮肤类似物进行生物打印。打印前通过单步被动混合装置对生物墨水进行细胞接种。结果显示，所构建的组织结构细胞分布均匀，细胞活力高，并表现出良好的分化标志物。...

利用新型被动混合单元技术实现生物墨水预细胞化的软骨与皮肤组织类似物生物打印

本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5...

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

我们开发了一种异质性乳腺癌模型，该模型由永生化的肿瘤细胞和成纤维细胞嵌入可生物打印的海藻酸盐/明胶生物墨水中构成。该模型可重现 体内...

可生物打印的海藻酸盐/明胶水凝胶3D 体外 模型系统诱导细胞球体形成

本方案描述了制备嵌入含有脱细胞基质（DM）的聚乳酸（PLA）微球的聚己内酯（PCL）丝材的方法，用于3D打印结构组织工程支架。...

用于3D打印脱细胞基质的新工艺

本文展示了一种易于使用的核/壳式三维生物打印装置，可一步法制备中空支架，适用于血管及其他管状结构的组织工程。...

用于管状结构组织工程的核/壳打印支架

本方案重点介绍了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料油墨与小鼠骨髓来源肥大细胞生物相容性的方法，主要考察细胞活力以及细胞表面受体Kit（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。...

用于骨髓来源肥大细胞培养的结晶纳米纤维素嵌入琼脂糖生物材料油墨的制备

利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

了解使用胰腺组织衍生细胞外基质生物墨水进行3D生物打印的方法，用于构建可移植胰腺组织以治疗1型糖尿病。该技术保留组织特异性成分，为胰岛细胞提供最佳微环境。

源自胰腺组织的细胞外基质生物墨水用于打印三维含细胞胰腺组织构建物

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