Name: 研究肿瘤分泌性副体结扎对宏噬细胞活化的影响，使用可渗透膜支架共培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学习使用Transwell共培养技术研究肿瘤旁分泌信号对巨噬细胞活化的抑制作用。该方法通过可渗透膜实现无细胞接触培养，支持qRT-PCR、ELISA和Western blot等下游分子分析，有助于揭示肿瘤免疫逃逸机制。

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Eric Ubil 的部分经费来自美国癌症协会博士后奖学金（128770-PF-15-216-01-LIB）。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01-CA205398）以及乳腺癌研究基金会（BCRF-18-041）授予 HSE 的奖项支持。

所有与小鼠腹腔巨噬细胞的收获和使用相关的操作均在北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC）进行，并经该校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 巨噬细胞培养
注意：本实验可使用原代腹腔巨噬细胞（下文将详细描述）、骨髓来源巨噬细胞，或巨噬细胞系，如 J774（ATCC）或 RAW264（ATCC）。
<ol>
	<li>按照先前所述方法收获腹腔巨噬细胞16,17，并直接接种于0.4 µm聚酯膜插入式共培养6孔板的上室（图1A）。 
	注意：每次分离获得的巨噬细胞数量约为1 × 106个细胞，因此在6孔板中每孔平均接种约1.5–1.6 × 105个细胞。</li>
	<li>将收获的巨噬细胞在杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）/F12中培养，添加10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素和20 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），于37 °C、5% CO2条件下培养3天。 
	注意：上室加入1 mL培养基，下室加入1.5 mL培养基，需分别为两个腔室添加培养基。</li>
</ol>
2. 肿瘤细胞与巨噬细胞的共培养
<ol>
	<li>使用前，按照 ATCC 推荐的组织培养方法，在相应的培养基中培养 commercially available 肿瘤细胞。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁肿瘤细胞一次，加入 0.05% 胰蛋白酶 + 乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 下孵育至细胞脱落。将细胞重悬于含胎牛血清（FBS）的培养基中，使用血细胞计数板或细胞计数仪定量总细胞数，然后在 220 × g 条件下离心 5 分钟以形成细胞沉淀。</li>
	<li>离心过程中，吸去含巨噬细胞的可渗透膜支持板上下室中的培养基，并更换为新鲜培养基。
	<ol>
		<li>对于将要接种肿瘤细胞的下室，加入 1 mL 培养基而非 1.5 mL，以便为后续加细胞留出足够的体积空间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸去细胞沉淀中的培养基，将细胞重悬于含 10% FBS、1× 青霉素/链霉素和 20 ng/mL M-CSF 的 DMEM/F12 培养基中，调整细胞浓度为 3 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>向目标孔的下室中加入 0.5 mL 浓度为 3 × 105 个细胞/mL 的肿瘤细胞（图 1B）。 
	注意：细胞可立即进行处理。</li>
</ol>
3. 共培养细胞的处理
<ol>
	<li>为诱导巨噬细胞促炎基因表达，可通过加入 100 ng/mL IFNγ 和 50 ng/mL LPS 处理单培养或共培养的巨噬细胞。
	<ol>
		<li>根据需要调整培养中的处理时间。巨噬细胞激活在 2 小时内发生，而某些肿瘤介导的抑制效应在 8 小时内出现。共培养 24 小时可获得显著且稳定的肿瘤来源抑制效应。 
		注： alternatively，可通过添加白细胞介素-10（IL10）等因子诱导巨噬细胞转化为促伤口愈合表型，并评估肿瘤分泌配体的作用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>作为阴性对照，将巨噬细胞进行单培养且不予处理。作为阳性对照，用 100 ng/mL IFNγ 和 50 ng/mL LPS 处理单培养的巨噬细胞。</li>
</ol>
4. 共培养细胞的下游分析
<ol>
	<li>在完成所需的孵育时间后，根据检测需求，收集细胞裂解液或条件培养基。</li>
	<li>若需提取细胞裂解液用于定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，吸除孔中两个腔室的培养基，并用 2 mL PBS 洗涤一次。向含有巨噬细胞的上层腔室加入RNA裂解缓冲液。轻轻刮取膜以释放细胞裂解液，并转移至收集管中，按照RNA提取试剂盒制造商的说明书进行后续处理。</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
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<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍的共培养实验方法是对已有实验方法的改进，可用于研究肿瘤细胞分泌因子对免疫细胞活化的影响。尽管已知细胞间的直接接触可引起免疫活性的变化，但肿瘤分泌的配体对免疫活化调控的作用机制仍了解较少。本文描述的方法不同于直接共培养，能够排除细胞接触介导信号传导的干扰，专门用于探究肿瘤来源的分泌因子如何影响免疫细胞的活化。鉴于肿瘤分泌配体在免疫抑制中的潜在临床重要性，该方法提供了一种简便易用的工具，可用于研究直接共培养无法解决的此类机制问题。
该共培养方法的核心是将巨噬细胞（原代细胞：腹腔驻留细胞、骨髓来源细胞或巨噬细胞系）与肿瘤细胞（细胞系或原代细胞）在无物理接触的条件下进行共同培养。关键在于，需将巨噬细胞培养于孔径为0.4 µm的聚酯膜插入式培养小室上，以允许肿瘤细胞分泌的配体自由通透，同时防止巨噬细胞可能通过滤膜发生迁移。此外，向上下两层培养室中加入指定体积的培养基也至关重要，以确保细胞获得充分的覆盖面积。实验设计时还需考虑设置仅含一种细胞类型的对照组，这是共培养实验规划中的另一个关键因素。其他若干因素（下文将详细描述）也可能影响检测结果，因此在研究设计过程中必须充分考虑每一项因素。...

近期研究聚焦于癌细胞逃避免疫细胞识别、抑制局部免疫活化，或在肿瘤微环境中形成具有免疫耐受性的促瘤环境的能力。已有研究描述了两类广泛的肿瘤细胞与免疫细胞相互作用，可促进上述效应：接触依赖性相互作用或肿瘤分泌的配体。其中，肿瘤所利用的接触介导免疫抑制机制中，研究最为深入且具有临床可行性的机制之一是PD-L1的表达，PD-L1可与T细胞上的PD-1相互作用，从而抑制T细胞的活化与功能1,2。在干扰素-γ（IFNγ）刺激下——该因子由多种活化的免疫细胞表达——肿瘤细胞可上调PD-L1的表达，诱导表达PD-1的活化T细胞发生耗竭，从而阻止其有效清除肿瘤细胞3。目前临床上已采用抗体阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用，用于治疗多种人类癌症4。鉴于此类临床成功及其他相关进展，识别并靶向肿瘤来源的免疫抑制机制正受到越来越多的关注。
除了抑制适应性免疫外，肿瘤还被证实会分泌多种因子，以抑制先天免疫细胞的促炎反应。肿瘤来源或肿瘤诱导产生的分泌物，包括IL-6、IL-10、VEGF、IL-23以及集落刺激因子（CSF-1），已被证明可抑制自然杀伤（NK）细胞、粒细胞和树突状细胞在肿瘤微环境中的抗肿瘤反应5,6,7。肿瘤细胞还可分泌因子，促使髓系来源细胞在肿瘤微环境中的募集和分化发生偏移，从而促进对T细胞活化的抑制8,9。
一种对肿瘤进展具有显著影响的天然免疫细胞是巨噬细胞。多年来，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的存在一直被用作患者生存预后的负面指标10。关于免疫抑制性TAMs会抑制免疫细胞介导的肿瘤清除作用的概念早在40多年前就已提出11。最近的研究表明，在肿瘤微环境中，巨噬细胞的促炎反应可被下调，同时可诱导其产生促肿瘤表型。这些免疫抑制性巨噬细胞可促进耐受性免疫反应，推动肿瘤进展并对化疗和免疫治疗产生抵抗12。鉴于巨噬细胞通常是肿瘤内最丰富的白细胞之一，恢复其针对肿瘤的免疫活性成为抗癌治疗的一个潜在靶点13。
虽然肿瘤细胞与巨噬细胞之间的接触介导相互作用可通过直接共培养进行建模，但使用通透性膜支持物可以揭示哪些由肿瘤分泌的因子具有免疫调节功能，同时避免肿瘤细胞与免疫细胞直接接触所带来的潜在干扰。采用类似的方法，已有研究展示了鉴定小胶质细胞/神经元相互作用14以及肿瘤细胞与间皮细胞相互作用15中分泌因子的潜力。我们此前也成功应用该共培养技术，证实了一种由肿瘤分泌的蛋白质Pros1在脂多糖（LPS）和干扰素-γ刺激腹腔巨噬细胞后，可抑制促炎基因表达的作用16。本文中，我们描述了一种简便的方法，可用于探究肿瘤分泌因子如何影响巨噬细胞的活化。

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>cDNA合成试剂盒</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12培养基</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Millipore</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌O111:B4脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>小鼠M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pros1 ELISA试剂盒</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠IFN&amp;gamma;</td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX试剂盒</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Transwell可渗透支持膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

利用可渗透膜支持物共培养研究肿瘤分泌的旁分泌配体对巨噬细胞活化的影响

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

肿瘤来源的旁分泌信号是局部免疫抑制中一个被忽视的重要组成部分，可导致有利于癌症持续生长和转移的微环境。旁分泌信号可能涉及不同类型细胞之间的直接接触，例如肿瘤细胞表面表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1直接相互作用，也可能涉及肿瘤细胞分泌配体以影响免疫细胞。本文介绍一种共培养方法，用于研究肿瘤分泌的配体对免疫细胞（巨噬细胞）活化的影响。该方法操作简便，使用市售的0.4 µm聚碳酸酯膜通透性支持物和标准组织培养板。在本方案中，巨噬细胞培养于上室，肿瘤细胞培养于下室。0.4 µm的物理屏障允许在排除细胞间直接接触干扰的情况下研究细胞间信号传递，同时使两类细胞共享培养基并暴露于相同的旁分泌配体环境中。该方法可与其他技术联合使用，例如通过基因改造巨噬细胞（如从基因敲除小鼠中分离巨噬细胞）或肿瘤细胞（如CRISPR介导的基因编辑），以研究特定分泌因子及其受体的功能。此外，该体系适用于常规分子生物学分析方法，如定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）或蛋白质印迹分析（Western blot），无需通过流式分选分离两种细胞群体。同样可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测分泌型配体的水平，以更深入理解多细胞类型背景下细胞信号动态交互过程。共培养时间也可根据研究需求灵活调整，以分析时间依赖性调控事件。该共培养体系是一种强有力的工具，有助于在免疫背景下深入研究肿瘤分泌的信号分子。

为确定肿瘤分泌的配体对巨噬细胞极化的影响，采用了上述实验方法。将未与肿瘤细胞共培养的腹腔巨噬细胞作为阴性对照（未处理组 = 最左侧）和阳性对照（IFNγ与LPS刺激组 = 第二列）nd 从左至右）对照组（图 2A）。或者，将腹腔巨噬细胞与B16F10黑色素瘤细胞（ATCC）共培养（图1A）。铺板后立即用IFNγ和LPS处理部分细胞，其余细胞不作处理。培养24小时后，收集巨噬细胞，提取RNA并进行qRT-PCR，以检测促炎基因的表达水平。利用本研究所述的共培养系统，我们发现，在无激活刺激物（LPS + IFNγ）的情况下，与B16F10肿瘤细胞共培养的腹腔巨噬细胞并未上调促炎相关基因的表达图2A，B16F10细胞膜/未处理）。这表明肿瘤分泌的配体本身：1）不足以诱导促炎基因表达，或2）即使肿瘤分泌物引起免疫激活，旁分泌配体也足以将其抑制至初始水平。该共培养方法表明，当经IFNγ和LPS极化的巨噬细胞与肿瘤细胞共同培养时，炎症相关基因表达的抑...

本文介绍一种利用可渗透膜支持物的方法，以促进研究肿瘤细胞通过非接触性旁分泌信号抑制免疫反应的机制。该系统适用于研究肿瘤分泌因子在抑制巨噬细胞活化中的作用。

肿瘤来源的旁分泌信号是局部免疫抑制中一个被忽视的组成部分，可导致有利于癌症持续发展的微环境……

这种Transwell共培养方法用于研究肿瘤细胞通过旁分泌信号抑制免疫反应的机制。该方法可用于发现新的分泌型配体及其免疫抑制作用的分子机制。我们此前已利用该方法证明了肿瘤细胞分泌的因子如何抑制巨噬细胞的促炎基因转录。我们认为，该工具在肿瘤来源的免疫抑制研究中具有广泛的应用前景。该技术的主要优势之一在于，可在排除细胞间直接接触这一潜在干扰因素的情况下，用于研究肿瘤细胞与免疫细胞之间的旁分泌信号传导。此外，该平台还可兼容多种分子生物学技术，适用于后续分析。收集腹腔巨噬细胞后，立即将其接种至0.4微米聚酯膜插入式共培养六孔板的上室中。然后向孔中加入含补充物的DMEM培养基，使上室含有1毫升，下室含有1.5毫升。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育三天。首先，按照 ATCC 推荐的组织培养方法，在相应的培养基中培养 commercially available 肿瘤细胞。接着，用 PBS 清洗贴壁肿瘤细胞一次。加入含 EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶，于 37°C 孵育，直至细胞脱落。然后将细胞重悬于含有胎牛血清（FBS）的培养基中。使用血细胞计数板或细胞计数仪对细胞总数进行定量，并在220 × g条件下离心5分钟以形成细胞沉淀。在离心过程中，吸去含有可渗透膜支持板的巨噬细胞培养板上下室中的培养基，并更换为新鲜培养基。对于将要接种肿瘤细胞的下室，加入一毫升培养基而非1.5毫升，以留出足够的体积用于后续加细胞。离心完成后，吸除沉淀肿瘤细胞中的培养基，并将细胞重悬于添加了补充物的DMEM培养基中，浓度为每毫升300,000个细胞。取0.5毫升该细胞悬液加入至所需孔板的下室中。为诱导巨噬细胞促炎性基因表达，可通过添加浓度为 100 纳克/毫升的干扰素γ和浓度为 50 纳克/毫升的脂多糖（LPS），对单培养或共培养的巨噬细胞进行单独或联合处理。根据需要调整培养中的处理时间。巨噬细胞激活在 2 小时内发生，而部分肿瘤介导的抑制作用在 8 小时内出现。共培养24小时可获得稳定且一致的肿瘤来源抑制效应。作为阴性对照，单独培养巨噬细胞且不进行任何处理。作为阳性对照，使用与实验样品相同浓度的干扰素γ和脂多糖（LPS）处理单独培养的巨噬细胞。在完成所需的孵育时间后，根据检测需求，收集细胞裂解液或条件培养基。若需为定量聚合酶链式反应分析提取细胞裂解液，需吸除孔板中两个腔室的培养基，并用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次。向含有巨噬细胞的上层腔室中加入RNA裂解缓冲液。此后，轻轻刮取膜以释放细胞裂解物，并将其转移至收集管中，按照RNA提取试剂盒制造商的说明书进行后续处理。此处描述的共培养方法涉及在无物理接触条件下培养巨噬细胞和肿瘤细胞。在无肿瘤细胞条件下培养的腹腔巨噬细胞用作阴性对照和阳性对照。在存在B16F10肿瘤细胞但无激活刺激的条件下共培养时，腹腔巨噬细胞并未增加促炎相关基因的表达。这表明肿瘤分泌的配体本身不足以诱导促炎基因的表达，或者即使肿瘤分泌物引发了免疫激活，旁分泌配体也足以将其抑制至基础水平。该共培养方法表明，当经干扰素γ和LPS极化的巨噬细胞在肿瘤细胞存在下培养时，炎症相关基因表达的抑制程度可降低达60%。当用小鼠巨噬细胞系J774替代腹腔巨噬细胞时，同样观察到相当水平的巨噬细胞促炎基因抑制。既往研究已确定蛋白S是一种由肿瘤分泌的因子，能够抑制巨噬细胞的活化，因此采用可渗透膜支持的共培养模型，并结合lysA检测24小时后条件培养基中蛋白S的浓度。在经干扰素γ和LPS处理的B16F10黑色素瘤细胞的条件培养基中，蛋白S的表达浓度约为每毫升475纳克。在相同条件下处理的腹腔巨噬细胞中，蛋白S的表达浓度约为每毫升61纳克。有趣的是，在共培养条件下，经干扰素γ和LPS处理的孔中蛋白S的浓度约为86纳克/毫升。这表明巨噬细胞可能摄取了肿瘤细胞分泌的蛋白S，或者当B16F10细胞与巨噬细胞共存时，其分泌的蛋白S量显著减少。这些结果凸显了巨噬细胞与肿瘤细胞共培养时，巨噬细胞活化及旁分泌信号传导发生的显著变化。Transwell 共培养方法可用于解答与旁分泌信号相关的多种问题。可通过 Western 印迹分析来确定肿瘤分泌的蛋白质如何改变巨噬细胞中的各种信号通路。

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研究肿瘤分泌性副体结扎对宏噬细胞活化的影响，使用可渗透膜支架共培养

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共培养实验研究巨噬细胞和小胶质细胞对胶质母细胞瘤侵袭的促进作用

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

本文介绍了一种三维培养方法，用于分析原代乳腺癌细胞的形态，以及研究它们与单核细胞的直接/间接相互作用及其结果，例如胶原降解、免疫细胞募集、细胞侵袭和促进癌症相关炎症。...

基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

旁分泌和邻分泌细胞相互作用在多种生物过程中发挥重要作用，包括肿瘤进展、免疫应答、血管生成以及发育过程。本文采用一种邻近培养方法来研究旁分泌信号传导，该方法可在防止细胞直接接触的同时，维持分泌因子的局部浓度。...

一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的近端共培养方法

本文介绍了一种有效的体外实验方法，用于评估肿瘤细胞条件培养基吸引巨噬细胞的能力。...

体外实验研究肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用

本研究对巨噬细胞针对癌细胞（特别是4T1小鼠乳腺癌细胞）的吞噬活性进行了成像。通过荧光显微镜与微分干涉差显微镜联用，建立并观察了活细胞共培养模型。利用成像软件对这一评估过程进行成像，生成了多点时间延时视频。...

共培养体系中M1型巨噬细胞与4T1小鼠乳腺癌细胞吞噬活性的延时二维成像

本文介绍了一种研究原代人单核细胞来源的巨噬细胞与三维（3D）I型胶原基质中肿瘤球体相互作用的实验方案，可用于比较微环境的可溶性因素和物理特性对细胞侵袭的影响。...

巨噬细胞-肿瘤类球体共侵袭实验

鉴于可用于研究人源CART细胞与髓系细胞相互作用的异种移植模型有限，我们建立了 体外 和 体内...

研究髓系细胞与CAR T细胞之间的相互作用 体外 和 在体 内

学习使用Transwell共培养技术研究肿瘤旁分泌信号对巨噬细胞活化的抑制作用。该方法通过可渗透膜实现无细胞接触培养，支持qRT-PCR、ELISA和Western blot等下游分子分析，有助于揭示肿瘤免疫逃逸机制。

利用可渗透膜支持物共培养研究肿瘤分泌的旁分泌配体对巨噬细胞活化的影响

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