实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

该方法有助于解答关于基因表达动态在细胞增殖和分化过程中重要性的关键问题，特别是Notch信号分子在神经干细胞中的动态变化。该技术的主要优势在于，我们可以通过活体成像技术以极高的精度在体外和体内实时监测基因表达。本次实验操作将由我实验室的助理教授下条博美（Hiromi Shimojo）进行演示，她正是这项新技术的开发者。

为了将 Dll1 F 荧光素酶报告基因导入神经前体细胞（NPC），在进行手术前，需确认胚胎第12.5至14.5天的妊娠小鼠对足底反射无反应，然后沿腹中线做2至3厘米的切口。将PBS浸湿的纱布放置于切口周围，使用环形镊子小心地取出右侧子宫角。计数胚胎后，用微毛细管向每个胚胎端脑的脑室注射1至2微升混合的 Dll1 F 荧光素酶报告基因DNA。

成功的注射将导致在子宫表面观察到蓝色染料。进行电穿孔时，用 PBS 湿润子宫和电极，轻轻夹住第一个胚胎的头部。将带正电的电极置于注射了 DNA 的半球侧，施加五次 30 至 50 伏、50 毫秒的脉冲，每次脉冲之间间隔 1 秒，并观察负电极是否产生气泡以确认操作有效。

当所有胚胎注射完成后，将左侧子宫角放回腹腔，并使用17毫米针头用4-0丝线缝合切口，在缝合完成前向腹腔内注入温热的PBS。为建立解离的NPC培养体系，首先将妊娠12.5至14.5天的Dll1泛素化荧光素酶转基因小鼠的子宫置于含有25毫升冰冷PBS的10厘米培养皿中，使用显微剪刀和精细镊子将胚胎从子宫中取出。胚胎去头后，将头部放入另一个含有冰冷DMEM/F12的10厘米培养皿中，并去除包围每个脑组织的表皮和软骨。

在解剖显微镜下，将脑组织转移至含有3毫升冰上预冷的N2B27培养基的35毫米培养皿中。分离端脑的左右两侧与间脑。使用精细镊子去除覆盖在端脑表面的脑膜，并从端脑中分离出大脑皮层的背外侧部分。

当所有目标神经组织均已分离后，使用 P1000 移液器将样品转移至各自的 1.5 毫升离心管中，并使用 P200 移液器吸除每管中的多余培养基。每对皮层组织加入 100 微升木瓜蛋白酶溶液，将样品置于 24 摄氏度环境中孵育 15 分钟。孵育结束后，用新的 P1000 移液器轻柔吹打样品 10 次，然后将离心管再次放回 24 摄氏度环境中继续孵育 15 分钟。

孵育结束后，在通过离心收集消化组织前，轻轻吹打混匀各样本。吸除上清液，并用一毫升 DMEM/F12 培养基轻轻重悬每一份沉淀。按上述方法再进行三次离心，每次离心后均用一毫升新鲜培养基轻轻重悬沉淀。

最后一次离心后，将沉淀重悬于500微升含有1毫摩尔荧光素的N2B27培养基中，并将每个样本的一乘以十的六次方个细胞接种至各自涂有聚-L-赖氨酸的玻璃底培养皿中。然后，将培养皿置于细胞培养箱中孵育1小时。待细胞贴壁后，向每孔加入2毫升新鲜N2B27培养基和1毫摩尔荧光素。

为了在NPC解离培养物中观察荧光素酶报告基因的表达，选择油浸物镜，并将样品皿放置在显微镜载物台上。手动观察视野，确定观察细胞的最佳位置，并对准目标细胞进行聚焦。点击“Live”以获取测试图像，然后使用多维采集程序进行连续24小时的时间序列采集，包括二维生物发光和明场图像的同步获取。

为制备发育中皮层的脑片培养物，在注射报告基因后一天，按照所示方法收获胚胎第13.5至14.5天的胚胎脑组织，并将盛有脑组织的培养皿置于荧光体视显微镜的载物台上。在适当的激发光下确认每个皮层均表达所注射的荧光报告基因，随后将脑组织转移至盛有30毫升DMEM/F12培养基的硅胶橡胶切割板中，该培养基预先用100%氧气气体持续通气。使用显微外科刀和精细镊子切开背侧端脑内侧与外侧部分之间的边界，并将组织分离为两个半球。

然后，使用刀片将皮层切成条纹状以获取皮层切片，并在获取切片的同时将其从砧板转移至含有培养基的新35毫米培养皿中。当所有切片收集完毕后，将每个切片的切割面朝下放置于置于玻璃底培养皿中的培养插件上，该培养皿内含有富集培养基，必要时用精细镊子调整每个切片的方向。接着，用移液器去除多余的培养基，并将培养皿放入多气体培养箱中，设置条件为40%氧气、5%二氧化碳、37摄氏度，孵育30分钟。

孵育结束后，向培养皿中加入 300 微升添加了 1 毫摩尔荧光素的富集培养基。为观察切片培养物中的荧光素酶报告基因表达，选择 40 倍物镜，并将样品皿放置于显微镜载物台上。在相应激发光照射下，获取荧光的测试图像，并将成像位置和焦平面设定至目标区域。

然后，通过三维生物发光、荧光和明场成像连续采集24小时的时间序列图像。为了监测振荡基因 Dll1 的启动子活性，可使用泛素化的荧光素酶——一种半衰期约为10分钟的不稳定荧光素酶报告蛋白。与荧光报告蛋白类似，荧光素酶报告蛋白也可通过与目标基因编码序列融合，用于监测蛋白质的表达动态。

为了在组织培养中于单细胞水平可视化报告基因的表达，可通过子宫内电穿孔将报告基因瞬时转染到神经前体细胞（NPCs）中，如本实验所示。此外，基于显微镜的成像技术可获取明场、荧光和化学发光图像。在端脑来源的 Dll1 泛素化 F 荧光素酶报告小鼠的 NPCs 中，Dll1 启动子活性的报告基因表现出振荡性表达，其中不稳定的荧光素酶报告基因显示出启动子活性表达的急剧上升和下降调控。

在观察过程中，相邻的增强型绿色荧光蛋白阳性细胞（携带 Hes1 报告基因）与表达 Dll1 蛋白报告基因的 mCherry 阳性细胞发生接触后，Hes1 报告基因的表达大约在接触后 60 分钟开始出现，提示相邻细胞间 Notch 信号传递的时间延迟约为一小时。此外，在信号传递过程中，Dll1 蛋白的表达表现出动态的转位现象。进行生物发光成像时，应保持显微镜室完全黑暗，因为外界光线可能影响最佳成像效果的获取。

光遗传学领域的最新进展使我们能够利用光来控制基因表达。通过该技术，我们可以同时引入多种基因表达模式，并监测荧光素酶报告基因的响应。