利用基于表观遗传学的定量PCR确定免疫细胞特性和纯度
February 19th, 2020
在这里，我们描述了一种通过使用定量PCR（qPCR）检测的表观遗传特征来确定免疫细胞特性和纯度的可靠方法。特定位点的脱甲基化作为特定细胞类型的唯一标识符，允许识别CD8+、调节或Th17 T细胞。
该协议为确定免疫细胞特性和纯度提供了一种标准化的方法，并解决了流式细胞学的局限性，如样品要求大、用户对用户变异性高、主观数据分析等。此检测包括一个自动化数据分析模板，允许用户客观地评估免疫细胞的身份和纯度。这与多重检测控制一起，为评估免疫细胞特性和纯度提供了一种易于标准化的交钥匙方法。
展示这项技术的将是杰里·古兹曼，一位实验室的科学家。从感兴趣的造血细胞样本中分离出基因组DNA后，使用基因组DNA的微升，通过获得260、280和230纳米的光学密度，测量分光光度计上样品的纯度。接下来，将400至1200纳米的基因组DNA样本稀释至142微升的最终体积，从基因组DNA分离试剂盒中用洗脱缓冲液。
将校准器的 75 微升添加到 67 微升的洗脱缓冲液中。将参考基因组DNA的1200纳米图稀释至142微升的微升和洗脱缓冲液。然后在56摄氏度下孵育管子5分钟，在热混合器中每分钟孵育900转。
对于双硫酸盐的转化，在所有管中加入270微升的二硫化铵和90微升的THFA。并涡流管，以确保彻底混合。简要地旋转样品以收集液体，并在 80 摄氏度和每分钟 900 转时将管放入热混合器中 45 分钟。
然后再次短暂地旋转样品，让样品冷却到室温三到五分钟。对于双硫纤维转化后DNA纯化，涡流DNA分离顺磁珠30秒。根据瓶子上列出的体积，在洗涤缓冲液中加入乙醇和异丙醇。
再次涡流，直到珠子被完全重新暂停，并在870微升的解结结合缓冲液和105微升的DNA结合顺磁珠到每个管。在短暂旋转样品之前，将管子搅拌。在每个管中加入570微升2丙醇，通过涡流混合。
在室温下孵育管7分钟，每分钟50 RPM，然后再次短暂地旋转管子，并将它们放在磁性机架上5分钟。在孵育结束时，在不干扰珠子的情况下取出超生。用缓冲液 1 清洗样品，然后旋转管。
短暂离心后，将管子放回机架中三分钟，在不干扰珠子的情况下取出超生。用洗涤缓冲液 2 清洗样品两次，在 65 摄氏度下干燥管管 15 分钟。接下来，向每个管添加 60 微升进化缓冲液。
在室温下孵育7分钟后，每分钟旋转1400次，短暂地旋转管子，将管子返回磁铁两分钟。在孵化结束时，55微升的二硫化基将含有的DNA转化为新管，而不会干扰珠子。若要在样本上运行定量 PCR，请在定量 PCR 软件中为每个标准分配任务标准，并根据表指定最终副本编号。
准备标准DNA的序列稀释，并为目标细胞类型准备一种定量PCR主混合鸡尾酒。和一个定量的PCR大师混合鸡尾酒为GAPDH，根据表。将模板DNA的三微升加载到96孔圆底板的适当孔中，然后装载7微升主混合。
当所有孔都已装载时，用定量 PCR 薄膜密封板，并在将板加载到定量 PCR 仪器上之前短暂旋转板。然后运行表中所示的反应。在运行完成时，将定量 PCR 数据导出为 txt 或 xlsx 文件。
净化双硫化转化的DNA后，如所证明的顺磁节拍，对25微升的DNA进行检测。将双硫酸盐转化的DNA转移到一个新的管中，并将样品的两微升添加到单独的PCR条管中。将两微升水添加到无模板控制管中，并根据表为所有样品准备预增母混合。
在每个管和盖、涡流中加入23微升主混合，然后短暂地旋转管子。然后使用加热盖在热循环器上运行预扩增协议。运行完成后，短暂旋转管，并转移到放大DNA的微升到新的管。
然后用78微升水稀释样品至1至40浓度，并运行样品的定量PCR，如所证明的。在这里，从CD8+T细胞测定获得的代表性数据，从分析外周血，单核细胞和T细胞从三个不同的捐赠者使用流细胞测定和甲基化测定显示。两种方法在两种细胞类型的所有捐赠者中的趋势相似。
来自 Treg 测定的这些代表性数据也显示了方法之间的类似结果。然而，在所有情况下，这种甲基化测定在刺激和不刺激条件下都产生了更高的值。通过"空白限值"、检测限值和定量值限制，证明了每种测定的灵敏度和特异性。
由于此分析提供了自动数据分析模板，因此它改进了客观分析并提高了标准化功能。这是细胞治疗制造的理想，标准化的方法对于创建一致的细胞治疗产品至关重要。
概述
本文介绍了一种标准化的方法，用于通过定量PCR（qPCR）检测的表观遗传特征来确定免疫细胞身份和纯度。该方法解决了流式细胞术的局限性，并提供了一个用于客观评估的自动化数据分析模板。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 表观遗传学
背景
- 传统方法如流式细胞术存在高变异性和大样本需求等局限性。
- 表观遗传特征可以作为特定免疫细胞类型的唯一标识符。
- 细胞分析的标准化对于研究和治疗中的一致结果至关重要。
- 该方法提高了免疫细胞表征的可靠性。
研究目的
- 开发一种用于识别和评估免疫细胞纯度的稳健方法。
- 提供一种替代流式细胞术的方法，最大限度地减少用户变异性。
- 增强细胞治疗制造中的检测标准化。
使用的方法
- 从造血细胞样本中分离基因组DNA。
- 用于DNA甲基化分析的亚硫酸氢盐转化。
- 定量PCR测量表观遗传特征。
- 自动化数据分析用于客观评估结果。
主要结果
- 甲基化检测比流式细胞术在不同细胞类型中显示出更高的值。
- CD8+ T细胞和调节性T细胞的检测中观察到类似的趋势。
- 该检测展示了高灵敏度和特异性。
- 自动化分析改善了结果的客观性和标准化。
结论
- 该方法为免疫细胞分析提供了一种可靠的替代方案。
- 标准化提高了研究结果的可重复性。
- 该方法对细胞治疗制造的应用有益。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate immune cell identity and purity assessment is critical for cell therapy development, impacting both product consistency and regulatory compliance. This epigenetic-based qPCR method addresses the limitations of flow cytometry by enabling objective, high-throughput, and standardized quantification of immune cell subtypes. Its robust, automated analysis supports reliable in-process and product release testing, enhancing predictive confidence at key manufacturing inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantification of immune cell subtypes for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by leveraging cell-type specific epigenetic markers.
- Supports predictive confidence in immune cell-based therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated immune cell populations for downstream assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through automated data analysis.
- Enables high-throughput, quantitative assessment of cell identity and purity.
- Supports reliable evaluation of cell therapy product attributes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell characterization with translational biomarker requirements.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by standardizing cell identity assessment.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative purity data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the cell therapy pipeline from early discovery through manufacturing quality control, supporting both lead identification and product release.
- Discovery Biology: Provides quantitative, cell-type specific data for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, reproducible outputs suitable for high-throughput workflows.
- Analytics: Generates quantitative purity and identity metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform for immune cell analysis across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in cell therapy development.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in immune cell characterization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, objective data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genomic DNA isolation, bisulfite conversion, and qPCR analysis.
- Needs access to spectrophotometry, thermal mixers, magnetic racks, and qPCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis templates.
- Adaptation may be needed for different immune cell subtypes or sample sources.
- Assay sensitivity and specificity are defined by established limits of blank, detection, and quantitation.
