基于表观遗传学的定量PCR检测免疫细胞身份与纯度

本方案提供了一种标准化的方法，用于确定免疫细胞的身份和纯度，并解决了流式细胞术存在的若干局限性，例如样本需求量大、操作者间差异显著以及数据分析的主观性。该检测方法包含一个自动化的数据分析模板，使用户能够客观地评估免疫细胞的身份和纯度。结合多种检测对照，本方案为免疫细胞身份和纯度的评估提供了一种即用型、易于标准化的解决方案。

本技术的示范者为本实验室的科学家 Jerry Guzman。从目标造血细胞样本中分离基因组DNA后，取1微升基因组DNA，使用分光光度计测定样本纯度，获取260、280和230纳米处的光密度值。随后，将400至1200纳克的基因组DNA样本用基因组DNA提取试剂盒中的洗脱缓冲液稀释至终体积142微升。

向67微升洗脱缓冲液中加入75微升校准品。并将1200纳克参考基因组DNA用洗脱缓冲液稀释至终体积为142微升。然后将试管置于56摄氏度、900转/分钟的恒温混匀仪中孵育5分钟。

进行亚硫酸氢盐转化时，向所有试管中加入270 µL亚硫酸铵和90 µL THFA。涡旋混匀试管以确保充分混合。短暂离心以收集管壁液体，然后将试管放入恒温混匀仪中，在80 °C、900 rpm条件下孵育45分钟。

然后再次短暂离心样品，并在室温下冷却 3 至 5 分钟。在亚硫酸氢盐转化后的 DNA 纯化步骤中，将 DNA 分离用顺磁性磁珠涡旋振荡 30 秒。根据瓶上标注的体积，向洗涤缓冲液中加入乙醇和异丙醇。

再次涡旋振荡，直至磁珠完全重悬，然后向每根试管中加入870 µL裂解结合缓冲液和105 µL DNA结合用顺磁性磁珠。涡旋振荡试管以混匀，随后短暂离心使样品沉降至管底。向每根试管中加入570 µL 2-丙醇，并通过涡旋振荡充分混匀。

将离心管在室温下以每分钟50转的速度孵育7分钟，然后短暂离心，再将离心管置于磁力架上静置5分钟。孵育结束后，小心移除上清液，避免扰动磁珠。用缓冲液1洗涤样本，并涡旋混匀各管。

短暂离心后，将离心管放回架中静置3分钟，然后在不扰动磁珠的情况下移除上清液。用洗涤缓冲液2洗涤样本两次，并在65摄氏度下干燥离心管15分钟。接下来，向每个离心管中加入60 µL洗脱缓冲液。

室温下以每分钟1400转孵育7分钟后，短暂离心收集管壁液体，并将管子放回磁力架静置2分钟。孵育结束后，小心转移55 µL经亚硫酸氢盐转化的DNA至新管中，注意勿扰动磁珠。若需对样本进行定量PCR检测，请在定量PCR软件中为每个标准品指定“任务标准（Task Standard）”，并根据表格设定其最终拷贝数。

根据表格，对标准DNA进行系列稀释，并为靶细胞类型配制一份定量PCR预混液，同时为GAPDH配制另一份定量PCR预混液。将3微升模板DNA加入96孔圆底板的相应孔中，随后加入7微升预混液。

所有孔加样完毕后，用定量 PCR 薄膜密封反应板，并短暂离心后放入定量 PCR 仪中。随后按照表格所示条件运行反应。运行结束后，将定量 PCR 数据导出为 txt 或 xlsx 文件。

使用磁珠纯化经亚硫酸氢盐转化的DNA后，洗脱25微升DNA。将经亚硫酸氢盐转化的DNA转移至新管中，并取2微升样品分别加入各个PCR条状管中。向无模板对照管中加入2微升水，并根据表格为所有样品配制预扩增主混合液。

向每个试管中加入 23 µL 的主混合液，盖上管盖，涡旋混匀，然后短暂离心。接着在带有加热盖的热循环仪上运行预扩增程序。程序结束后，短暂离心试管，将扩增后的 DNA 转移至新的试管中。

然后用78 µL水将样品稀释至1:40浓度，并按照所示方法对样品进行定量PCR检测。此处展示了来自CD8+ T细胞检测的代表性数据，该数据通过对三名不同供体的外周血单个核细胞以及T细胞分别采用流式细胞术和甲基化检测方法分析获得。在两种细胞类型中，不同供体的两种检测方法所得趋势相似。

来自Treg检测的这些代表性数据在不同方法之间也显示出相似的结果。然而，在所有情况下，该甲基化检测在刺激和非刺激条件下均产生了更高的数值。每种检测的灵敏度和特异性通过空白限、检出限和定量限的数值得以体现。

由于该检测提供了自动化的数据分析模板，因此能够改进客观分析并提高标准化能力。这对于细胞治疗产品的生产尤为理想，因为在生产过程中，标准化方法对于制备一致性的细胞治疗产品至关重要。