Name: 前维沃·兰根多夫注入心脏的心电生理学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解离体猪心脏模型的电生理学与光学标测技术，结合膜电位和钙离子成像评估心脏动态。该方法可用于疾病建模、药理学及毒理学研究，为心血管研究提供可靠的实验窗口。

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作者衷心感谢 Matthew Kay 博士提供的有益实验指导，以及 Manelle Ramadan 和 Muhaymin Chowdhury 提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（R01HL139472 资助 NGP，R01 HL139712 资助 NI）、儿童研究所、儿童国家心脏研究所和谢赫·扎耶德儿科手术创新研究所资助。

所有实验均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（第八版）进行。本研究中使用的所有方法和方案均已由儿童国家医院机构动物护理和使用方案委员会批准，符合美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》。本研究中使用的动物均按照《实验动物护理和使用指南》的要求接受了人道护理。
1. 准备
<ol>
	<li>制备6 L改良Krebs-Henseleit溶液16（mM：118.0 NaCl，3.3 KCl，1.2 MgSO4，24.0 NaHCO3，1.2 KH2PO4，10.0 葡萄糖，2.0 丙酮酸钠，2% 白蛋白，2.0 CaCl2）。实验当天再加入CaCl2，因为随着时间推移，在磷酸盐存在下，氯化钙会逐渐以磷酸钙形式从溶液中完全沉淀析出。</li>
	<li>无菌过滤（孔径：0.22 µm）后将pH调节至7.4。检测溶液渗透压，确保其在275−310 mOsm/kg范围内。将1 L溶液置于冰上冷却，用于心脏离体后立即使用。将3 L溶液在水浴中预热至约37 °C，随后用碳酰气（95% O2，5% CO2）进行鼓泡。 
	注意：预热可最大限度减少气泡形成及潜在栓塞风险，因为低温液体溶解气体的能力更强；因此，当改良Krebs-Henseleit灌注液流经灌注系统并升温时，溶解的气体会以气泡形式释放出来。</li>
	<li>制备2 L心脏停搏液（改良del Nido心脏停搏液，表1）。将足够量的心脏停搏液倒入冰格中冷冻，使其可填满一个500 mL烧杯。</li>
	<li>开启设定温度为42 °C的循环水浴。启动泵以在封闭的水力加热回路中循环灌注液（完整材料清单见材料表和图1）。 
	注意：加热循环水浴用于加热夹套管和热交换器。</li>
	<li>通过系统循环2 L 1%通用洗涤剂水溶液，清洗管路回路和腔室。使用&#62;4 L纯化水冲洗Langendorff系统的全部管路回路和腔室。运行泵直至系统内所有水分完全排出。</li>
	<li>在灌注泵管路中串联安装合成膜过滤器（聚丙烯滤膜，孔径&#62;5 µm）。以80 kPa压力向微纤维氧合器（血液滤过器）通入95% O2和5% CO2混合气体。 
	注意：使用白蛋白时，氧合过程和/或液体在管路中泵送时常会产生泡沫。可定期（约每30分钟）逐滴加入消泡剂（Y30消泡乳液）以消除泡沫。</li>
	<li>对位于主动脉上方或气泡捕集器内的压力传感器进行两点校准（0和60 mmHg），必要时进行校准。</li>
	<li>在心脏离体前立即，将灌注液倒入Langendorff循环灌注系统。确保灌注液流经已通入含氧灌注液的微纤维氧合器（血液滤过器），然后通过热交换器，以维持主动脉处灌注液温度为37 °C。</li>
	<li>将循环水浴温度设定为略高于37 °C（例如42 °C），以补偿热交换过程及系统中其他部位的热量损失。使用热电偶监测循环灌注液的温度。</li>
</ol>
2. 心脏切除与兰格多夫灌注
<ol>
	<li>使用氯胺酮（20 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）进行肌内注射（I.M.）使猪镇静，并插入气管导管进行插管。诱导麻醉时，静脉推注芬太尼（50 μg/kg）和罗库溴铵（1 mg/kg）。维持麻醉采用吸入式异氟烷（0.5−3%）、芬太尼（10−25 μg/kg）和潘库溴铵（1 mg/kg）。 
	注意：在本项概念验证研究中，使用了幼龄约克夏猪（14−42 日龄，n = 18），其体重范围为 2.5−10.5 kg，心脏重量为 18−137 g（图 2）。如需额外注射以辅助诱导，可肌内注射氯胺酮（10 mg/kg）。</li>
	<li>待动物完全麻醉且无反应后，行胸骨切开术以暴露升主动脉和右心房。
	<ol>
		<li>使用手术刀从胸廓入口处的胸骨顶端开始，沿中线向下至剑突做一纵行切口。使用电凝器（或剪刀）分离皮下脂肪和肌肉组织，直至暴露胸骨。</li>
		<li>从剑突开始，使用外科骨剪或骨锯沿中线向上切开胸骨至胸骨柄。将牵开器插入切口以充分暴露心脏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用18 G针头和注射器向右心房注射肝素（300 U/kg）推注剂量，以减少器官切除时的血凝块形成。在胸腔内放置吸水垫，并在心脏周围放置冰屑。</li>
	<li>用剪刀小心剪开心包膜，通过钝性分离将主动脉从周围结缔组织中游离出来，并在主动脉弓第一动脉分支下方夹闭主动脉。使用50 mL注射器连接18 G针头，从升主动脉顶端注入冰冻冷停跳液（20 mL/kg）。</li>
	<li>剪断通向心脏的血管，完整保留升主动脉，取出心脏并立即浸入冰冻冷停跳液中。</li>
	<li>用止血钳夹住主动脉壁，将其套入连接于导管的带肋纹插管上，导管通向悬挂在心脏上方（约95 cm，以提供约70 mm Hg压力）的1 L冰冻冷停跳液。让液体流入并充满主动脉直至溢出，以防止气泡进入血管系统。 
	注意：使用机械解偶联剂（2,3-丁二酮单肟[BDM]或blebbistatin）会因组织氧耗降低而减缓冠状动脉灌注速率。</li>
	<li>使用脐带绳固定主动脉于插管上，并通过绑扎止血钳进一步固定，以承受心脏重量，此时心脏已悬挂在插管上（图 1C）。利用重力使冷停跳液以70 mmHg的恒定压力逆行灌注心脏。在准备转移至温控（37 °C）Langendorff灌注系统前，始终保持心脏浸没于冷停跳液中（&#60;10 min）。 
	注意：较小的心脏（&#60;50 g，最多为2周龄仔猪）其主动脉可承受心脏重量，但较大的心脏有从插管滑脱的风险。在初始插管及转移至温控系统过程中，应防止空气进入主动脉，以免引起冠状动脉栓塞。使用大口径导管（&#62;3/8”内径），以便气泡比进入主动脉的液体更快上浮。</li>
	<li>将心脏转移至Langendorff系统（37 °C）时，避免将空气引入插管。允许正常窦性心律自然冲洗血管内残留的血液和停跳液。 
	注意：在所述研究中，离体幼龄仔猪心脏的平均初始灌注流量为184 ± 17 mL/min。使用含机械解偶联剂（20 mM BDM）的温控灌注液后，流量下降至70 ± 7.5 mL/min（均值 ± SEM）。切勿将心脏组织完全浸没，以免影响心脏成像。由于猪心体积较大、表面积较小，相较于啮齿类动物，其组织温度主要通过冠状动脉灌注维持。在全流量状态下，心外膜和心内膜温度分别维持在35 °C至37 °C之间。 
	注意：操作机械解偶联剂时应穿戴适当个人防护装备，包括护目镜。心脏可能突然且快速地喷射灌注液。</li>
	<li>若出现可电击性心律失常（室性心动过速、心室颤动），将外部电极板置于心脏心尖和基底部，给予5 J单次电击，随后以5 J递增（或根据除颤仪可选设置），最高至50 J，直至实现心脏复律或转为不可电击性心律。必要时可重复使用50 J电击。 
	注意：在本研究中，89%的实验样本需要进行除颤。平衡后（约10 min），幼龄仔猪心脏的平均心率为70 ± 4.5 bpm（均值 ± SEM）（图 2）。</li>
	<li>用至少1 L改良Krebs-Henseleit灌注液冲洗心脏，不循环使用，以清除任何残留的血液和停跳液。当流出液变澄清后，关闭循环回路，开始灌注液再循环。</li>
</ol>
3. 电生理学研究
<ol>
	<li>在整个研究过程中记录标准II导联心电图（ECG），需将一个29 G针状电极连接至心室心外膜靠近心尖处，另一电极置于右心房。将差分生物放大器的正极输入端连接至心尖，负极输入端连接至右心房。</li>
	<li>将一根双极刺激电极连接至右心房，另一根双极刺激电极连接至左侧心室外侧，用于起搏。</li>
	<li>使用电生理刺激器以双倍舒张阈值（1−2 mA）的初始电流和1 ms脉冲宽度对心脏进行起搏35,36. 
	注意： 如果刺激未能引发反应，可将脉冲宽度增加至最多2 ms。使用较大的同轴电极（双极刺激）时，需要更大的电流（约10倍）。</li>
	<li>通过在特定的起搏周长（PCL）下施加一系列刺激脉冲（1−2 mA，脉宽1 ms），以确保稳定的刺激反应，从而确定起搏阈值。 
	注意： 一旦确定了固有频率，初始刺激序列可从稍短的PCL开始。</li>
	<li>采用S1−S1或S1−S2起搏序列进行额外刺激起搏，其中S1−S2序列为6−8次脉冲（S1）后跟随一次单次脉冲（S2）。将S2的周长（PCL）以10 ms为步长逐步缩短（例如200 ms、190 ms、180 ms等），直至无法捕获。然后回升至倒数第二个PCL（例如190 ms），再以1 ms为间隔逐步缩短，以确定在丧失捕获前最精确的PCL值（例如184 ms）。 
	注意： S1 和 S2 采用相同的刺激参数（1−2 mA，1 ms 脉冲宽度）。见 图3 代表性示例，或先前发表的猪心脏电生理学测量值37.
	<ol>
		<li>为确定心室有效不应期（VERP），使用左心室侧壁的刺激电极，找出S2（早搏）仍能引发心室去极化的最短S1−S2间期。 
		注意： 不应期是指可实现的最短S1−S2耦合间期。</li>
		<li>为确定文氏周期长度（WBCL），使用右心房刺激电极，找到通过正常传导通路实现1:1房室传导的最短S1−S1间期。 
		注意： 未能做到这一点代表 2nd Ⅲ度房室传导阻滞</li>
		<li>通过右心房的刺激电极施加一串起搏脉冲（S1−S1），测量起搏序列中最后一个刺激脉冲至窦房结自主活动恢复之间的时间延迟，以此确定窦房结恢复时间（SNRT）。</li>
		<li>为确定房室结有效不应期（AVNERP），使用置于右心房的刺激电极，寻找可使早搏心房刺激后仍产生希氏束电位并引发QRS波群（代表心室除极）的最短S1−S2耦联间期。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 跨膜电压和细胞内钙的光学图谱
注意：在光学标测过程中，应使用机械解耦剂以尽量减少运动伪影，并避免缺氧3,38,39,40。可缓慢加入(-/-)Blebbistatin（灌流液中终浓度为5 µM），方法为将0.5 mM的Blebbistatin溶于5 mL灌流液中作为弹丸式给药（为终浓度的100倍）41。或者，也可在灌流液中初始即加入BDM，使其循环浓度为20 mM。
<ol>
	<li>通过将 5 mg RH237 溶解于 4 mL 无水 DMSO 中来配制电压染料。将染料分装液用最多 5 mL 培养基稀释并涡旋混匀。在靠近主动脉插管处缓慢加入 RH237（每 500 mL 灌流液中加入 62.1 µg）。 
	注意：若实验过程中需要，心肌组织可再次用 RH237 染色。</li>
	<li>通过将 1 mg Rhod2-AM 溶解于 1 mL 无水 DMSO 中来配制钙染料。将染料与 50 µL 普流罗尼克酸（pluronic acid）混合，置于 37 °C 超声水浴中最多 10 分钟，然后用最多 5 mL 培养基稀释。在靠近主动脉插管处缓慢加入钙染料（每 500 mL 灌流液中加入 50 μg）。 
	注意：为确保染料染色均匀，应缓慢加入染料（&#62;30 秒）。Rhod-2AM 需要最多 10 分钟达到荧光峰值，而 RH237 可在 1−2 分钟内心脏完成染色。使用上述染料负载方法，电压和钙信号的信噪比（SNR）分别约为 42−86 和 35−69。信噪比可通过以下公式计算：SNR = （峰-峰值计数）/（舒张期间隔内的标准差）42。</li>
	<li>按照图 1所示位置安装成像设备（相机、图像分光器、镜头），以对准合适的视野。 
	注意：分光器配置了二向色镜（660+ nm），可透过 RH237 发射光并反射 Rhod2 发射光谱。RH237（710 nm 长通）和 Rhod2（585 ± 40 nm）发射光分别使用高透射发射滤光片（长通 ET710，参见材料表）。一个大光圈 50 mm/F0.95 镜头安装在图像分光器前端。该配置可实现充分的发射光分离，此前已得到验证43,44。</li>
	<li>将相机连接至工作站，并使用选定软件采集图像，曝光时间为 0.5−2 ms。利用可分割目标区域、叠加图像并显示灰度相减或伪彩相加以突出错位的软件进行图像对齐（软件选项参见材料表）。</li>
	<li>关闭室内灯光，以最大限度减少环境光对荧光的干扰。在开始成像前测试 LED 光源（525 nm，1.4 mW/mm2），以确保根据传感器井深确定的心外膜照明均匀且达到最大强度。 
	注意：每个光源均通过激发滤光片（535 ± 25 nm）照射。可在拍摄前手动触发 LED 光源，以最大化信号线性度。心外膜发出的荧光经图像分光器和发射滤光片后，分裂的图像投射到高速传感器上。视野约为 12 cm × 10 cm，或根据镜头选择和与心脏的距离，每个分裂图像为 5.9 cm × 4.7 cm。</li>
	<li>在窦性心律、心室颤动（图 4）或通过置于左心室的刺激电极进行动态起搏（S1−S1，1−2 mA，1 ms 脉冲宽度）期间，对心肌进行光学标测成像（图 5）。起始起搏周期长度为 350 ms，并以 10−50 ms 递减，以生成恢复曲线（图 5E）35,36。</li>
</ol>
5. 清理
<ol>
	<li>从系统中取出心脏并排空所有灌注液。用纯化水冲洗系统管路和腔室。</li>
	<li>对于常规维护，根据需要定期用洗涤剂溶液或稀释的过氧化氢溶液冲洗系统。</li>
</ol>
6. 数据处理
<ol>
	<li>通过打开视频文件，选择感兴趣区域，并使用适当的软件包或自定义算法绘制随时间变化的平均荧光强度，以在整个研究过程中确认光学信号质量。</li>
	<li>按照先前所述方法23,33,43,45,46分析成像数据，以量化动作电位和钙瞬变的时间参数，包括激活时间、电压-钙耦合时间（Vm 与 Ca 激活时间之差）以及复极化持续时间的测量值。
	<ol>
		<li>应用阈值分割方法分离荧光心外膜像素，并剔除噪声背景数据。 
		注意： 阈值分割将简化大规模视频的分析过程并提高分析速度。</li>
		<li>在心外膜表面区域上对光学信号进行空间滤波，核尺寸范围为 3 mm × 3 mm 至 5 mm × 5 mm，如图4和图5所示。 
		注意： 后者可在不扭曲动作电位特征、钙瞬变形态或波前整体轮廓的前提下提高信噪比19,47。若使用大像素尺寸的传感器或在采集过程中进行了像素合并，则此步骤可能无需执行。</li>
		<li>使用数字低通滤波器（例如五阶巴特沃斯滤波器）对信号进行时间域滤波，截止频率设置在 100 Hz 至 75 Hz 之间，以消除无关的信号成分45。 
		注意： 代表性处理后轨迹示例见图5C。</li>
		<li>通过 N 阶多项式拟合进行漂移去除与减法处理，以最小化光漂白、运动或其他显著变异来源的影响。</li>
		<li>在对整个视频中的光学数据完成处理与归一化后，计算感兴趣的动作电位和钙瞬变参数。确定激活时间（定义为去极化过程中最大导数对应的时间）和峰值荧光强度，以计算复极化百分比时间与持续时间（动作电位持续时间 [APD] 和 [Ca2+]i 持续时间 [CaD]），参见图5。</li>
		<li>在计算出时间参数后，使用自定义算法生成等时图，以描绘单个动作电位或钙瞬变在整个成像心外膜表面的传播特征23,33,43,45,46。 
		注意： 示例见图5D。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管心血管研究模型涵盖从细胞到活体的多种制备方式，但在临床相关性与实验实用性之间始终存在固有的权衡。在此范围内，离体Langendorff灌注心脏模型仍是研究心脏生理学的一个有效折中方案48。整体心脏模型在功能和结构整合水平上高于单细胞或组织单层模型，同时又避免了活体模型所伴随的复杂干扰因素。在双光学标测实验中，一个主要优势是能够直接观察离体心脏的心外膜表面，并可通过跨膜电位和钙处理的荧光成像来监测心脏生理状态34。
与较大的动物相比，啮齿类动物模型最常用于离体心脏制备，部分原因是扩大所有相关组件（如溶液体积、灌注回路、染料和机械解耦剂的用量）会带来更高的成本，同时较大的动物心脏更不稳定且更容易发生心律失常10,36,49。使用猪心脏的一个优势在于，其在结构、大小和收缩速率方面与人类心脏非常相似，因此能更准确地模拟冠状动脉血流和心输出量等血流动力学参数。同样，人类和猪在钙处理机制、心电图间期37以及动作电位形态（包括其所对应的底层离子通道）方面也具有相似性12,50,51,52。本方案详细描述了建立可重复的大动物模型以全面表征心肌功能的各个步骤。通过同时成像跨膜电压（RH237）和细胞内钙离子（Rhod2），并结合已建立的电生理学实验方案，可精确定位导致心脏功能异常的潜在机制。所述方法可用于临床前安全性测试、毒理学筛选以及遗传性或其他疾病病理的研究。此外，根据具体的研究重点，该方法也可修改并适配于其他心脏模型（如犬类、人类）53,54,55。
在从小型啮齿类动物模型过渡到用于离体全心脏制备的较大猪模型时，有几个关键的改进需要注意。在制备和安装过程中，我们建议在灌注液中添加白蛋白以维持胶体渗透压并减少水肿（如有需要，还可加入消泡剂）56,57,58,59。此外，含有白蛋白的灌注液也有助于需要向培养基中补充脂肪酸的代谢研究60,61。与啮齿类动物心脏不同，由于猪心脏的表面积与体积比较小，以及流经冠状血管的温热灌注液量更大，因此无需将较大的猪心脏浸没在温热的培养基中，即可更好地维持其温度。如前所述，我们将温度探针置于右心室内部以及左右心室的心外膜表面，观察到在整个实验过程中，这三个位置的温度波动仅为1−2 °C。重要的是，较高的灌注流速也可能增加气泡形成和潜在栓塞的风险。为避免这一问题，我们建议使用带有大口径导管的气泡捕获装置，直接连接至主动脉插管。同样，我们发现对于较大（且较重）的心脏，由两人协同操作进行主动脉插管最为有效：一人使用坚固的止血钳撑开主动脉，另一人则用脐带线将主动脉固定在插管上。在所描述的方法中，我们发现使用心脏停搏液灌注和除颤对心脏功能恢复至关重要，这与啮齿类动物心脏的制备方法不同。根据我们的经验，仅少数离体心脏能够在未进行心脏复律的情况下恢复正常的窦性节律活动。
为了改善光学成像终点指标，采用悬挂式心脏制备方法可减少浸没式心脏可能产生的眩光影响。此外，悬挂式心脏还能避免将心脏水平放置进行垂直成像时，可能对心脏后部冠状血管造成的压迫或损伤。我们还发现，在气泡捕获装置之后（靠近主动脉插管处）加载荧光染料可显著增强组织染色效果和光学信号。最后，为了提高心脏电生理终点指标的准确性，使用较大的同轴刺激电极有助于成功实现心房起搏。尽管本文描述了使用心电图来识别不同电生理参数下的起搏捕获与失捕获现象，但也可采用心内导管或双极记录电极进行监测。
本研究致力于在离体完整猪心模型中建立双光学标测与心脏电生理评估的方法学。由于猪心与儿童人类心脏具有相似性，因此它仍是儿科心脏病学或先天性心脏缺陷研究中广泛使用的模型。重要的是，所描述的方法可调整用于较大尺寸的成年心脏和/或不同物种。事实上，其他实验室可能会发现使用犬类或人类心脏（无论是供体心脏或病变心脏）更适用于其特定的研究方向53,54,55。本研究的另一潜在局限性在于使用机械解耦剂以减少成像过程中的运动伪影。在心脏成像应用中，由于对心电图参数、激动时间和不应期影响较小，Blebbistatin 已成为首选的解耦剂41,62,63。BDM 是一种成本较低的替代选择，这在需要大量灌注液和机械解耦剂的大型动物研究中尤为重要，但已知其对钾电流和钙电流具有更显著的影响，可能改变动作电位形态64,65,66,67。若使用 BDM，需注意动作电位时程（APD）缩短会增加心脏对电击诱发心律失常的易损性68。相反，Blebbistatin 的主要局限性在于其光敏感性和光毒性，尽管已有可减轻这些效应的替代制剂被开发69,70,71。最后，所描述的方法采用单相机系统进行双光学标测实验，但需要注意的是，针对心室颤动研究和/或心外膜表面电波传播追踪的研究，需对该方法进行改进，引入三维全景成像技术，如其他研究者所描述的那样15,19,72,73,74,75。

心血管疾病是全球范围内导致疾病和死亡的主要原因。因此，当前研究的重点之一是优化可用于研究正常心脏生理功能以及可能导致人类发病和死亡的潜在机制的方法。基础心血管研究传统上依赖于小型动物模型，包括啮齿类动物和兔子1,2,3，原因在于这些物种易于获得基因修饰品系4,5，且实验成本较低、所需空间较小、通量较高。然而，猪模型的应用有望提供更具临床相关性的数据6。事实上，已有研究记录了人类与猪在心脏电生理学（EP）方面的相似性，包括类似的离子电流7、动作电位形态8以及对药物测试的反应9。此外，猪心脏的收缩与舒张动力学比啮齿类或兔子更接近人类10。与犬类模型相比，猪的冠状动脉解剖结构更类似于人类心脏11,12，因此是研究心脏发育、小儿心脏病和/或先天性心脏缺陷的首选模型13。尽管猪与人类心脏之间仍存在差异8，但这些相似性使猪心脏成为心血管研究中极具价值的模型14。
心脏逆行灌注已成为离体研究心脏动力学的标准方案15 自奥斯卡·兰根多夫首次建立以来16因此，Langendorff灌流可用于在无自主神经影响的条件下维持离体完整心脏的功能。该模型是直接比较健康与非健康心脏之间心肌电生理特性和收缩力的有力工具。由于心脏动力学在时间和空间上均具有复杂性，某一局部的微小改变都可能显著影响整个心脏作为合胞体的功能。17因此，对参数敏感性染料进行高时空分辨率成像，是监测心脏表面功能的有力工具18,19同时对电压和钙离子敏感的荧光探针进行双通道成像，可实现对组织水平上的电活动、钙离子调控及兴奋-收缩耦联的评估。20,21,22,23,24,25,26,27,28Langendorff灌流和/或光学标测技术先前已被用于记录因衰老或基因突变引起的心脏功能下降，以及评估药物制剂或环境暴露的安全性29,30,31,32,33.
在临床环境中，侵入性心脏电生理学检查常用于研究心律失常、识别病理状况，并确定可能的治疗方案。类似地，本文描述了一种可用于评估窦房结功能、测量房室传导以及确定心肌组织不应期的电生理（EP）方案。所述电生理研究可与光学标测或光学心电图34结合使用，以全面表征离体心脏的心脏生理学特性。在本方案中，采用双发射系统，结合电压敏感染料（RH237）和钙离子染料（Rhod-2AM），实现了高时空分辨率的荧光成像。此外，心脏电生理参数在窦性心律下以及程序性电刺激响应下均被同步监测。

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560-5MG</td><td>机械解偶联剂</td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟（BDM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-100G</td><td>机械解耦剂</td></tr><tr><td>白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>模拟信号接口</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>消泡剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 抗泡沫乳液</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>主动脉插管，5/16&amp;rdquo;</td><td>Cole-Parmer</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>气泡捕集器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific，费尔劳恩，新泽西州</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>相机，sCMOS</td><td>安道尔科技</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>同轴刺激电极（心房）</td><td>哈佛仪器</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td>除颤器</td><td>Zoll</td><td>M系列</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Chroma Technology</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>差分放大器</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片，钙</td><td>Chroma Technology</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片，电压</td><td>Chroma Technology</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>EP 刺激器（Bloom）</td><td>费舍尔医疗</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>激发滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>CT510/60bp</td><td></td></tr><tr><td>激发光</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td>过滤器</td><td>McMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>滤芯，聚丙烯</td><td>Pentair</td><td>PD-5-934</td><td></td></tr><tr><td>滤器外壳</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>流量传感器</td><td>Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>加热线圈</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>血液滤过器</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>图像分光器</td><td>凯恩研究</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>大口径管，内径 3/8&amp;rdquo;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 镜头，0.95 光圈</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>美塔莫夫</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>图像配准</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Mucasol 去垢剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific，美国新泽西州费尔劳恩</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>29 G，2 mm 针状电极</td><td>AD Instruments 公司</td><td>MLA1204</td><td></td></tr><tr><td>噪声消除器</td><td>Quest Scientific</td><td>恶作剧</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>世界精密仪器公司</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>储液瓶，2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest 公司</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AAT Bioquest 公司</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>刺激电极（心室）</td><td>哈佛仪器公司</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>外科缝合线</td><td>McKesson Medical-Surgical</td><td>890186</td><td></td></tr><tr><td>换能器放大器</td><td>World Precision Instruments</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>管路流量控制台</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>脐带绳</td><td>Jorvet</td><td>J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅/循环器</td><td>VWR</td><td>89400-970</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;手术工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>绷带剪</td><td>哈佛仪器</td><td>72-8448</td><td>Lister 型绷带剪，斜角，钝头/钝头，42.0 mm 刀片长度，17.0 cm</td></tr><tr><td>电灼术</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>BA2ALD001</td><td>型号：200 Basic</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Roboz</td><td>RS-7476</td><td>圣文森特管夹止血钳</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>哈佛仪器</td><td>72-8960</td><td>哈特曼止血钳，弯型，带齿，尖端宽度 2.2 mm，长度 9.5 cm</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>哈佛仪器</td><td>72-8985</td><td>哈尔斯特德-蚊式止血钳，弯型，带齿，尖端2毫米，14厘米</td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>14.5 厘米，直型</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀</td><td>WPI</td><td>501747</td><td>11.5 厘米，直型</td></tr><tr><td>蚊式钳</td><td>哈佛仪器公司</td><td>72-8980</td><td>哈尔斯特德-蚊式止血钳，直型，光滑，尖端宽度2 mm，12 cm</td></tr><tr><td>持针器</td><td>哈佛仪器</td><td>72-8828</td><td>韦伯斯特持针器，直型，光滑，总长度13.0 cm</td></tr><tr><td>小儿阻断钳</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Cooley-Derra钳 6.25&quot; 5 mm 校准</td></tr><tr><td>直角止血钳</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>婴儿米克斯特止血钳，14 厘米，直角</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Ted Pella</td><td>549-4</td><td>4号手术刀柄，13.7厘米不锈钢，配10片22号刀片</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>哈佛仪器</td><td>72-8380</td><td>手术剪，直型，钝头/钝头，42 mm 刀刃，12 cm</td></tr><tr><td>直齿镊</td><td>WPI</td><td>500363</td><td>敷料镊 15.5 cm</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>Backhaus 毛巾钳，13 cm，弧形，带锁扣手柄，不锈钢</td></tr><tr><td>韦特兰纳拉钩</td><td>WPI</td><td>501314</td><td>韦特兰纳拉钩，自持式，10.2 cm，双头各3个锐齿</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一次性用品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 Prolene 缝线</td><td>不同供应商</td><td>不同供应商</td><td></td></tr><tr><td>血管环</td><td>Aspen Surgical</td><td>011001PBX</td><td>Sterion&amp;reg; 血管环，0.8 mm × 406 mm</td></tr><tr><td>心脏停搏液（Plegisol）</td><td>辉瑞</td><td>00409-7969-05</td><td>Plegisol；St Thomas 晶体心脏停搏液 20 mL/kg</td></tr><tr><td>肝素</td><td>不同供应商</td><td>不同供应商</td><td>300 U/kg</td></tr><tr><td>注射器和针头</td><td>不同供应商</td><td>不同供应商</td><td>60 mL &amp;amp; 18 G 分别</td></tr><tr><td>脐带绳</td><td>Ethicon</td><td>U12T</td><td></td></tr></tbody></table>

离体langendorff灌注心脏的光学心电图与电生理学研究

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

在心血管研究中，小动物模型最为常用，原因在于转基因品系易于获得，且成本低于大型动物。然而，对于涉及正常心脏生理学、病理生理学以及治疗药物临床前测试等转化研究问题，大型哺乳动物更为合适。为了克服在心脏研究中使用大型动物模型所面临的技术障碍，本文介绍了一种用于测量离体乳猪心脏（Langendorff灌流）生理参数的方法。该方法结合了两种强大的实验技术来评估心脏状态：电生理（EP）研究，以及利用参数敏感性染料（RH237、Rhod2-AM）同步进行跨膜电压和细胞内钙离子的光学标测。所述方法非常适用于开展针对心脏传导系统、动作电位形态改变、钙处理、兴奋-收缩耦联以及心脏交替波或心律失常发生率等方向的转化研究。

图1A展示了离体心脏灌注系统的示意图，包括管路回路、泵、过滤器、氧合器、储液槽和加热元件。图1B显示了心电图（II导联配置）和起搏电极的放置位置，图1C描绘了成像装置的设置。图1D展示了光学元件和光路的示意图。
实验在从幼年约克夏猪（14−42日龄，n = 18）分离得到的完整离体心脏上进行，其体重范围为2.5−10.5 kg，心脏重量为18−137 g（图2A）。将离体心脏转移至Langendorff系统（37 °C）后，经除颤约10分钟内心率稳定在70 ± 4.5 bpm（均值 ± 标准误），并在整个研究过程中保持恒定（图2B）。测得平均灌注流速为184 ± 17 mL/min（均值 ± 标准误），在灌注含有机械解偶联剂的预温培养基后，流速下降至70 ± 7.5 mL/min（图2C）。
在整个研究过程中，记录了窦性心律期间（图3A）或对外部起搏反应时的II导联心电图（图3B-E），以量化电生理参数。 进行电生理评估时，对右心房施加动态起搏（S1−S1），以确定WBCL和SNRT（S1−S1起搏开始后的恢复时间，图3C），其中WBCL定义为引发心房至心室传导的最短起搏周长。采用置于左心室的双极刺激电极实施S1−S2起搏方案，以识别引发心室去极化的最短耦合间期，从而确定VERP（图3D）。 alternatively，应用S1−S2心房起搏方案以确定AVNERP（S1−S2），如图3E所示。猪心脏电生理参数的代表性示例与先前发表的结果高度一致37。
光学标测实验在窦性心律和自发性心室颤动期间进行，图4），或在对左心室（LV）进行动态起搏（S1−S1）期间生成电生理与钙离子恢复曲线，如图所示 图5染料标记的幼猪心脏代表性图像如图所示 图4 同时采集心外膜表面两个感兴趣区域的相应光学动作电位（Vm）和钙离子（Ca）瞬变信号（右心室 [RV] = 蓝色，左心室 [LV] = 红色）。图中显示了窦性心律和心室颤动期间的未经处理的信号。如前所述，在光学标测实验中还采用了动态心外膜起搏（S1−S1），以校正固有心率的微小差异。图5A-E）。显示原始信号（RV = 蓝色，LV = 红色），用于描绘动作电位—钙瞬变耦合时间（图 5C）、激活与持续时间（图 5D），电生理与钙重整（图5E）。对于较厚的心肌组织样本，进行心外膜动作电位或钙瞬变分析时，采用约 3 mm × 3 mm 的空间滤波核大小是合适的。19,47因此，高空间分辨率图像（在所述设置中为总共1240 × 1024，或每个通道620 × 512） 6.5 µm 像素大小）通常在采集过程中或采集后进行空间 binning（图5C）。可使用自定义算法对图像进行处理，以生成激活图和复极图23,33,43,45 (图3D)，定义心脏中每个像素的激活时间为动作电位或钙瞬变上升支的最大导数。
<img alt="灌流系统示意图；用于心脏研究的水循环加热、心电图起搏和光学激发。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验装置示意图。（A）离体心脏灌流系统的示意图；箭头表示流动方向。（B）显示插管心脏及电极放置位置。RA = 右心房，RV = 右心室，LV = 左心室，ECG = II导联心电图。（C）成像平台靠近心脏组织的位置。（D）通过配备适当发射滤光片和二向色镜的图像分光装置，按波长分离每种互补探针（电压、钙）的发射信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏重量与体重相关性图、心率柱状图以及添加BDM后的流量比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图2：心脏重量、心率和流量测量结果。（A）本研究中每只仔猪的心脏重量与体重比值（n = 18）。（B）除颤后约10分钟及研究结束时（约1小时）测得的心率。（C）使用机械解偶联剂（+BDM）灌注后，由于氧需求降低，冠状动脉流量急剧下降。误差线表示均值 ± 标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示窦性心律、心外膜起搏、WBCL、VERP 和 AVNERP 结果的心脏起搏心电图示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：在窦性心律或对外部起搏响应期间记录的 II 导联心电图的代表性示例。(A) 正常窦性心律。(B) 心外膜起搏在 400 ms 周期长度（S1−S1）下的示例，该条件用于成像实验。(C) 上图：心房起搏以确定 WBCL；当 S1 = 250 ms 时观察到成功夺获，可见心房至心室传导。注意，心房起搏可用于测定 SNRT（外部起搏停止后窦房结恢复放电的时间）。下图：当 S1 周期长度缩短至 205 ms 时，向心室的传导失败。(D) 上图：心外膜起搏（S1−S2）以确定 VERP；在 S1 = 450 ms、S2 = 300 ms 时观察到成功夺获。下图：当 S2 周期长度缩短至 250 ms 时，心室组织未能被夺获。(E) 心房起搏（S1−S2）以确定 AVNERP。上图：在 S1 = 450 ms、S2 = 200 ms 时观察到成功夺获。下图：当 S2 周期长度缩短至 199 ms 时，向心室的传导失败。蓝色箭头表示起搏脉冲，红色箭头表示夺获（‘C’）或未夺获（‘NC’）。S1−S1 = 程序性起搏，S1−S2 = 额外刺激起搏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理学分析，Vm 和 Ca 图，窦性心律与心室颤动示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：窦性心律与心室颤动期间的光学数据。左侧：染料负载的猪心脏的代表性图像（Vm = 跨膜电压，RH237；Ca = 钙离子，Rhod2），前视图。中间：猪心脏在窦性心律期间的空间滤波跨膜电压和细胞内钙荧光信号。右侧：心室颤动期间的电压和钙信号。信号区域大小（15 × 15 像素 = 2.4 × 2.4 mm2，30 × 30 = 4.8 × 4.8 mm2 卷积核尺寸）以红色和蓝色方框表示。单位 = ΔF/F。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="双信号心脏成像数据；Vm 和 Ca、激活、恢复曲线、像素分辨率的分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：来自 Langendorff 灌流猪心脏的光学数据。在心尖电刺激期间，右心室和左心室未经处理、空间滤波后的（A）跨膜电压和（B）细胞内钙荧光信号。未经滤波、空间平均的信号展示了感兴趣区域的光学动作电位和钙瞬变（信号单位为 ΔF/F）。（C）归一化瞬变信号的叠加图显示了动作电位-钙瞬变耦合时间（75 Hz 低通滤波）。（D）对心外膜表面的信号进行处理，生成时间参数的等时图，包括激活时间（tact）和 80% 复极化时间。（E）在多个频率下生成的电和钙瞬变恢复曲线（左图），以及统计分析结果（右图），以说明在较慢起搏周期长度下复极化时间更长。比例尺 = 均值 ± 标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化学物质</td>
			<td>分子式</td>
			<td>分子量</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钠</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖酸钠</td>
			<td>C6H11NaO7</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三水合乙酸钠</td>
			<td>C2H3NaO2•3H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化钾</td>
			<td>KCl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氯化镁（无水）</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.4% 碳酸氢钠</td>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘露醇</td>
			<td>C6H14O6</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硫酸镁</td>
			<td>MgSO4</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>渗透压（mOsmol/L）</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：改良的del Nido心脏停搏液配方。

本研究的目的是建立一种利用转化动物模型研究心脏动力学的方法。所述实验方法结合了双发射光学生理记录技术与电生理学研究，以评估离体完整猪心脏模型中的电活动。

离体Langendorff灌注心脏的光学心电图与电生理学研究

小型动物模型在心血管研究中最为常用，原因是转基因物种易于获得，且与大型动物相比成本较低……

心血管功能障碍是全球死亡的首要原因。本文介绍的离体心脏模型可作为研究人类心脏动力学的实验窗口。该方法结合经典电生理学研究与跨膜电压及细胞间钙离子的同步光学成像，以评估心脏状态。该方法可应用于疾病建模、药理学和毒理学研究。例如，我们的研究重点之一是表征玻璃尺寸剂对心脏电生理学的影响。尽管该方法在技术上比使用较小动物模型的方案更具挑战性，但总体而言，一旦所有条件准备就绪，该方案相对简单明了。仅通过文字描述成像和灌注系统的所有组件较为困难，因此对该过程进行可视化演示将有助于成功复制该实验操作。在完整保留升主动脉的前提下分离心脏后，将离体器官浸入冰冻的停跳液中，并使用一对止血钳夹住主动脉壁。将血管套入带有肋纹的导管上，该导管通过管路连接至约位于心脏上方95厘米处悬挂的一升冰冻停跳液。让液体充满主动脉，直至液体溢出，以防止任何气泡进入血管系统，并使用脐带线将主动脉固定在套管上。用止血钳夹住并承担心脏悬挂在套管上时的重量，以进一步固定组织，并通过重力使冷培养基以70毫米汞柱的恒定压力逆向灌注心脏。将心脏转移至37摄氏度的Langendorff系统，过程中不得将空气引入套管。让正常的窦性心律冲洗血管系统，以清除残留的血液和心脏停跳液。若出现可电击的心律失常，将外部电极板置于心脏心尖部和心底部位，对器官进行除颤，首次电击能量为5焦耳，随后以每次增加5焦耳的幅度递增，直至达到50焦耳，或实现心脏复律，或出现不可电击的心律。随后，用至少一升改良的克雷布斯-亨塞莱特（Krebs-Henseleit）灌注液无循环冲洗心脏，以彻底清除任何残留的血液和心脏停跳液。当灌注液流经心脏并变得澄清后，关闭循环回路以使灌注液重新循环。在整个研究过程中，为记录标准导联心电图，将一根29号针状电极连接至心尖附近的左心室心外膜，并将另一电极置于右心房。将差分生物放大器的正极和负极输入端分别连接至心尖和右心房，并在右心房放置一个双极刺激电极，同时在左侧心室侧壁放置第二个双极刺激电极，用于起搏。 使用电生理刺激器对心脏进行起搏，初始电流设定为舒张期阈值的两倍，脉冲宽度为1毫秒。为确定起搏阈值，采用1毫秒脉冲宽度，在特定的起搏周期长度下，施加一系列1至2毫安的刺激脉冲，以确保刺激反应的一致性。采用S1, S1或S1, S2起搏序列进行额外刺激起搏。将S2起搏周长逐步缩短10毫秒，直至起搏无法夺获。随后，回调至倒数第二个起搏周长，并以1毫秒为间隔继续缩短周长，以确定夺获丢失前最精确的起搏周长。为测定心室有效不应期，使用左心室侧壁的刺激电极，确定S2早搏仍能引发心室去极化的最短S1-S2间期。为了确定文氏周期长度，使用右心房的刺激电极寻找通过正常传导通路实现1:1房室传导的最短S1-S1间期。为了确定窦房结恢复时间，使用右心房的刺激电极施加S1-S1起搏序列，并测量起搏序列中最后一个刺激脉冲与自发性窦房结介导的电活动恢复之间的时间延迟。为了测定房室结有效不应期，使用右心房的刺激电极。找到最短的S1、S2耦合间期，使得心房早搏刺激后仍能跟随希氏束电位并引发QRS波群，表明心室去极化。进行跨膜电压和细胞内钙离子的光学标测时，首先在主动脉插管附近缓慢加入最多五毫升新配制的电压敏感染料，随后缓慢加入新配制的钙离子敏感染料。接下来，调整成像设备以聚焦于合适的视野，并将相机连接至工作站。使用所选软件采集图像，曝光时间为5至2毫秒。利用能够分割和叠加目标区域并显示灰度相减或伪彩叠加以突出显示错位情况的软件进行图像对齐。在环境光照最小化的条件下，测试LED光源，确保达到由传感器井深所确定的均匀且最大程度的心外膜照明。然后，在窦性心律、心室颤动或动态起搏期间，将刺激电极置于左心室进行心肌成像，起搏周长从350毫秒开始，逐步减少10至50毫秒，以生成恢复曲线。为确认整个实验过程中均获得了高质量的光学信号，可打开视频文件，选择一个感兴趣区域，并绘制随时间变化的平均荧光强度曲线。实验结束时，将心脏从系统中取出，并排空灌注液。然后，用纯化水冲洗系统管路和腔室。对于常规维护，根据需要定期用洗涤剂溶液冲洗系统。在这些代表性研究中，如图所示，操作在完整模型上进行，其体重范围为 2.5 至 10.5 千克，心脏重量范围为 18 至 137 克。将分离的心脏转移至Langendorff系统后，经过约10分钟的除颤，心率稳定在每分钟约70次，并在整个研究期间保持恒定。通常测得的平均灌注流量约为每分钟184毫升。在用含有机械解偶联剂的预温培养基灌注后，流量下降至每分钟70毫升。在窦性心律期间或对外部起搏作出反应时，可在整个研究过程中记录双导联心电图，以量化电生理参数。也可在窦性心律和自发性心室颤动期间进行光学标测实验。可通过染料负载的心脏获得代表性图像，并获取相应的光学动作电位。可以从心外膜表面的两个感兴趣区域采集钙瞬变信号。此外，在光学标测实验期间可采用动态心外膜起搏，以校正固有心率的微小差异。原始信号可用于描绘动作电位与钙瞬变的耦合时间、激活时间与持续时间，以及电生理和钙依赖性的恢复曲线。必须避免气泡进入主动脉，尽量缩短心脏从动物体内转移到系统的耗时，并为较大的心脏提供适当支持。电生理学和光学信号数据可在采集后进行分析。此外，研究结束后心脏可被保存下来，用于组织学、免疫染色或基因表达分析。我们正在利用该技术来表征心脏的早期发育过程，并研究环境暴露对心脏生理功能的影响。用于减少运动的机械解耦剂以及用于防止白蛋白起泡的消泡剂均具有毒性，因此必须使用适当的个人防护装备。

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医学

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用于拉伸诱导心房颤动研究的绵羊模型中的高分辨率心内膜与心外膜光学标测

本文介绍了使用全景成像系统和双模态（电压和钙）成像技术，在离体兔心Langendorff灌流心脏上进行光学标测实验的基本操作步骤。...

离体兔心Langendorff灌注的多参数光学标测

在本视频中，我们对离体小鼠心脏进行朗根多夫逆向灌流。在操作过程中，将导管插入升主动脉，通过冠状动脉逆向灌注灌流液，以维持心脏的生理活动。该模型用于研究心脏的病理生理学机制。...

朗根多夫逆行心脏灌注：一种离体灌注小鼠离体心脏的技术

大多数涉及朗根多夫装置的研究使用小型动物模型，因为较大哺乳动物系统的复杂性更高。我们描述了一种适用于大型动物模型的朗根多夫系统，该系统可用于多种物种（包括人类），并可相对简便地进行数据采集。...

用于大型动物模型的离体工作心脏系统

本方案描述了利用具有高时间分辨率和空间分辨率的光学标测系统对小鼠心房进行电生理学评估的方法，包括通过特制电极导管进行程序化刺激，同步记录膜电位和Ca2+瞬变信号。...

小鼠心房的高分辨率光学标测电生理学评估

在此，我们介绍一种用于调控心脏内自主神经系统并评估其对基础电生理学、心律失常发生机制及cAMP动态影响的方案，该方案采用一种 离体...

心内神经元对心脏电生理学及心律失常发生的影响 离体 朗根多夫系统

本方案描述了主动脉插管及逆行灌注 离体...

改良的小鼠新生心脏在兰格多夫装置中的应用技术

本方案描述了在超声心动图引导下，通过直接心肌内注射病毒在大鼠和小鼠心脏中实现外源基因表达的方法。同时，本文还介绍了通过程序性电刺激离体、Langendorff灌注心脏来评估心脏对心室心律失常易感性的方法。...

啮齿类动物心脏中的病毒转基因表达及心脏心律失常风险评估

本文介绍了一种在冷保存后利用离体心脏灌注系统可靠定量供体心脏左右心室功能的实验方案 离体 灌注系统...

评估 离体 Langendorff 模型中的小鼠双心室功能

冠状动脉疾病筛查可能增加扩展标准供体心脏的获取。一种在供体心脏获取过程中进行可重复冠状动脉造影的方案 原位之外...

猪模型离体心脏灌注期间的冠状动脉造影

了解离体猪心脏模型的电生理学与光学标测技术，结合膜电位和钙离子成像评估心脏动态。该方法可用于疾病建模、药理学及毒理学研究，为心血管研究提供可靠的实验窗口。

离体Langendorff灌注心脏的光学心电图与电生理学研究

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