Name: 用于下游分析的冷冻啮齿动物大脑区域集合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习使用成年CD-1野生型小鼠进行冷冻脑区解剖，以获取高质量蛋白质和RNA。该方法通过低温保存组织完整性，适用于RT-qPCR、RNA测序和蛋白质印迹等下游神经科学研究应用。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号 DA043982 和 DA046196。

本研究中使用的动物均按照印第安纳大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及美国国立卫生研究院（NIH）指南的规定，以符合伦理和人道的方式进行处理。
注意：所有工具和表面应在开始任何操作前用适当的溶剂清洗，以去除核酸酶18。
1. 脑组织的保存
<ol>
	<li>采用常规方法迅速取出约30 g重的成年CD1野生型小鼠（经安乐死处理）的脑组织13，并将其在液氮或经干冰预冷的异戊烷中快速冷冻60秒。</li>
	<li>将冷冻脑组织用铝箔包裹或置于锥形管中，于-80 °C保存，直至使用。</li>
</ol>
2. 准备脑组织切片矩阵
<ol>
	<li>解剖组织前24小时，将一个洁净的脑切片模具（见材料表）放置在一组已解冻的冷冻包上。用两个冷冻包夹住模具两侧，确保刀片槽底部与凝胶包顶部之间保留约0.5 cm的距离（图1A）。在两端覆盖铝箔以增强冷却效果。 
	注意：购买脑切片模具时，应选择足够大、能够完全容纳待解剖脑组织体积的型号。</li>
	<li>将装有脑切片模具和冷冻包的盒子放入-20 °C冰箱中，盖子微开，过夜放置。</li>
</ol>
3. 设置冷冻玻璃板
注意：此步骤的目的是制备一个冷冻表面，用于切取脑组织切片。
<ol>
	<li>在保温箱中放入冰块，直至距离箱顶约 5 cm 处。然后在冰块上方放置一层约 2.5 cm 厚的干冰，并覆盖黑色塑料布，以利于观察样本（图 1B，图 1C）。</li>
	<li>将一块玻璃板（尺寸应刚好适合箱口）放置在塑料布上，并在玻璃板远端的两个角落放置干冰（图 1C）。</li>
	<li>从冰箱中取出冷冻的脑组织切片模具，将待切割的脑组织以皮层朝上的方向插入模具中。盖上箱盖，使脑组织在箱内温度下平衡 10 分钟。</li>
	<li>使用预冷的镊子调整脑组织在模具中的位置，使矢状窦和横窦与模具上的垂直凹槽对齐（图 1D）。这有助于获得对称的切片，便于后续解剖。调整脑组织前，可先将镊子尖端短暂接触干冰进行冷却。</li>
	<li>脑组织定位完成后，在其大致中心位置放置一把预冷的剃刀刀片，并将其轻轻压入组织约 1 mm。在脑组织的前端和后端也添加预冷的刀片，以帮助固定脑组织（图 2A 和 图 2B）。</li>
	<li>从脑组织前端开始，依次插入刀片，将其放入凹槽中，并轻轻压入组织约 1 mm（图 2B）。继续以 1 mm 间隔向后端依次添加刀片。</li>
	<li>确保在此过程中脑组织不发生移位。刀片应保持水平和垂直方向对齐（图 2B）。若需将切片切成 0.5 mm 宽，可使用低剖面微量切片机刀片（见材料表），将其置于较大的剃刀刀片之间（图 2C）。</li>
	<li>刀片全部就位后，用手指、手掌或其他平坦表面按压刀片组顶部（图 2C，图 2D）。缓慢地左右摇动刀片组，使其穿过组织。 
	注意：此过程可能需要一定时间（1–2 分钟），需耐心操作。刀片穿过组织时应有阻力感。若刀片轻易进入，表明脑组织正在解冻，应使用干冰进一步冷却组织块。</li>
	<li>当所有刀片均到达凹槽底部时，用手握住刀片组两侧，通过前后摇动将其从模具中取出。 
	注意：操作时需小心，避免被刀片锋利边缘割伤。</li>
	<li>取出刀片组后，将切片堆叠体前端朝上放置在玻璃板上（图 2E）。在切片堆叠体旁边和/或上方放置干冰，进一步冷冻样本，以便于分离。</li>
	<li>将切片堆叠体锋利边缘朝下放置在玻璃板上，通过拇指与手指移动堆叠体来分离刀片。刀片之间应彼此分开，并带有附着的切片。</li>
	<li>在玻璃板上将切片按从前端到后端的顺序排列整齐（图 2F）。</li>
	<li>通过手指弯曲刀片，或使用第二把预冷的剃刀，将组织从刀片上分离（图 2G、2H、2I）。</li>
</ol>
4. 切片分离
<ol>
	<li>打开艾伦小鼠脑图谱（Allen Mouse Brain Atlas）或其他参考图谱，找到用于识别目标区域的解剖标志。一些明显的解剖标志包括前连合、胼胝体、侧脑室和海马（图3）。</li>
	<li>用预冷的镊子翻转待切割的脑片，并确保即将采集的区域在整个切片中保持一致。在取材过程中，应经常参考图谱，以确保获取正确的感兴趣区域（ROI）。 
	注意：此过程常可借助放大镜或解剖显微镜完成，良好的照明也至关重要。可使用低功率LED灯或冷光源灯（参见材料表）提供照明。</li>
	<li>使用洁净的手术刀或打孔器对组织进行切割（图4）。切割前，将工具短暂接触干冰进行预冷。将刀片轻柔而稳固地插入组织，并前后轻微 rocking 以完成切割。切勿用力过猛，以免组织破裂。 
	注意：工具会随时间逐渐升温。略微升温的刀片有助于实现干净的切割并减少组织破裂，但需注意避免组织解冻。应定期将工具在干冰上重新冷却。</li>
	<li>一旦完成感兴趣区域的采集，立即将其放入已标记并预冷的1.5 mL离心管中。将采集的组织保存于-80 °C，待后续使用。</li>
	<li>对以该方式收集的冷冻组织进行处理时，加入预冷的RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS 及蛋白酶抑制剂混合物（参见材料表））用于蛋白提取，或加入含胍盐的溶剂（参见材料表）用于RNA提取，并立即使用玻璃Dounce匀浆器或机械匀浆器（参见材料表）进行匀浆。通过这种方式，可在样本升温过程中使蛋白酶和核酸酶抑制剂立即发挥作用，防止蛋白质和核酸降解。</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%2C+Neuromethods%22">Neuroproteomics, Neuromethods</a>. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalkovits%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 103, Academic Press. 368-376 (1983).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf</a> (2008).</li>
<li>Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf</a> (2016).</li>
<li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种在限制核酸和蛋白质降解的同时，分离脑部特定微小区域的技术。生物体死亡后，脑组织会迅速发生损伤，部分原因是细胞外谷氨酸迅速积聚，进而引发兴奋性毒性21。信使RNA尤其容易发生降解22,23。低温条件下，蛋白质和核酸的分解过程显著减缓，这一点已由近期一篇报道得到证实：该研究描述了在永久冻土中冻结了28,000年的猛犸象细胞仍存在生物活性24。
采用本文所述方法，脑组织被迅速冷冻，且所有工具和组织在核酸或蛋白质提取开始前均保持在冰点以下温度。随后，将冷冻的感兴趣区域（ROI）在含有蛋白酶和核酸酶抑制剂的缓冲液中进行匀浆，以保护目标分子在较高温度下不被降解。
在此过程中，识别清晰的解剖标志物以准确定位脑片中的感兴趣区域（ROI）至关重要。前连合和胼胝体的纤维束以及脑室均适合作为这类标志物。随着从前向后移动，海...

本研究展示了如何利用参考图谱（如艾伦小鼠脑图谱1）作为指导，对冷冻脑区进行解剖，以提取高质量的核酸或蛋白质。该技术中，脑组织经速冻后于 -80 °C 保存，以便后续在保持冷冻状态下进行切片和解剖。此方法使研究人员能够在一次实验中收集大量脑组织，并在后续精确分离多个脑区。
在回答与基因和蛋白质表达相关的问题时，通常需要精确采集感兴趣脑区（ROIs）。尽管药理学、电生理学和光遗传学可用于野生型或基因修饰啮齿类动物，以帮助阐明支撑所观察行为的分子变化2,3,4，但对转录组和蛋白质组中诱导变化的检测常被用于支持这些发现。定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质印迹法（western blotting）、RNA测序（RNAseq）5、MAPSeq6 和高效液相色谱法（HPLC）7 等技术具有较高的可靠性且成本相对较低，使许多实验室能够研究小脑区内的诱导性分子变化2,4,5,6。
从脑区提取和纯化核酸或蛋白质有多种方法8,9,10,11,12。许多实验室在取材时通过将脑组织置于冰上冷却并进行切割来获取脑区9,13。尽管这种方法可以获得高质量的核酸和蛋白质，但其时间上存在一定限制，因为在冰上操作时组织微环境中的降解过程仍可能发生。当需要在一次实验中解剖大量动物或感兴趣区域（ROIs）时，这一问题可能尤为突出。保持样品处于冷冻状态有助于维持不稳定的目标分子，同时使研究人员有足够时间仔细比对每个切片两侧的解剖标志，从而收集相对纯净的样品。激光捕获显微切割是另一种从脑区获取组织用于RNA或蛋白质分析的方法10。该技术优于机械解剖之处在于，能够识别并分离出非常微小且形状不规则的感兴趣区域。然而，激光捕获技术受限于昂贵的仪器和试剂，操作耗时，且样品也可能更容易发生降解。
在冷冻组织上进行显微打孔分离并非新技术。Miklos Palkovits 等人的早期文献已对基本技术进行了详细描述14,15。本方案主要遵循原始方法，并进行了若干改进，以提高效率并降低所需设备的成本。例如，脑切片是在冷冻的脑组织块上直接进行，而非使用冰冻切片机。这种方法可获得较厚的切片，从而减少采集目标区域（ROI）样本所需的切片数量。此外，该方法在置于绝缘盒内干冰上的冷冻玻璃板上进行样本分离，可在实验台面上形成低于冰点的操作环境。以此方式分离的切片易于操作，研究人员可将每张切片的两面与参考图谱进行比对，从而避免来自目标 ROI 以外区域的污染。
本方案的优点在于：1）整个过程中脑组织始终保持冷冻状态，有助于保护蛋白质和核酸，并为研究者提供充足时间仔细采集感兴趣区域（ROIs）；2）所需试剂价格低廉，且大多数分子生物学实验室均具备。在此过程中，将完整脑组织使用脑切片模具切成0.5–1.0 mm的薄片，并置于持续用干冰冷却的冷冻玻璃板上。利用《艾伦脑图谱》1 或其他脑图谱16,17 中的解剖标志来确定感兴趣区域，随后使用预冷的打孔器或手术刀进行显微解剖。由于组织从未经历解冻，以此方式采集的脑区可为后续分析提供高质量的RNA和蛋白质。

<table><tbody><tr><td>0.5 mm 小鼠冠状脑切片矩阵</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>切片模具</td></tr><tr><td>0.5 mm 大鼠冠状脑切片矩阵</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>切片模具</td></tr><tr><td>1.0 mm 带推杆活检打孔器</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Dot Scientific</td><td>229443</td><td>用于储存冷冻的感兴趣区域（ROIs）</td></tr><tr><td>1.5 mm 带推杆活检打孔器</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69031-02</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mm 带推杆活检打孔器</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>4-12% NuPage 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>蛋白梯度凝胶</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 系统</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>RNA 分析系统</td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨器</td><td>Millipore Sigma</td><td>&lt;br/&gt; D8938</td><td>玻璃组织匀浆器</td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>Model 180</td><td>冷光源灯</td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td>蛋白酶抑制剂混合物</td></tr><tr><td>低剖面刀片</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗肌动蛋白抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>JLA20</td><td>抗体</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>用于初始 RNA 纯度分析</td></tr><tr><td>No. 15 外科手术刀片</td><td>Surgical Design Inc</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 封闭缓冲液</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>Western 印迹封闭试剂</td></tr><tr><td>Omni 组织研磨仪 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>组织匀浆器</td></tr><tr><td>兔抗 KCC2 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>94725S</td><td>抗体</td></tr><tr><td>RNA Plus Micro 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>用于从小量组织样本中提取 RNA</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Excelta Corp.</td><td>16050103</td><td></td></tr><tr><td>标准剃须刀片</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>用于从组织中提取 RNA</td></tr></tbody></table>

用于后续分析的冷冻啮齿类动物脑区采集

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

随着我们对神经生物学的理解不断深入，分子分析常常需要在较小的脑区进行，例如内侧前额叶皮层（mPFC）或伏隔核。此类研究的难点在于如何在准确分离目标区域的同时，保持其待检测的微环境。本文介绍一种简单且低成本的方法，所用资源在大多数实验室中均可方便获得。该方法通过在整个操作过程中保持组织处于冷冻状态，从而有效保存核酸和蛋白质。首先使用脑切片模具将脑组织切成0.5–1.0 mm厚的切片，并将其排列在冷冻的玻璃板上。通过将每一切片内的解剖标志与参考图谱（如艾伦小鼠脑图谱）进行比对，利用低温手术刀或活检打孔器分离特定脑区。分离后的组织可储存于-80 °C直至使用。通过该方法，已成功对大鼠和小鼠的mPFC、伏隔核、背侧和腹侧海马以及其他脑区进行了qRT-PCR和Western印迹分析。该方法的适用范围限于那些具有明确解剖标志、可被清晰识别的脑区。

为了验证该方法，采集了成年CD1野生型雄性小鼠的内侧前额叶皮层，并从中提取RNA和蛋白质进行表征分析。采用毛细管电泳法分析RNA。降解的RNA表现为28S和18S核糖体条带强度减弱，并在25至200个核苷酸之间出现降解产物形成的弥散条带（图5A，样本1）。高质量的RNA则显示出清晰的核糖体条带，低分子量区域几乎没有信号（图5A，样本2）。该分析还可生成RNA完整性数值（RIN）。RIN值高于7表明RNA质量良好19。采用冷冻解剖法从样本中分离的RNA显示出明显的核糖体条带和较高的RIN值，其质量可与新鲜组织提取的RNA媲美（图5B）。
该方法的一个优势在于，可以在一次操作中快速获取并保存大量脑组织，以便后续进行精细解剖。此外，目标脑区（ROIs）也可在不经历组织冻融的情况下进行储存。采用该方法，研究人员能够收集大量且多样化的脑区样本，并从中提取高质量的核酸或...

本实验方案描述了利用廉价且常见的工具采集离散的冷冻脑区，以获得高质量蛋白质和RNA的方法。

随着我们对神经生物学的理解不断深入，分子分析常常在小范围脑区（如内侧前额叶皮层）上进行……

本实验方案描述了如何使用廉价且常见的工具，采集离体后冷冻保存的特定脑区，以获得高质量的蛋白质和RNA。由于脑组织从取材到解剖的整个过程均保持冷冻状态，目标分子得以有效保存，研究人员也有充足时间精确解剖并储存感兴趣的脑区。然而，最初识别感兴趣的脑区可能具有一定挑战性。通过观察常见脑部标志在切片过程中相对于目标区域的出现和消失，可清晰地进行识别。从安乐死后的成年CD-1野生型小鼠中取出脑组织后，将其在液氮或异戊烷中快速冷冻60秒。用干冰预冷，并在-80摄氏度下保存。在解剖组织前24小时，将一个干净的脑组织切片模具放置在一堆已解冻的冷冻包上，并用两个冷冻包从两侧夹住模具，确保刀片槽底部与冷冻包顶部之间留出约半厘米的间隙。准备一块冷冻玻璃板用于解剖：将一个保温箱内装入冰块，直至距离箱顶约五厘米处。然后在顶部放置一层2.5厘米厚的干冰，并用黑色塑料布覆盖。在塑料布上方放置一块玻璃板。在培养皿边缘放置干冰。从冷冻箱中取出冷冻的脑组织切片模具，将脑组织（皮层朝上）插入模具中。让组织在盒内温度下平衡10分钟。在此期间保持盖子打开。使用冰冷的镊子调整脑组织在切片模具中的位置，使矢状窦与横窦与模块上的垂直凹槽对齐。脑组织定位完成后，在其中心附近放置预冷的剃刀刀片，并将其压入组织约一毫米。接下来，将一片预冷的刀片置于脑组织的前端，另一片置于后端，用力将刀片完全压入切片模具中。然后从脑组织的前端开始，依次将预冷的刀片插入切片槽中，每次插入一片，并轻轻将刀片压入组织约1毫米。以1毫米的间隔继续逐次添加刀片，逐步向后端推进。当所有刀片就位后，用手指、手掌或钝器按压顶部，并缓慢地左右摇动，使刀片穿过组织。当刀片到达槽底后，握住刀片组的两侧，通过前后摇动将其从基质中取出。取出刀片组后，将其腹侧朝上放置在玻璃板上，并将干冰置于刀片堆的旁边或上方，以进一步冷冻样品，便于后续分离。然后将刀片堆叠尖锐边缘朝下放置，通过拇指与手指之间移动刀片堆叠来分离刀片。将切片在玻璃板上按从头端到尾端的方向排列整齐，并通过手指弯曲刀片或将组织用另一把预冷的刀片分离，使组织与刀片分开。有时组织可能会粘附在刀片的两侧，此时需特别注意保持从头端到尾端的方向性。在开始解剖之前，打开艾伦小鼠脑图谱或其他参考图谱，找到用于识别目标区域的解剖标志。使用预冷的镊子或刀片翻转切片，并确保目标区域在整个切片中保持一致。使用洁净的手术刀或打孔器切入组织，将金属工具轻柔但稳固地推入组织中，并前后摇动以完成切割。获取目标区域后，将其放入已标记的预冷1.5毫米离心管中，并于-80°C条件下保存。处理组织时，加入冷的RIPA缓冲液用于蛋白质提取，或加入含胍盐的溶剂用于RNA提取，并立即使用玻璃匀浆器或机械匀浆器进行匀浆。为验证该方法，从成年CD-1野生型雄性小鼠中分离内侧前额叶皮层，并对RNA和蛋白质进行表征。当通过毛细管电泳分析时，降解的R

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用于下游分析的冷冻啮齿动物大脑区域集合

将大鼠脑组织精细解剖为不同区域对于研究多种神经退行性疾病至关重要。本视频展示了在新鲜大鼠脑组织中对四个主要脑区——嗅球、额叶皮层、纹状体和海马体——进行显微解剖的操作过程。同时提供了快速分离各脑区的实用技巧，以避免组织中RNA和蛋白质的降解。...

大鼠脑组织显微解剖用于特定脑区的RNA或蛋白质提取

对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。...

一种无需激光捕获显微切割的小鼠脑区精细分离方法，用于总RNA提取及后续的高通量测序与基因表达谱分析

我们描述了一种创伤后应激障碍（PTSD）的大鼠模型，该模型揭示了神经内分泌功能的持续性改变以及延迟出现的长期过度恐惧反应，这些特征与PTSD患者的表现一致。本文所述的动物模型和方法可用于关联脑核团中的生物标志物（具有机制性意义但无法在患者中检测）与外周白细胞中的生物标志物（可检测）。...

用于揭示创伤后应激障碍神经、血液学及行为相关性的动物模型中的生物标志物

本视频演示了制备小鼠冷冻脑组织切片以用于下游分析的详细逐步操作流程。...

小鼠脑组织的下游分析处理

我们描述了使用激光捕获显微切割技术从大鼠脑部不同区域获取特定细胞群体样本，用于基因和微小RNA分析。该技术可用于研究创伤性脑损伤对大鼠脑内特定区域的差异性影响。...

立体定位图谱引导的激光显微切割技术用于分离受创伤性损伤影响的脑区

本文介绍一种可同时对多只动物的脑组织进行冷冻切片的实验方案，作为替代单个处理脑组织的省时方法。该方法可降低免疫组织化学染色过程中的变异性和减少冷冻切片及成像所需的时间。...

同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用，但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法，以便通过分离RNA并检测基因表达差异，探究这些区域间的分子差异。...

小脑区域解剖用于分子分析

本文介绍了一种快速、动手操作的逐步实验方案，用于小鼠脑组织的取出以及从新鲜脑组织中分离特定脑区。在许多神经科学研究实验室中，获取脑区用于分子分析已成为常规操作。这些脑区在分离后立即冷冻，以获得高质量的转录组数据，用于系统水平的分析。...

小鼠脑组织功能区与解剖区域的显微解剖

本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。...

使用自动图像分析法对啮齿类动物模型黑质中多巴胺能神经元密度进行半定量测定

学习使用成年CD-1野生型小鼠进行冷冻脑区解剖，以获取高质量蛋白质和RNA。该方法通过低温保存组织完整性，适用于RT-qPCR、RNA测序和蛋白质印迹等下游神经科学研究应用。

用于后续分析的冷冻啮齿类动物脑区采集

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