Name: 光遗传学调节心细胞活性的机电评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 了解光遗传学调节心细胞活性的机电评估方法，使用GtACR1光激活技术结合膜片钳与碳纤维技术，在兔心室肌细胞中分析电生理功能与机械收缩特性，为心脏电生理学研究提供详细实验方案。

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感谢Stefanie Perez-Feliz提供的出色技术协助，感谢Jonas Wietek博士（德国柏林洪堡大学）提供pUC57-GtACR1质粒，感谢Michael Schupp教授（德国柏林夏里特医学院药理学研究所）提供腺病毒制备支持，以及感谢Anastasia Khokhlova博士（乌拉尔联邦大学）分享其专业知识，以优化细胞分离方案并重新设计移液管拉制装置。本项目由德国研究基金会（SPP1926：SCHN 1486/1-1；Emmy-Noether奖学金：SCHN1486/2-1）和欧洲研究理事会高级资助项目CardioNECT资助。

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<li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806(2018).</li>
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<li>Schneider-Warme, F., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+to+fight+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Using light to fight atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管光遗传学工具能够以非侵入性方式调控可兴奋细胞的电生理活动，但仍需在不同类型的细胞（例如心肌细胞）中对其进行充分表征，以便为特定实验设计选择最合适的工具。膜片钳技术是评估细胞电生理特性的标准方法。在全细胞构型下，该技术可用于记录光激活后跨质膜的电流，或光刺激/抑制后膜电位随时间的变化。光遗传学对电兴奋性的调控也会影响心肌细胞的收缩。我们采用肌节追踪和碳纤维辅助的力测量方法，定量分析光学干预对心肌细胞机械活动的影响。
我们描述了一种用于表征光控氯离子通道GtACR1在心肌细胞（CM）中基本效应的实验方案。作为模型系统，我们选择了兔心肌细胞，因为其电生理特性（如动作电位形态和不应期）比啮齿类动物的心肌细胞更接近人类心肌细胞。此外，兔心肌细胞可在体外培养数天，时间足以完成腺病毒介导的GtACR1-eGFP递送与表达。值得注意的是，分离的心肌细胞在培养过程中会随时间发生结构特性的改变，包括细胞末端变圆以及横纹、T管系统和小凹的逐渐丧失23,24。与此相一致，已有研究报道培养心肌细胞存在功能上的改变：静息膜电位去极化、动作电位时程延长以及细胞内Ca2+处理能力的变化。有关细胞在培养条件下适应性变化的综述，请参见Louch等人的文献25。补充图2展示了采用本方案所获得的新鲜分离心肌细胞的动作电位和收缩测量示例，可用于与培养心肌细胞的结果（图6、图7）进行比较。
全细胞膜片钳记录技术能够以高时间分辨率直接测量光流特性（例如幅度和动力学）以及光诱导的膜电位变化或动作电位特性的改变。然而，这种记录方法存在若干局限性：首先，在全细胞记录过程中，细胞质会被移液管溶液取代，这虽然有利于控制离子的电化学梯度，但其固有的缺点是会洗脱细胞内的细胞器、蛋白质及其他化合物，从而可能影响细胞的电生理反应。其次，由于非生理性长时间去极化（例如光门控离子通道的缓慢时间常数）可能引发额外离子通道的激活等副作用，而本方法仅能检测动作电位时程（APD）的变化，无法对电生理相关细胞区室中的离子浓度进行直接测量，因此这类副作用难以评估。此类测量可通过荧光指示剂（例如Ca2+传感器）或离子选择性电极实现。进一步的表征还可包括光强滴定实验、pH依赖性测定、在不同膜电位下光流动力学分析，以及重复光刺激期间的恢复动力学研究。
与膜片钳记录相比，单细胞力测量技术能够在不干扰完整心肌细胞胞内环境的情况下，分析其细胞收缩。通过测定产生的力的幅度和动态特性（例如，收缩和舒张的最大速度；此处未分析），可间接评估离子浓度（如 Ca2+）的继发性影响。相较于自由收缩的细胞，采用碳纤维技术进行力测量的优势在于，可直接获取预负荷细胞中被动和主动力的信息（即更接近体内或原位条件下的状态）。在分析细胞收缩功能时，机械预负荷尤为重要，因为拉伸会影响力的产生和舒张过程26,27。
光遗传学方法能够对单个心肌细胞（CM）和完整心脏组织中的细胞膜电位实现时空精确操控。传统上，光门控非选择性阳离子通道ChR2被用于膜电位的去极化，而光驱动的质子和/或氯离子泵则用于膜电位的超极化。这两类光遗传效应分子均需要高水平表达，因为ChR2具有固有的低单通道电导率28，而光驱动泵每吸收一个光子最多只能转运一个离子。此外，在心肌细胞中长时间激活ChR2可能导致Na+和/或Ca2+超载，而光驱动泵可能改变跨肌膜的H+或Cl-梯度29,30。为了寻找可用于调控心肌细胞活动的替代性光遗传工具，我们近期测试了天然阴离子通道视紫红质GtACR1，其单通道电导率和光敏感性均优于阳离子型ChR（如ChR2）。我们发现，GtACR1的激活可使心肌细胞去极化，并可根据光脉冲的时序和持续时间实现光学起搏或抑制。与使用阳离子型ChR相比，使用ACR的另一优势在于Cl-的反转电位更负，相较于Na+，可减少人为引入的离子电流。正如我们此前所展示的，使用GtACR1进行光学起搏可能因GtACR1通道关闭过程中的缓慢组分而导致动作电位（AP）延长，这一问题可通过使用更快动力学的GtACR1突变体来克服19。然而，当采用较低且更接近生理水平的细胞内Cl-浓度时，动作电位延长现象显著减轻（见图6）。此外，通过持续光照由GtACR1介导的抑制会导致显著的膜去极化，这可能再次激活继发性的Na+和Ca2+内流，从而改变电压门控通道的活性。在我们的测量中发现，在1分钟光照抑制结束后40秒内，动作电位和收缩参数即可恢复至基线水平（参见Kopton等，2018年，图6，图7）。光门控K+通道则为在不影响心肌细胞静息膜电位的前提下实现心肌细胞沉默提供了有力的替代方案31。
未来，我们希望对不同光遗传学工具在抑制心脏活动方面的潜力进行定量比较。为此，我们将测试多种光控离子通道，包括ACR、ChR2以及红移型ChR变体32，同时也将测试超极化效应器，例如卤视紫红质或光控腺苷酸环化酶bPAC与钾离子通道SthK联用的系统（PAC-K）31。
本文所介绍的方案可用于心肌细胞（CM）机电特性深入表征。该方法原则上也适用于来自其他物种的CM，以及从病变心肌中分离得到的CM。在碳纤维收缩实验中，可通过光刺激以不同频率起搏CM，并测试不同的预负荷条件。一项有意义的实验是采用低强度光照诱导低于阈值的去极化，以模拟静息膜电位的渐进性升高，这种现象在疾病进展过程中心肌组织重构时可被观察到。最后，功能性测量可与Ca2+成像相结合，以进一步揭示兴奋-收缩耦联机制，或结合药理学干预手段，评估不同药物对CM活性的影响。

首次在单细胞绿藻的眼点中记录到由ChR介导的光电流1,2。在对Chlamydomonas reinhardtii的ChR1和ChR2进行基因克隆并实现异源表达后不久，ChR即被用作通过光调控非洲爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞膜电位的工具3,4。这种对阳离子无选择性的ChR可使静息膜电位负于ChR反转电位的细胞膜发生去极化。因此，ChR可用于在可兴奋细胞（包括神经元和心肌细胞）中诱发动作电位（AP），从而实现光学起搏5,6。
与阳离子通道视紫红质（ChR）相补充，光驱动的质子泵、氯离子泵和钠离子泵7,8,9 已被用于抑制神经元活动10,11,12。然而，这些泵存在局限性，需要高强度光照和持续照射，因为每个吸收的光子仅转运一个离子。2014年，Wietek 等人和 Berndt 等人分别独立报道了通过通道孔区域的突变将阳离子传导型 ChR 转变为阴离子通道视紫红质（ACR）13,14。一年后，天然 ACR 在隐藻 Guillardia theta（GtACR）中被发现15。由于工程化 ACR 仍表现出残余的阳离子电导，因此被天然 ACR 所取代，后者具有较大的单通道电导和高光敏感性15。GtACR 通过将膜电位极化至氯离子的反转电位来实现神经元活动的沉默16,17。Govorunova 等人将 GtACR1 应用于培养的大鼠心室心肌细胞（CM），并在低光强下实现了高效的光抑制，该光强不足以激活此前可用的抑制工具（如质子泵 Arch）18。我们课题组近期报道，GtACR1 介导的心肌细胞光抑制机制基于去极化，因此 GtACR1 也可用于心肌细胞的光学起搏19。
本文介绍了一种研究GtACR1光激活对培养的兔心室心肌细胞（CM）电生理和机械效应的实验方案。我们首先描述了细胞分离、培养和转导过程。采用全细胞膜片钳记录技术测量电生理效应，在电压钳模式下评估特定膜电位下的光介导电流。在电流钳模式下，通过电刺激或光刺激心肌细胞来测量膜电位动态变化。通过持续光照应用测试光抑制对电触发动作电位（AP）的影响。机械效应通过碳纤维结合基于成像的肌节长度追踪技术进行测量。为此，将可进行光刺激的细胞通过在细胞两端相对的质膜附近附着两根碳纤维实现机械预负荷。在光刺激或电刺激过程中记录肌节长度的变化。最后，在细胞电场刺激过程中测量光抑制效应，并分析所产生的力。
该方案包括以下步骤，如图1流程图所示：兔深麻醉、戊硫喷妥过量注射、心脏切除、Langendorff灌注及组织消化、机械分离组织以释放细胞、心肌细胞得率的显微镜分析、心肌细胞培养、用5型腺病毒转导，随后进行孵育和功能实验。
<img alt="兔心肌细胞分离过程、Langendorff灌流、腺病毒转导、孵育" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图1"> 
图1：获取可电刺激和光刺激心肌细胞（CM）的实验流程图。 从9-10周龄的兔体内取出心脏，利用Langendorff装置进行灌流并同时消化心脏组织。通过机械振荡使细胞释放。在显微镜下计数获得的CM数量。将CM进行培养，使用5型腺病毒进行转导，并在转导后48-72小时开展功能实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;设备 - 细胞分离/培养/转导&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adeno-X 腺病毒系统 3 CMV</td><td>美国加利福尼亚州芒廷维尤市，TaKaRa，Clontech Laboratories, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>主动脉插管</td><td>Radnoti</td><td></td><td>4.8 OD × 3.6 ID × 8-9 L mm</td></tr><tr><td>盖玻片 &amp;oslash; 16 毫米，厚度编号 0</td><td>VWR International GmbH，比利时鲁汶</td><td>631-0151</td><td>硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>Griffin Silk，黑色，2 米长，3 号，0.5 毫米</td><td>Samuel Findings，英国伦敦</td><td>TSGBL3</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>新不伦瑞克，艾本道夫，施&amp;ouml;嫩布赫，瑞士</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>朗根多夫灌流装置</td><td>Zitt-Thoma 实验室玻璃器皿供应&amp;auml;serei，德国弗赖堡</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>朗根多夫泵</td><td>Ismatec，实验室技术分析，Glattbrugg-Z&amp;uuml;rich，瑞士</td><td>ISM444</td><td></td></tr><tr><td>网膜：尼龙 Monodur 滤布</td><td>Cadisch Precision Meshes Ltd</td><td></td><td>800 &amp;micro;m个孔，1米宽</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR国际有限公司，比利时鲁汶</td><td>717806</td><td></td></tr><tr><td>新西兰白兔</td><td>查尔斯河实验室</td><td>菌株编号：052</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Aesculap AG，德国图特林根</td><td>BC774R</td><td>直角剪 18厘米</td></tr><tr><td>无菌滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备——膜片钳&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Axon Instruments，联合市，加利福尼亚州，美国</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 &amp;oslash; 50 毫米，厚度1号</td><td>VWR International GmbH，比利时鲁汶</td><td>631-0178</td><td>硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>Axon Digidata 数字转换器</td><td>Molecular Devices，圣何塞&amp;eacute;美国加利福尼亚州</td><td>1550A</td><td></td></tr><tr><td>滤光片（530/20）</td><td>徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔</td><td>11513878</td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>滤光片（630/20）</td><td>美国佛蒙特州贝尔斯福斯，Chroma Technology公司</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>AxonInstruments，尤宁城，加利福尼亚州，美国</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>界面</td><td>英国乌克菲尔德，Scientifica公司</td><td>1U 机架，352036</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>LED 控制软件</td><td>Essel 研发公司，加拿大多伦多</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 控制系统</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>日本东京Narishige公司</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>德国韦茨拉尔，徕卡显微系统公司</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>电动显微操作器</td><td>英国乌克菲尔德，Scientifica公司</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>光功率计</td><td>Thorlabs，新泽西州纽顿，美国</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>硅脂</td><td>RS Components，科比，英国</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>A-M Systems，Sequim，WA，美国</td><td>787500</td><td>银，裸线 0.015 英寸，涂层线 0.0190 英寸，长度 25 英尺</td></tr><tr><td>苏打石灰玻璃毛细管</td><td>Vitrex Medical A/S，Vasekaer，丹麦</td><td>160213 BRIS, ISO12772</td><td>1.55 毫米外径 × 1.15 毫米内径 × 75 毫米长度</td></tr><tr><td>软件 Axon pClamp</td><td>Molecular Devices，圣何塞&amp;eacute;美国加利福尼亚州</td><td>版本 10.5</td><td></td></tr><tr><td>软件 MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载物台测微尺</td><td>Graticules Optics LTD，英国汤布里奇</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备 - 碳纤维&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳纤维</td><td>由 Jean-Yves Le Guennec 教授提供</td><td></td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Axon Digidata 数字转换器</td><td>Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>1550B</td><td></td></tr><tr><td>滤光片（530/20）</td><td>德国韦茨拉尔，徕卡显微系统公司</td><td>11513878</td><td></td></tr><tr><td>滤光片（630/20）</td><td>美国佛蒙特州贝洛斯福尔斯，Chroma Technology公司</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>荧光系统接口</td><td>IonOptix，美国马萨诸塞州米尔顿</td><td>FSI-800</td><td>2.0 OD × 1.16 ID × 100 L mm</td></tr><tr><td>力传感器系统</td><td>Aurora Scientific Inc.，安大略省，加拿大</td><td>406A</td><td></td></tr><tr><td>用于力测量的玻璃毛细管</td><td>哈佛仪器公司，霍利斯顿，马萨诸塞州，美国</td><td>GC200F-10</td><td></td></tr><tr><td>国家仪器接口</td><td>匈牙利布达佩斯国家仪器公司</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>LED 控制箱</td><td>Essel 研发公司，多伦多，加拿大</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 控制系统</td><td>定制的</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微控制器</td><td>Parallax Inc.，美国加利福尼亚州洛克林</td><td>螺旋桨</td><td></td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>日本东京Narishige公司</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>徕卡显微系统公司，德国韦茨拉尔</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S 相机</td><td>IonOptix，爱尔兰都柏林</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S 相机电源</td><td>IonOptix，马萨诸塞州米尔顿，美国</td><td>MCS-100</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer 电场刺激器</td><td>IonOptix 公司，马萨诸塞州米尔顿，美国</td><td>MYP100</td><td></td></tr><tr><td>压电马达</td><td>Physik Instrumente (PI) GmbH &amp;amp; Co. KG，德国卡尔斯鲁厄</td><td>E-501.00</td><td></td></tr><tr><td>硅脂</td><td>RS Components，科比，英国</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>软件 Axon pClamp</td><td>Molecular Devices，圣何塞&amp;eacute;美国加利福尼亚州</td><td>版本 10.5</td><td></td></tr><tr><td>软件 IonWizard</td><td>IonOptix，爱尔兰都柏林</td><td>版本 6.6.10.125</td><td></td></tr><tr><td>软件 MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>阶段测微尺</td><td>Graticules Optics LTD，英国汤布里奇</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腺苷</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A9251-100G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Honeywell Fluka，美国密歇根州马斯基根</td><td>21114-1L</td><td></td></tr><tr><td>L-肉碱盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>C9500-25G</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型，315 U/mg</td><td>美国新泽西州莱克伍德沃辛顿公司</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>肌酸</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>C0780-50G</td><td></td></tr><tr><td>胞嘧啶-&amp;beta;-D-阿拉伯呋喃糖苷</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>盐酸艾司氯胺酮，Ketanest S 25 mg/mL</td><td>辉瑞制药 PFE 有限公司，德国柏林</td><td>PZN-07829486</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素 50 mg/mL</td><td>Gibco，Life Technologies，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠，5,000 IU/mL</td><td>Braun Melsungen AG，德国美尔森</td><td>PZN-03029843</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素（牛胰腺）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>I6634-50MG</td><td></td></tr><tr><td>K-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A6558-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR International GmbH，比利时鲁汶</td><td>26764.260</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Honeywell Fluka，美国密歇根州马斯基根</td><td>35113-1L</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜来源的层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>M199培养基</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A9187-1G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>英国莱斯特郡拉夫堡，Fisher Scientific公司</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液，等渗生理盐水&amp;ouml;0.9% sung</td><td>Braun Melsungen AG，德国美尔森</td><td>3200950</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem GmbH，德国达姆施塔特</td><td>A6579</td><td>无钙&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/毫克&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Na-丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>P2256-100MG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)</td><td>Sigma，英国普尔</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>灰色链霉菌蛋白酶XIV</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>T0625-500G</td><td></td></tr><tr><td>硫喷妥钠 Inresa 0.5 g</td><td>德国弗赖堡 Inresa Arzneimittel GmbH公司</td><td>PZN-11852249</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪，Rompun 2%</td><td>Bayer Vital GmbH，德国勒沃库森</td><td>PZN-01320422</td><td></td></tr></tbody></table>

光遗传学调控心肌细胞活性的机电评估

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

在过去的二十年中，光遗传学工具已被确立为调控可兴奋组织（包括心脏）中特定细胞类型活性的有力手段。虽然通道视紫红质-2（ChR2）常用于去极化心肌细胞（CM）的膜电位，从而可能引发动作电位（AP），但长期以来一直缺乏一种能够可靠抑制CM活性的有效工具。已有研究建议使用阴离子通道视紫红质（ACR）实现光遗传学抑制。本文介绍了一种评估天然ACR蛋白GtACR1（来源于Guillardia theta）在培养的兔心肌细胞中激活效应的实验方案。主要检测指标包括电生理全细胞膜片钳记录以及对心肌细胞收缩的光学追踪，两者均在施加不同模式的光照刺激条件下进行。该方案涵盖从兔心脏分离心肌细胞、细胞接种与培养（最长4天）、通过编码光控氯离子通道的腺病毒进行转导、膜片钳与碳纤维装置的准备、数据采集与分析等步骤。采用全细胞构型的膜片钳技术，可在电压钳模式（V-clamp）下实时记录光激活电流，或在电流钳模式（I-clamp）下记录动作电位（AP）。除膜片钳实验外，我们还开展收缩力测量，以在不干扰细胞内环境的前提下对心肌细胞功能活性进行评估。具体方法是利用碳纤维对细胞施加机械预负荷，并通过追踪肌节长度和碳纤维间距的变化来记录收缩情况。数据分析包括从I-clamp记录中评估动作电位持续时间、从V-clamp记录中测定峰值电流，以及基于碳纤维测量结果计算收缩力。本方案可用于测试不同光遗传效应分子对心肌细胞活性的生物物理效应，这是深入理解光遗传学在心脏组织及完整心脏中作用机制的前提。

在培养的兔CM细胞中表达GtACR1-eGFP（图6 插入）并使用膜片钳技术测量光电流。在-74 mV时，GtACR1的光激活显示出较大的内向电流。在 图6A 峰值电流我P) 在 4 mW/mm²2 为245 pA。动作电位通过电刺激（图6B）或光学方式（图6C）分别施加1.5倍阈值的电流刺激或10 ms的短促去极化光脉冲。分析动作电位时程（APD）数值，电刺激起搏的心肌细胞（CM）的APD20为0.24 ± 0.08 s，APD90为0.75 ± 0.17 s；而光刺激起搏的心肌细胞的APD20为0.31 ± 0.08 s，APD90为0.81 ± 0.19 s（标准误，n = 5，N = 2；本示例中所示的APD20电的 = 0.17 秒；APD 20光学 = 0.27 秒和 APD90电的 = 0.61 秒；动作电位时程 90（APD 90）光学 = 0.68 s 图6D光刺激起搏的心肌细胞表现出较慢的动作电位起始（图6D）。持续照射（64 秒，4 mW/mm²）抑制了 CM 的激活。2）通过使膜电位向氯离子的反转电位（此处为 -58 mV）极化，图6E）。高于阈值1.5倍的电流刺激不会引发动作电位产生（图6F）。通过碳纤维弯曲测定生成的峰值力（图7B、C、E。条件培养基产生的力为 232 µN/mm2 电刺激起搏时图7B）和 261 µN/mm2 光学起搏后（图7C）。长时间的绿光脉冲抑制收缩（图7E）。在光学抑制 64 秒后，重新出现的收缩产生的收缩力降低，经过约 10 次收缩后，收缩力数值恢复至基线水平（以 0.25 Hz 频率起搏， 图7D) 与兔心肌细胞舒张期钙流失情况一致。
<img alt="Optogenetic stimulation results; electrophysiology traces; 525 nm wavelength; voltage-clamp analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Figure 6"> 
图6：电刺激与光刺激起搏/抑制心肌细胞的代表性膜片钳记录 (A在 -74 mV 下使用持续 300 ms、功率 4 mW/mm² 的光脉冲测得的典型光电流2. 我P 表示峰值电流。插图显示一个 GtACR1-eGFP 阳性细胞。（B) 使用10 ms、0.6 nA的电流斜坡在0 pA下进行电刺激心肌细胞的代表性动作电位记录。C使用10 ms、0.4 mW/mm²光脉冲在0 pA条件下记录的动作电位代表性结果2. (D上方图表显示了10条曲线的叠加th 电刺激（蓝色）与光刺激（绿色）激活的心肌细胞动作电位。动作电位按膜电位最大变化率（dV/dt max）对齐。下图显示光刺激与电刺激触发的动作电位之间膜电位的差异。E光学-E电的). (E电刺激触发的动作电位在持续 64 秒、4 mW/mm² 的光照下受到抑制2. (F在持续光照下，动作电位（AP）可被高于阈值1.5倍的电流注入（从0.7 nA开始，以0.1 nA为步长递增至2.2 nA）所抑制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肌节长度分析；肌节与碳纤维距离图；力测量数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图7"> 
图7：光学与电刺激/抑制心肌细胞的碳纤维记录代表性数据。（A）数据采集软件中的显示界面。图像（I）显示被测心肌细胞及用于计算肌节长度的分析窗口。细胞宽度以橙色标注。（1）相关频率范围。（2）快速傅里叶变换（FFT）功率谱显示细胞上肌节间距的频率，平均肌节长度由峰值频率计算得出。（3）肌节长度追踪窗口。（4）强度轨迹。（5）强度轨迹乘以汉明窗后得到加窗强度轨迹。示意图（II）显示细胞的椭圆形横截面，橙色表示宽度，虚线蓝色表示厚度。图像（III）显示碳纤维的位置及其对应的检测框，左侧为红色，右侧为绿色。（6）强度轨迹。（7）强度轨迹的一阶导数（参见数据采集软件手册）。（B）电刺激引发收缩的代表性曲线。图（I）显示肌节长度缩短，图（II）显示两根碳纤维之间的距离变化。（C）光学刺激引发收缩的代表性曲线（525 nm，0.25 Hz，10 ms，6 mW/mm2）。图（I）显示肌节长度缩短，图（II）显示两根碳纤维之间的距离变化。（D）在动作电位生成被抑制导致暂停后，第1至第11次收缩产生的峰值力。（E）持续光照下光学抑制收缩的代表性曲线（525 nm，64 s，6 mW/mm2）。图（I）显示肌节长度缩短，图（II）显示两根碳纤维之间的长度变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>面积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACR</td>
			<td>阴离子通道视紫红质</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP</td>
			<td>动作电位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APD</td>
			<td>动作电位时程</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFU</td>
			<td>菌落形成单位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChR</td>
			<td>通道视紫红质</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM</td>
			<td>心肌细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP</td>
			<td>增强型绿色荧光蛋白</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESD</td>
			<td>收缩末期细胞形变</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EU</td>
			<td>内毒素单位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>力</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFT</td>
			<td>快速傅里叶变换</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GtACR</td>
			<td>Guillardia theta 阴离子通道视紫红质</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUI</td>
			<td>图形用户界面</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-clamp</td>
			<td>电流钳</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IU</td>
			<td>国际单位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOI</td>
			<td>感染复数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-HEMA</td>
			<td>聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-clamp</td>
			<td>电压钳</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：缩略语列表。
<img alt="光强随时间变化图、光激发测量、光子实验结果示意图。" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="补充图1"> 
补充图1：使用光功率计进行的光强测量。（A）在4 mW/mm2条件下对10 ms光脉冲的测量。（B）在4 mW/mm2条件下持续照射64 s的测量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="电生理测量；动作电位图；肌节长度示意图；显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="补充图2"> 
补充图2：新鲜分离心肌细胞的特性及其在培养中的结构适应性。（A）新鲜分离心肌细胞的动作电位记录（APD20为1.11 ± 0.34 s，APD90为1.96 ± 0.32 s，n = 7，N = 2）。平均静息膜电位为-79.3 ± 0.8 mV（n = 7，N = 2）。（B）电刺激下新鲜分离心肌细胞的碳纤维记录。平均峰值力为205 ± 78 µN/mm2（n = 7，N = 2）。（C）新鲜分离心肌细胞的共聚焦图像（I）；培养48小时后的未转导（II）和转导心肌细胞（III）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充材料：用于测定动作电位时程和静息膜电位的MatLab脚本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们提出了一种评估GtACR1激活在兔心肌细胞中机电效应的实验方案。本文详细介绍了细胞分离、培养与腺病毒转导，以及采用膜片钳和碳纤维技术进行的功能实验。

在过去的二十年中，光遗传学工具已被确立为调控可兴奋组织中细胞类型特异性活动的有力手段，包括……

通过该方案，可测试不同光遗传学效应器对心肌细胞活动的生物物理效应，从而推动光遗传学实验在心脏组织及完整心脏中的发展。结合膜片钳技术、肌节追踪以及碳纤维辅助的力学测量方法，我们能够研究GtACR1光激活对心室心肌细胞电活动和机械特性的影响。光遗传学抑制技术有望应用于光学除颤。GtACR1 是一种光遗传学工具，可实现对心脏活动的抑制。该技术完全适用于其他研究领域，如平滑肌和单细胞肌细胞研究。尽管本方案不适用于高通量筛选，但它为心肌细胞电生理功能和机械功能的全面分析提供了有效手段。常言道，一图胜千言。那么一段视频又能传递多少信息呢？我们所采用的一些工具和单细胞拉伸技术以及探针制备方法极为精细复杂，通过视频来展示远比文字描述更加直观易懂。从一只9至10周龄的新西兰白兔的盐水灌注心脏中将血液冲洗干净后，将灌注液更换为低钙、高钾溶液，并在心脏停止跳动后再继续灌注两分钟。灌注酶溶液，在消化开始两分钟后将酶溶液重新循环回储液器，并在消化五分钟后将流速降至每分钟16毫升。当组织在消化40至50分钟后变得柔软时，立即将心脏从灌流插管上剪下，并立即放入阻断液中。加入封闭液直至完全覆盖组织。剪除右心室和室间隔，分离出左心室。去除乳头肌，使用精细镊子和移液器轻轻撕解组织，通过机械解离释放细胞。将细胞悬液通过孔径为1平方毫米的滤网过滤，并通过离心沉淀细胞。然后将心肌细胞沉淀重悬于新鲜的封闭溶液中。进行膜片钳实验时，在细胞培养前立即用每毫升100微克的层粘连蛋白包被已高压灭菌的盖玻片。进行碳纤维实验时，使用95%乙醇与5%水的溶液配制浓度为0.12克/毫升的Poly-HEMA，并将其涂覆于培养皿表面。心肌细胞重悬后10至15分钟，吸除上清液，并将细胞重新悬浮于培养基中。计数后，将细胞以每毫升1.75 × 10⁴个细胞的目标密度接种至培养皿中的盖玻片上。将培养物在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3至4小时。孵育结束后，将盖玻片培养物中的培养基更换为含有腺病毒5型的新鲜培养基，该病毒编码GtACR1-eGFP，感染复数为75。将培养物放回孵箱继续培养48小时。进行膜片钳实验时，使用微电极拉制仪从钠钙玻璃毛细管中拉制1.7至2.5兆欧的膜片电极，并启动数据采集软件。将带有细胞的盖玻片放入盛有外部溶液的记录室中，根据细胞的eGFP荧光选择心肌细胞。接着，用内部溶液填充膜片电极，并将电极安装至电极夹持器上，同时将涂有氯化银的银制记录电极插入内部溶液中。设置膜测试，以0毫伏为基线，施加10毫伏、持续15毫秒的脉冲。达到细胞贴附构型后，在数据采集软件中切换至全细胞模式，钳制电位为-60毫伏。随后轻轻施加负压，击穿膜以进入全细胞构型。成功的破裂将表现为所测电容立即增加。在电压钳制模式下，于负74毫伏记录光激活程序，使用持续300毫秒的光脉冲；或在电流钳制模式下，于零皮安记录动作电位。为制备碳纤维，首先将移液管安装到拉制仪的移液管支架上。将玻璃毛细管拉制成两根移液管，总锥形长度约为11毫米，末端内径约为30微米。接着，使用体视显微镜将一根毛细管对准定位圈，并用弯曲器向下按压毛细管尖端，将其弯曲至最多45度。加热灯丝，直至毛细管在移除弯曲器后仍能保持45度弯曲角度。弯曲毛细管后，使用带有软管的精细镊子从管中取出一根碳纤维，并将其插入毛细管的细端。将碳纤维推入毛细管，直至到达弯曲处。剪断碳纤维，使其从毛细管尖端伸出2 mL，并用氰基丙烯酸酯胶水将纤维固定在每根毛细管的前端部分。为校准光纤，将一根毛细管连接至由显微操作器和压电马达控制的固定装置上。将毛细管向传感器方向移动，并相对于传感器进行对准。将光纤尖端与力传感器接触，但不产生任何作用力。压电马达的总移动距离为 60 微米。将压电马达以六个 10 微米的步进向力传感器移动。该传感器的灵敏度为 0.05 毫牛顿每伏，力的测量范围为 0 至 0.5 毫牛顿。读取每一步的测量电压，并将碳纤维从传感器上移除。为了记录心肌细胞收缩时的力，用Poly-HEMA包被盖玻片表面，并将其放入测量室中。向测量室中加入外部灌流液。将两根载有碳纤维的毛细管固定到载物台显微操作器上，并调整角度，使碳纤维接近与测量室表面水平。为检查纤维是否正确对齐，需聚焦于测量室表面，降低第一根纤维，并水平移动该纤维。纤维尖端应沿测量室表面滑动。对第二根光纤采用相同的步骤。关闭光源后，向腔室中加入几滴培养的细胞悬液，并施加短暂的绿色光脉冲，以筛选出能够响应绿光刺激而发生收缩的细胞。连接第一根光纤时，通过缓慢降低光纤轻柔地压紧细胞，然后释放压力。将第二根纤维与心肌细胞另一端的第一根纤维平行固定，以确保两根纤维之间包含尽可能多的肌节。当两根纤维均固定后，抬起纤维，使细胞不再与腔室表面接触。调节至肌节清晰对焦，将肌节长度追踪窗口设定在两根纤维之间，并使用边缘检测模块追踪纤维的弯曲情况。使用红色和绿色窗口设置检测区域，并在光强度轨迹的一阶导数处定义阈值。在追踪肌节长度和纤维弯曲的同时，进行光学起搏。本实验中，我们以 0.25 赫兹的频率进行起搏。记录至少15次光诱导收缩后，对细胞进行电场刺激。找到引发收缩的阈值，并以阈值电压的1.5倍进行电起搏。对于抑制实验方案，先施加电刺激以诱导收缩，然后在不同光强度下对细胞施加持续的光脉冲。在光抑制后记录至少15次收缩。GtACR1在培养的兔心肌细胞中表达。在光强为每平方毫米4毫瓦、持续300毫秒的光照下激活GtACR1，在-74毫伏时产生显著的内向电流，测得峰值电流为245皮安。在此代表性实验中，动作电位通过电流注射（强度为阈值的1.5倍）或10毫秒光脉冲分别进行电刺激或光刺激触发。光刺激起搏的心肌细胞表现出较慢的动作电位起始。在持续光照下，电刺激触发的动作电位受到抑制。在持续光照期间，即使施加更高的电流刺激或达到阈值1.5倍的刺激强度，也不会引发动作电位。心肌细胞在电起搏时产生的收缩力为232微牛顿每平方毫米，而在光起搏后收缩力为261微牛顿每平方毫米。延长的绿色光脉冲可抑制收缩，抑制后重新出现的收缩所产生的收缩力较低，这与兔心肌细胞舒张期钙离子流失的现象一致。我们建议在开展实验前先练习相关技术，尤其是在黑暗环境中定位微电极可能具有挑战性。分析心肌细胞收缩功能时，这一点极为重要，因为它可能影响力量的产生和舒张过程。此外，还可施加不同的后负荷，用于等张和辅助张力收缩分析。这些技术可用于表征在心肌细胞中激活新开发的光遗传学效应器所产生的生物物理效应，这对于为每个实验选择最合适的光遗传学工具至关重要。请注意，腺病毒转导以及转导后的所有操作步骤均须在生物安全二级条件下进行。

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