利用 IBA1 和 TMEM119 进行免疫荧光染色以分析小鼠脑组织中小胶质细胞密度、形态及外周髓系细胞浸润

本实验方案将向您展示如何对小胶质细胞进行染色，并进行定量密度和形态学分析，以及如何量化巨噬细胞向脑组织的浸润。该技术使研究人员能够以定量的方式测量小胶质细胞分布和形态的变化，并区分小胶质细胞与浸润的巨噬细胞。只要存在抗IBA1和抗TMEM119抗体，该分析方案可轻松应用于其他动物模型，以检测小胶质细胞分布和形态的变化。强烈建议在对实验条件设盲的情况下进行细胞计数和形态追踪，并在操作过程中保持方法的一致性。

开始此操作时，打开一个已安装最近邻距离插件的图像处理程序，例如 Fiji 或 ImageJ。如果文件的元数据中包含比例尺但未从元数据自动设置，则打开20倍图像。在菜单栏中，选择“分析”→“设置比例尺”，然后输入正确的信息。

若要根据图像上印制的标尺手动设置比例尺，请选择直线工具。将光标置于标尺边缘，按住 Shift 键，尽可能贴近图像上的标尺绘制一条直线。然后选择“分析”菜单中的“设置比例尺”。

弹出窗口后，输入正确的已知距离和长度单位，以确定每个长度单位对应的像素数，然后单击“确定”。接下来，选择“图像”→“颜色”→“合成”以创建所有通道的合成图像。在菜单栏中，选择“分析”→“设置测量”，勾选“面积”、“质心”和“周长”。

在“重定向到”下拉菜单中，选择“打开文件”，然后单击“确定”。转到“图像”→“颜色”→“通道工具”以打开通道工具。使用“自由选择”工具在感兴趣区域周围绘制一个粗略的轮廓。双击工具栏上的“椭圆”工具以启用“选择画笔”工具。

确保已勾选“启用选择画笔”复选框，然后单击“确定”。使用选择画笔调整轮廓，使其最贴合目标区域，随后在整个该区域按下键盘上的 T 键以进入 Y 管理器。选择“分析”→“测量”，或按下 M 键，结果窗口将弹出。将结果复制并粘贴到数据表中，并保存有关该区域面积的信息。

复制感兴趣区域的范围后，单击“结果”窗口并按 Backspace 键以清除其中的信息。选择 ROI 管理器窗口，选中该 ROI 轨迹，按“重命名”按钮将其名称更改为与图像名称一致。单击“确定”，然后右键单击 ROI 轨迹的新名称并保存。

双击工具栏中的画笔工具。选择黑色和大小为10的画笔。确保未选中“在叠加层上绘制”选项。

在 TMEM119 通道中，对每一个 TMEM119 阳性的小胶质细胞，在其胞体中心仔细标记一个黑点。对 TMEM119 非阳性的细胞，在其中心标记一个白点。对感兴趣区域内包含的所有细胞重复相同操作。

接下来，选择图像、颜色、拆分通道，每个通道将显示一个窗口。找出含有点状标注的通道，并关闭另外两个窗口。要重新定向新拆分的通道图像，请进入分析、设测量值。

在“重定向到”下拉菜单中，选择“分通道图像”，然后单击“确定”。接着选择“图像”→“类型”→“8 位”。转到“图像”→“调整”，选择“阈值”。将两个滑块均向左滑动至最末端。

这将仅保留黑色圆点，此时它们将显示为白色。在“区域兴趣管理器”窗口中选择感兴趣的区域。在菜单栏中，选择“分析”，然后选择“分析颗粒”。

在“大小”文本框中输入 1 至 20。请勿勾选“像素单位”复选框，而应勾选“显示结果”、“汇总”和“添加到管理器”复选框。单击“确定”以显示“汇总”窗口，该窗口将给出点的数量。

将此信息复制并粘贴到数据表中。然后，选择插件 NND 以显示 NND 窗口。每个数字代表每个多形核小胶质细胞与其最近邻的小胶质细胞之间的距离。

将所有这些信息复制并粘贴到数据表中。返回“阈值”窗口，将顶部滑块完全向右调整，使所有白色点保持可见，此时点呈现为白色。选择“分析”菜单中的“分析颗粒”，以显示“分析颗粒”弹出窗口。

单击“确定”以显示提供点数的摘要窗口。将此信息复制并粘贴到数据表中。转到 ROI 管理器并选择所有点。

然后右键单击并使用图像名称保存。这将允许将所有点保存为一个 ZIP 文件。首先，打开 4DX 图像文件。

将弹出一个窗口，询问是否应在堆栈中打开图像。单击“确定”。接下来，选择图像（Image），堆栈（Stacks），Z投影（ZProject）以打开Z投影窗口。包含从第一层到最后一层的所有切片。

在“投影类型”下确保选择“最大强度”，然后单击“确定”。单击包含Z投影的新窗口，选择“图像”→“颜色”→“拆分通道”，并在IBA1通道的图像上进行轨迹分析。在菜单栏中，选择“分析”→“设置测量”。

检查面积、质心和周长。在“重定向到”下拉菜单中，选择打开的文件，然后单击“确定”。若要根据图像上印制的标尺手动设置比例，选择“直线工具”。将光标置于标尺边缘，按住 Shift 键，尽可能贴近图像上的标尺绘制一条直线。

选择“分析”，“设置比例尺”。此时将弹出一个窗口。输入已知的正确距离及长度单位，以确定每单位长度的像素数，然后点击“确定”。要测量 IBA1 通道中的胞体大小，使用套索选择工具勾勒出胞体的大致轮廓。

双击工具栏上的椭圆工具以启用选择画笔工具。确保已勾选“启用选择画笔”复选框，然后单击“确定”。使用选择画笔，调整轮廓以最佳贴合细胞体。在此步骤中放大图像可提高操作精度。

接下来，按 T 键将胞体轨迹添加到 ROI 管理器中。选择“分析”→“测量”，或按 M 键以显示结果。将这些结果复制并粘贴到数据表中。

转到 ROI 管理器窗口，选择感兴趣区域，通过点击“重命名”将其名称更改为与图像名称一致。右键单击重命名后的感兴趣区域，然后点击“保存”。确保文件名注明该轨迹用于胞体，并保存文件。

为了测量IBA1通道中的分支区域面积，首先选择多边形选区工具。使用该工具点击小胶质细胞突起末端以开始绘制多边形。沿着每个突起末端的尖端依次点击，围绕小胶质细胞形成一个多边形，使其最准确地代表小胶质细胞分支所覆盖的区域。

当多边形绘制完成后，单击起点以闭合该多边形。然后按 T 键将轨迹添加到 ROI 管理器中。选择“分析”→“测量”，或按 M 键，将数据添加到“结果”窗口。

将此数据复制并粘贴到数据表中。若要保存有关分支区域的信息，请进入“ROI Manager”窗口，选择感兴趣区域，通过点击“Rename”将其名称更改为与图像名称一致。右键单击重命名后的感兴趣区域，然后点击“Save”。

确保名称注明该轨迹用于分支分析，并保存文件。本研究描述了对小鼠脑组织中IBA1和TMEM119进行免疫荧光共染色的逐步操作流程，以及对小胶质细胞密度、分布和形态特征，以及外周髓系细胞浸润的分析方法。采用荧光显微镜对背侧海马冠状切片中IBA1和TMEM119共标记的小胶质细胞进行成像，放大倍数为20X。

成功的染色可显示小胶质细胞的胞体及其精细突起。该染色方法可用于确定小胶质细胞的密度与分布，识别小胶质细胞簇以及浸润的巨噬细胞。采用共聚焦显微镜以40倍放大倍数对小胶质细胞分支结构的逐步追踪过程进行成像。

这些代表性结果展示了 IBA1 阳性和 TMEM119 阳性的小胶质细胞，以及细胞体追踪的一个示例。在计数细胞时保持一致性非常重要，同时需关注 IBA1 和 TMEM119 的两种信号。该技术可帮助研究人员确定大脑中受特定刺激影响的区域，随后可利用互补技术对这些区域进行更深入的研究。