Name: 使用IBA1和TMEM119进行小鼠脑微胶质密度、形态学和周围骨髓细胞渗透分析的免疫荧光染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习使用IBA1和TMEM119抗体对小鼠脑组织进行免疫荧光共染色，定量分析小胶质细胞密度、形态及骨髓细胞浸润。该方法可区分小胶质细胞与浸润巨噬细胞，适用于神经炎症研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Nathalie Vernoux在实验方面提供的指导和帮助。我们还要感谢Emmanuel Planel博士和Serge Rivest博士分别提供荧光显微镜和共聚焦显微镜的使用支持。本研究部分资金来自墨西哥科学技术委员会（CONACYT；资助F.G.I）、Famille-Choquette基金会和神经科学专题研究中心（CTRN；资助K.P.）、魁北克健康研究基金会（Fonds de Recherche du Québec - Santé；资助M.B.）、印加研究所（Shastri Indo-Canadian Institute；资助K.B.），以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向M.E.T.提供的发现基金。M.E.T.现任加拿大健康与治疗神经免疫可塑性研究讲席（二级）。

所有实验操作均遵循机构动物伦理委员会的指南，并符合加拿大动物护理委员会和拉瓦尔大学动物护理委员会的规定。
1. 免疫染色
<ol>
	<li>借助脑图谱选择包含目标区域（ROI）（即海马体）的三个小鼠脑切片。将切片放入塑料多孔板中，并用 350 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖（表 1）。 
	注意：为获得最佳结果，应使用 4% 多聚甲醛灌注固定脑组织，并用振动切片机切成 50 µm 厚度。对于 24 孔多孔板，每个孔最多可容纳六个切片。建议每个孔的溶液用量为：最多三个切片时使用 350 µL，六个切片时使用 500 µL。若切片数量较多，建议使用 12 孔多孔板。确保每个孔中所加溶液的体积足以完全覆盖组织并使切片自由漂浮。该推荐体积适用于后续实验步骤中使用的全部溶液。</li>
	<li>用 350 µL PBS 覆盖样本，并将多孔板置于多功能摇床上，室温（RT）孵育。5 分钟后吸除 PBS，并更换新鲜 PBS，重复洗涤 5 次。 
	注意：建议使用移液器进行溶液更换。加入任何溶液时，应将移液器吸头紧贴孔壁缓慢加入，以保护组织完整性。同时，每种新溶液均应使用新的移液器。</li>
	<li>吸除 PBS，加入 350 µL pH = 6.0 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（表 1）。</li>
	<li>用石蜡膜密封多孔板，置于预热的水浴中，70 °C 漂浮孵育 40 分钟。</li>
	<li>让多孔板冷却约 15 分钟。</li>
	<li>吸除柠檬酸钠缓冲液，并按照步骤 1.2 的方法用 PBS 洗涤切片。</li>
	<li>吸除 PBS，加入 350 µL 新鲜配制的 0.1% NaBH4 溶液（表 1），室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除 0.1% NaBH4 溶液，并按照步骤 1.2 的方法用 PBS 洗涤切片。</li>
	<li>吸除 PBS，加入封闭缓冲液（表 1），在多功能摇床上室温孵育 1 小时。 
	注意：请确保配制双倍体积的封闭缓冲液，因为下一步将使用相同的溶液。</li>
	<li>吸除封闭缓冲液，替换为含有初级抗体混合液（1:150 小鼠抗 IBA1 抗体 + 1:300 抗 TMEM119 抗体）的封闭缓冲液。用石蜡膜密封多孔板，4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>次日，将样本在室温复温约 15 分钟。</li>
	<li>用含吐温的 PBS（PBST）（表 1）洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 5 次。</li>
	<li>吸除 PBST，加入含有次级抗体混合液的封闭缓冲液（1:300 驴抗小鼠 Alexa 488 标记抗体用于 IBA1；1:300 羊抗兔 Alexa 568 标记抗体用于 TMEM119），室温孵育 1.5 小时。从此步骤开始，所有操作均需避光。</li>
	<li>吸除封闭缓冲液，并按照步骤 1.2 的方法用 PBST 洗涤切片 5 次。</li>
	<li>吸除 PBST，加入 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）[1:20000]，室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>吸除 DAPI，用磷酸盐缓冲液（PB）洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将切片封固于显微镜载玻片上。在避光条件下自然干燥。</li>
	<li>干燥后，滴加适量荧光封片介质，加盖盖玻片，避免气泡产生。 
	注意：将载玻片置于组织学玻片盒中，避光保存于 4 °C。样本可保存数月。</li>
</ol>
2. 用于密度和分布分析的成像
<ol>
	<li>借助宽场落射荧光显微镜，使用低倍镜并通过 DAPI 通道定位感兴趣区域（即海马体的 CA1 区）。</li>
	<li>使用 20 倍物镜、数值孔径（NA）为 0.5 的条件，结合 DAPI、488 和 568 通道及相应滤光片，以 0.3 µm/像素的分辨率采集图像。拍摄覆盖感兴趣区域的拼接图像；或者拍摄多幅单独图像，后续拼接成一幅更大的图像。 
	注意：拼接图像是由多个较小图像组合而成的合成图像，通常用于克服高倍镜视野范围有限的问题。某些软件自带拼接功能，但也可使用其他图像编辑软件手动将各幅图像拼接为一幅完整图像。请务必在文件中添加比例尺信息。对于此类分析，建议每个动物每个感兴趣区域至少采集 300 个小胶质细胞的图像（例如，海马体区域大约对应 10−15 幅图像），每种实验条件至少包含五只动物。图 1A−C 展示了共标记的小胶质细胞图像。</li>
	<li>将图像保存为 TIFF 文件。</li>
</ol>
3. 形态学分析成像
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜或结构照明显微镜，通过 DAPI 通道在低倍镜下定位感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>使用 40x 物镜（例如，NA 1.4 油镜），在 ROI 内找到一个 IBA1+/TMEM119+ 细胞。在进行活体成像时，沿 Z 轴移动。一旦随机选定的小胶质细胞信号消失，将该 Z 平面设为 Z 层切的起始位置；然后沿相反方向移动 Z 轴，直至小胶质细胞信号再次消失，并将该点设为 Z 层切的终止位置。 
	注：图 2A−C 展示了 IBA1+/TMEM119+ 小胶质细胞的图像。</li>
	<li>使用 0.33 µm 的 Z 间距和 0.15 µm/像素的像素尺寸，在三个通道（DAPI、488、568）中创建 Z 层切图像，并将比例尺信息添加到文件中。 
	注：推荐的 Z 间距取决于物镜的分辨能力（例如，对于 NA 1.4 油镜的 40x 物镜，推荐值为 0.33 µm）。进行形态学分析时，建议每只动物至少分析 20 个细胞，每种实验条件至少包含五只动物。</li>
	<li>将文件保存为 TIFF 格式。</li>
</ol>
4. 密度与分布分析
<ol>
	<li>安装最近邻距离（NND）插件后打开 FIJI/ImageJ，并打开 20 倍图像。 
	注意：使用搜索引擎搜索关键词“Nearest Neighbor Distances Calculation with ImageJ”以查找安装说明。该插件作者为 Yuxiong Mao。</li>
	<li>若需根据图像上标注的比例尺手动设置尺度，选择直线工具（图 3E），将光标置于比例尺边缘，按住 Shift 键的同时，在图像上尽可能贴近比例尺画一条线（图 3I），然后选择 分析 | 设置尺度，并输入正确的信息（图 3J）。 
	注意：比例尺有时包含在文件的元数据中，可自动设置。</li>
	<li>在菜单栏中选择 图像 | 颜色 | 合成图像，以创建所有通道的合成图像。 
	注意：在图像采集过程中，FIJI/ImageJ 会自动以 RGB 格式创建合成图像。</li>
	<li>在菜单栏中选择 分析 | 设置测量值。勾选 面积、质心 和 周长。在 重定向至 选项卡中，点击并选择已打开的文件（图 3K）。</li>
	<li>进入 图像 | 颜色 | 通道工具 以打开通道工具。 
	注意：此菜单允许禁用特定颜色。DAPI 通道有助于识别感兴趣区域（ROI）并确认细胞位置，可将其关闭以简化计数过程。</li>
	<li>使用自由手绘选择工具在 ROI 周围绘制大致轮廓（图 3D）。</li>
	<li>通过双击工具栏上的椭圆工具启用选择画笔工具，并确保勾选了 启用选择画笔 选项（图 3G）。该工具将用于更精确地描绘 ROI。选择 200−400 之间的合适画笔尺寸。</li>
	<li>使用选择画笔调整 ROI 轮廓至最佳匹配。按键盘上的 T 键将其添加至 ROI 管理器（图 3L）。</li>
	<li>选择 分析 | 测量 或按下 M 键，结果窗口将弹出。将结果显示复制并粘贴到数据表中，然后保存与面积相关的信息（即 ROI 的面积；图 3R）。</li>
	<li>复制 ROI 面积后，点击结果窗口并按下 Backspace 键清除其中的信息。</li>
	<li>进入 ROI 管理器窗口（图 3L），右键单击 ROI 轮廓，将其名称更改为与图像名称一致，然后保存。</li>
	<li>双击工具栏上的画笔工具，选择黑色和尺寸为 10 的画笔。确保取消勾选 绘制覆盖层 选项（图 3H）。</li>
	<li>在 TMEM119 通道中，为每个 TMEM119+ 小胶质细胞的胞体中心仔细放置一个黑点。对 TMEM119 阴性细胞（标记浸润性巨噬细胞）的细胞中心放置白点。对 ROI 内所有细胞重复此操作。 
	注意：所有点（黑点和白点）必须位于同一通道中。可通过观察图像窗口标签的颜色（红色、蓝色或绿色）来确认通道身份。</li>
	<li>选择 图像 | 颜色 | 拆分通道。每个通道将显示为独立窗口。随后识别包含点注释的通道，并关闭其余两个窗口。</li>
	<li>重定向新拆分的通道图像。进入 分析 | 设置测量值。在 重定向至 选项卡中，点击并选择拆分后的通道图像（图 3K）。</li>
	<li>选择 图像 | 类型 | 8 位。进入 图像 | 调整 并选择 阈值（图 3O）。调整阈值时，将第二根滑条完全向左滑动（两个滑条的阈值均设为 0）。 
	注意：此操作将仅保留图像上的黑点，且其显示为白色。</li>
	<li>在 ROI 管理器窗口中选择 ROI。选择 分析 | 分析粒子（图 3N）。在 大小（inchˆ2） 栏中输入 1−20。保持像素单位未勾选，勾选 显示、汇总并添加至管理器，然后点击 确定。汇总窗口将弹出并显示点的数量（图 3P）。将信息复制并粘贴至数据表中。</li>
	<li>选择 插件 | NND。NND 窗口将弹出（图 3Q）。将所有信息复制粘贴至数据表中。每个数值代表一个小胶质细胞与其最近邻小胶质细胞之间的距离。</li>
	<li>返回阈值窗口，将第一根滑条完全向右滑动（两个滑条的阈值均设为 255），使所有白点可见并显示为白色（图 3M）。</li>
	<li>选择 分析 | 分析粒子。提供点数的汇总窗口将弹出（图 3P）。将信息复制并粘贴至数据表中。</li>
	<li>进入 ROI 管理器，选择所有点，右键单击并以图像名称保存。这将把所有点保存为一个 zip 文件（图 3L）。选择 文件 | 另存为，并以可识别所分析图像的名称保存文件。</li>
	<li>通过将 IBA1+/TMEM119+ 双阳性细胞数量除以 ROI 面积，计算小胶质细胞密度（每张图像）。 
	注意：每张图像的数值可在每只动物内取平均值。数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。</li>
	<li>通过获取每张图像中所有 TMEM119+ 细胞 NND 值的平均值，确定 NND。 
	注意：数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。</li>
	<li>使用公式计算间距指数：NND2 × 密度。 
	注意：数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。该测量值的单位为任意单位。</li>
	<li>通过识别 NND 小于 12 µm 的细胞来量化小胶质细胞簇。 
	注意：此处选择 12 µm，因其近似两个直接相邻且突起相互接触的小胶质细胞之间的距离。若满足此条件的细胞超过三个，请返回图像确认这些细胞属于单个簇还是多个簇。</li>
	<li>确认簇的数量后，将簇数记录在数据表中。 
	注意：可通过将簇数除以 ROI 面积，获得每只动物的细胞密度（个/mm2）。数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。</li>
	<li>为确定外周髓系细胞浸润百分比，计算每只动物中 IBA1+/TMEM119- 细胞占总髓系细胞数（TMEM119+/IBA1+ + TMEM119-/IBA1+）的百分比。 
	注意：数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。</li>
</ol>
5. 形态学分析
<ol>
	<li>打开 FIJI/ImageJ。</li>
	<li>使用 Image J 或 FIJI 打开 40x 图像。选择后将弹出一个窗口，询问是否以堆栈形式打开图像。点击 确定。接着选择 图像 | 堆栈 | Z 投影，以打开 Z-投影窗口。包含从第一层到最后一层的所有切片。确保在 投影类型 下选择 最大强度投影，然后点击 确定。</li>
	<li>点击显示 Z 投影结果的新窗口。选择 图像 | 颜色 | 拆分通道。在 IBA1 通道的图像上进行轮廓追踪。 
	注意：在小胶质细胞形态学分析过程中，其他通道（TMEM119 和 DAPI）可保持打开状态，并根据需要参考。</li>
	<li>在菜单栏中选择 分析 | 设置测量值。勾选 面积、质心 和 周长。在 重定向至 选项卡中，选择已打开的文件（图 3K）。</li>
	<li>按照步骤 4.2 中所述设置比例尺。</li>
	<li>为测量 IBA1 通道中的胞体大小，使用自由手绘选择工具在胞体周围绘制大致轮廓（图 3D）。</li>
	<li>通过在工具栏上双击椭圆工具，然后勾选 启用选择画笔框，以启用选择画笔工具（图 3G）。选择 10−20 之间的画笔尺寸（图 3B）。</li>
	<li>使用选择画笔工具，调整轮廓以最佳贴合胞体。在此步骤中放大图像可提高精确度（图 2I）。</li>
	<li>按下 T 键，将胞体轮廓添加至 ROI 管理器（图 3L）。</li>
	<li>选择 分析 | 测量，或按下 M 键。将弹出结果窗口。将结果复制并粘贴至数据表中（图 3R）。</li>
	<li>为保存有关胞体面积的信息，请进入 ROI 管理器窗口，右键点击该 ROI，将其名称更改为与图像名称一致，并注明该轮廓用于胞体，然后保存文件。</li>
	<li>为测量 IBA1 通道中的分支区域面积，使用多边形选择工具点击小胶质细胞突起的末端，以开始创建多边形（图 3C）。</li>
	<li>沿着小胶质细胞突起的末端，通过在每个突起末端处点击，围绕小胶质细胞绘制一个多边形，以最准确地表示小胶质细胞分支所覆盖的区域（图 2D−H）。 
	注意：确保多边形连接所有小胶质细胞突起的末端。构成多边形的线条不得相交。在围绕突起末端点击时，需注意避免截断任何部分的突起。有时添加额外的点有助于绕过突起。构成多边形的点数与远端突起的数量无直接关联，因此对本研究不具意义。</li>
	<li>通过点击多边形的起始点来闭合多边形。</li>
	<li>按下 T 键，将轮廓添加至 ROI 管理器（图 3L）。选择 分析 | 测量，或按下 M 键。将弹出结果窗口。将结果复制并粘贴至数据表中（图 3R）。</li>
	<li>为保存有关分支区域面积的信息，请进入 ROI 管理器窗口，右键点击该 ROI，将其名称更改为与图像名称一致，并注明用于分支区域，然后保存文件。</li>
	<li>通过计算每只动物所有胞体面积的平均值，确定胞体面积。 
	注意：数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。</li>
	<li>通过计算每只动物所有分支区域面积的平均值，确定分支区域面积。 
	注意：数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。</li>
	<li>对每个小胶质细胞，使用公式“胞体面积 / 分支区域面积”计算形态学指数，并按每只动物取平均值。 
	注意：数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。</li>
</ol>

<ol><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359(2018).</li>
<li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. È <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+across+the+lifespan%3A+from+origin+to+function+in+brain+development%2C+plasticity+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li>
<li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+NTPDase1%2FCD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li>
<li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li>
<li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li>
<li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915(2011).</li>
<li>Rodríguez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li>
<li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease%3A+a+review+of+the+models%2C+the+signals+and+the+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li>
<li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages%2Fmicroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li>
<li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li>
<li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation%2C+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages%2C+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li>
<li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome%2C+chromatin+landscape+and+response+to+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+monocytes%2C+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li>
<li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+infiltrating+monocytes%2Fmacrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation%3A+Effects+on+cognition%2C+learning+and+affective+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuro-Psychopharmacology+and+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案可分为两个关键部分：染色质量和分析。如果染色效果不理想，则无法充分显示小胶质细胞，从而影响对细胞密度、分布和形态的测量结果。此外，还可能低估外周髓系细胞的浸润比例。本方案是经过优化的染色流程，但仍存在多种可能导致图像质量不佳的因素。尽管本方案未包含动物灌注步骤，但如果脑组织固定不充分，将会影响染色质量。此外，充分的灌注是必要的，以确保血管内不存在可能干扰研究结果的巨噬细胞。
关于免疫染色，最关键的细节包括缓冲液的质量、封闭步骤、抗体的适当保存以及脑组织样本的处理。缓冲液的正确配制及其储存会直接影响染色的质量。除非另有说明，某些缓冲液可长期保存，但应避免使用任何显示污染迹象的缓冲液。若缓冲液提前数天或数周配制，在使用前应验证每种溶液的pH值。
此外，在免疫染色过程中，背景染色的存在仍然是最常见的问题之一。背景染色会干扰小胶质细胞的分析，尤其是其形态学特征，从而导致结果出现偏差。为防止背景染色，正确执行封闭步骤至关重要。抗体的保存条件也直接影响其有效性，建议严格遵循生产商提供的储存说明，并避免反复冻融。最后，在整个实验过程中...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

无论是急性还是慢性，神经炎症都受到小胶质细胞的密切调控，小胶质细胞是大脑中的常驻巨噬细胞。通过免疫染色对小胶质细胞进行可视化观察，对于利用光学显微镜研究神经炎症具有重要价值，该技术具有高度可及性。在稳态条件下，小胶质细胞通常以非重叠、马赛克样的模式分布，其胞体较小，并延伸出分支状突起1，这些突起有时会相互接触2。在正常生理状态下，小胶质细胞的分支状突起会动态地监测脑实质，与神经元、其他胶质细胞以及血管发生相互作用3。小胶质细胞表达多种受体，使其能够执行免疫学功能，并对脑内环境变化、细胞死亡或组织损伤作出响应。此外，它们还发挥关键的生理功能，尤其是在突触的形成、维持和清除过程中4,5。
在可用于研究小胶质细胞的多种标志物中，离子化钙结合接头分子1（IBA1）是应用最广泛的标志物之一。IBA1是一种钙结合蛋白，能够极为清晰地显示小胶质细胞的形态，包括细微的远端突起，这一点已通过电子显微镜得到证实6。该工具在表征小胶质细胞转化（过去称为&#34;活化&#34;）方面发挥了重要作用，已被广泛应用于大量动物疾病模型的研究7,8,9。在神经炎症存在的情况下，小胶质细胞的反应包括：小胶质细胞增生（定义为细胞密度增加）、分布模式的改变（有时表现为细胞聚集）、胞体增大，以及突起增粗和缩短，形态趋向于更明显的阿米巴样形状10,11,12,13。
免疫染色技术受限于针对特定标志物的抗体的可获得性。值得注意的是，IBA1 在小胶质细胞中表达，但也表达于浸润大脑的外周巨噬细胞14。尽管在该研究领域中，观察大脑内 IBA1 阳性细胞已成为小胶质细胞的标志，但已有报道表明，在多种条件下甚至在健康大脑中均存在一定程度的外周巨噬细胞浸润15,16,17,18。因此，单独使用 IBA1 无法实现小胶质细胞的选择性可视化。此外，巨噬细胞一旦浸润大脑，便会获得与常驻小胶质细胞相似的分子和形态学特征，从而难以区分19。这在研究小胶质细胞和浸润性巨噬细胞功能时构成了挑战。
尽管小胶质细胞和外周巨噬细胞具有不同的起源（例如，分别起源于胚胎卵黄囊和骨髓20,21），但越来越多的研究发现表明，这两类细胞群体在大脑中发挥着不同的作用19。因此，至关重要的是采用能够区分这两类细胞的方法，且避免使用可能影响其密度、分布、形态和功能的侵入性操作（如骨髓嵌合体或连体共生模型）。TMEM119 已被确认为在健康和疾病状态下均具有小胶质细胞特异性的标志物22。当与 IBA1 联合使用时，该标志物可用于将小胶质细胞与浸润性巨噬细胞区分开来，后者为 TMEM119 阴性而 IBA1 阳性。尽管 TMEM119 的表达具有发育阶段依赖性，但其最早在出生后第3天（P3）和第6天（P6）即开始表达，并持续上升，至出生后第10至14天（P10–P14）达到成年水平22。而 IBA1 则早在胚胎第10.5天（E10.5）即开始表达23。因此，本研究所提出的双标染色方案适用于在整个出生后发育阶段对这两类细胞群体进行研究。
本方案提供了一步一步的免疫染色操作流程，可实现小胶质细胞与外周巨噬细胞的区分。同时，本方案还阐述了如何对小胶质细胞的密度、分布和形态进行定量分析，以及对外周巨噬细胞浸润情况进行分析。尽管对小胶质细胞和外周巨噬细胞的研究本身已具有重要意义，但该方案还可进一步实现神经炎症病灶的定位，因此也可作为平台用于识别特定研究区域，以便结合其他互补性（但更耗时耗资源）的技术进行深入研究。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗兔</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Biolite 24 孔多孔培养皿</td><td>Thermo Fisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 核酸染料</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>MP 01306</td><td></td></tr><tr><td>细刷</td><td>美术用品店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>冷水鱼皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>1254418</td><td></td></tr><tr><td>带正电荷的载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗 IBA1 抗体</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>SPM306, SPM400</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>SPD307, SPD600</td><td></td></tr><tr><td>NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480886</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642500</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清 (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清 (NGS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm-M</td><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗 TMEM119 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>25 型往复式摇床</td><td>Precision Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐酸盐</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>TRS002/TRS004</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

利用 iba1 和 tmem119 进行免疫荧光染色以分析小鼠脑组织中小胶质细胞密度、形态及外周髓系细胞浸润

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

本方案用于小鼠脑组织中常驻小胶质细胞与浸润性巨噬细胞的双重可视化。通过联合使用特异性标记小胶质细胞的TMEM119与可清晰显示细胞形态的IBA1，可对细胞密度、分布及形态学变化进行研究。定量分析这些参数对于揭示小胶质细胞——即脑内常驻巨噬细胞——在生理与病理过程中的功能具有重要意义。在正常生理状态下，小胶质细胞呈马赛克样规律分布，胞体较小，并具有分支状突起。然而，当受到环境因素（如创伤、感染、疾病或损伤）刺激时，小胶质细胞的密度、分布和形态会以多种方式发生改变，具体变化取决于刺激类型。此外，本方案所描述的双重染色方法可通过检测IBA1表达且不与TMEM119共定位的细胞，实现对脑内浸润性巨噬细胞的可视化。因此，该方法能够区分小胶质细胞与浸润性巨噬细胞，这对于深入理解二者在健康与疾病状态下对脑内稳态的不同功能贡献至关重要。本方案整合了神经免疫学领域关于特异性标记物鉴定的最新研究成果，既可为经验丰富的神经免疫学研究者提供参考，也可作为希望将神经免疫学技术引入研究项目的研究人员的实用工具。

图1显示了使用IBA1和TMEM119对背侧海马冠状切片进行的小胶质细胞共标记，图像通过荧光显微镜在20倍放大下获取。成功的染色可清晰呈现小胶质细胞的胞体及其精细突起（图1A−C）。该染色方法可用于评估小胶质细胞的密度与分布情况，并识别小胶质细胞簇（图1I）以及浸润的巨噬细胞（图1F）。
图2展示了IBA1+/TMEM119+小胶质细胞（图2A−C），并以逐步示例展...

本方案详细描述了小鼠脑组织中IBA1和TMEM119的免疫荧光共染色逐步操作流程，以及小胶质细胞密度、分布和形态的分析，同时包括外周髓系细胞浸润的检测。

利用 IBA1 和 TMEM119 进行免疫荧光染色以分析小鼠脑组织中小胶质细胞密度、形态及外周髓系细胞浸润

这是一种用于小鼠脑组织中常驻小胶质细胞与浸润性巨噬细胞双重可视化的方法。TMEM119（标记小胶质细胞……）

本实验方案将向您展示如何对小胶质细胞进行染色，并进行定量密度和形态学分析，以及如何量化巨噬细胞向脑组织的浸润。该技术使研究人员能够以定量的方式测量小胶质细胞分布和形态的变化，并区分小胶质细胞与浸润的巨噬细胞。只要存在抗IBA1和抗TMEM119抗体，该分析方案可轻松应用于其他动物模型，以检测小胶质细胞分布和形态的变化。强烈建议在对实验条件设盲的情况下进行细胞计数和形态追踪，并在操作过程中保持方法的一致性。开始此操作时，打开一个已安装最近邻距离插件的图像处理程序，例如 Fiji 或 ImageJ。如果文件的元数据中包含比例尺但未从元数据自动设置，则打开20倍图像。在菜单栏中，选择“分析”→“设置比例尺”，然后输入正确的信息。若要根据图像上印制的标尺手动设置比例尺，请选择直线工具。将光标置于标尺边缘，按住 Shift 键，尽可能贴近图像上的标尺绘制一条直线。然后选择“分析”菜单中的“设置比例尺”。弹出窗口后，输入正确的已知距离和长度单位，以确定每个长度单位对应的像素数，然后单击“确定”。接下来，选择“图像”→“颜色”→“合成”以创建所有通道的合成图像。在菜单栏中，选择“分析”→“设置测量”，勾选“面积”、“质心”和“周长”。在“重定向到”下拉菜单中，选择“打开文件”，然后单击“确定”。转到“图像”→“颜色”→“通道工具”以打开通道工具。使用“自由选择”工具在感兴趣区域周围绘制一个粗略的轮廓。双击工具栏上的“椭圆”工具以启用“选择画笔”工具。确保已勾选“启用选择画笔”复选框，然后单击“确定”。使用选择画笔调整轮廓，使其最贴合目标区域，随后在整个该区域按下键盘上的 T 键以进入 Y 管理器。选择“分析”→“测量”，或按下 M 键，结果窗口将弹出。将结果复制并粘贴到数据表中，并保存有关该区域面积的信息。复制感兴趣区域的范围后，单击“结果”窗口并按 Backspace 键以清除其中的信息。选择 ROI 管理器窗口，选中该 ROI 轨迹，按“重命名”按钮将其名称更改为与图像名称一致。单击“确定”，然后右键单击 ROI 轨迹的新名称并保存。双击工具栏中的画笔工具。选择黑色和大小为10的画笔。确保未选中“在叠加层上绘制”选项。在 TMEM119 通道中，对每一个 TMEM119 阳性的小胶质细胞，在其胞体中心仔细标记一个黑点。对 TMEM119 非阳性的细胞，在其中心标记一个白点。对感兴趣区域内包含的所有细胞重复相同操作。接下来，选择图像、颜色、拆分通道，每个通道将显示一个窗口。找出含有点状标注的通道，并关闭另外两个窗口。要重新定向新拆分的通道图像，请进入分析、设测量值。 在“重定向到”下拉菜单中，选择“分通道图像”，然后单击“确定”。接着选择“图像”→“类型”→“8 位”。转到“图像”→“调整”，选择“阈值”。将两个滑块均向左滑动至最末端。这将仅保留黑色圆点，此时它们将显示为白色。在“区域兴趣管理器”窗口中选择感兴趣的区域。在菜单栏中，选择“分析”，然后选择“分析颗粒”。在“大小”文本框中输入 1 至 20。请勿勾选“像素单位”复选框，而应勾选“显示结果”、“汇总”和“添加到管理器”复选框。单击“确定”以显示“汇总”窗口，该窗口将给出点的数量。将此信息复制并粘贴到数据表中。然后，选择插件 NND 以显示 NND 窗口。每个数字代表每个多形核小胶质细胞与其最近邻的小胶质细胞之间的距离。将所有这些信息复制并粘贴到数据表中。返回“阈值”窗口，将顶部滑块完全向右调整，使所有白色点保持可见，此时点呈现为白色。选择“分析”菜单中的“分析颗粒”，以显示“分析颗粒”弹出窗口。单击“确定”以显示提供点数的摘要窗口。将此信息复制并粘贴到数据表中。转到 ROI 管理器并选择所有点。然后右键单击并使用图像名称保存。这将允许将所有点保存为一个 ZIP 文件。首先，打开 4DX 图像文件。将弹出一个窗口，询问是否应在堆栈中打开图像。单击“确定”。接下来，选择图像（Image），堆栈（Stacks），Z投影（ZProject）以打开Z投影窗口。包含从第一层到最后一层的所有切片。在“投影类型”下确保选择“最大强度”，然后单击“确定”。单击包含Z投影的新窗口，选择“图像”→“颜色”→“拆分通道”，并在IBA1通道的图像上进行轨迹分析。在菜单栏中，选择“分析”→“设置测量”。检查面积、质心和周长。在“重定向到”下拉菜单中，选择打开的文件，然后单击“确定”。若要根据图像上印制的标尺手动设置比例，选择“直线工具”。将光标置于标尺边缘，按住 Shift 键，尽可能贴近图像上的标尺绘制一条直线。选择“分析”，“设置比例尺”。此时将弹出一个窗口。输入已知的正确距离及长度单位，以确定每单位长度的像素数，然后点击“确定”。要测量 IBA1 通道中的胞体大小，使用套索选择工具勾勒出胞体的大致轮廓。双击工具栏上的椭圆工具以启用选择画笔工具。确保已勾选“启用选择画笔”复选框，然后单击“确定”。使用选择画笔，调整轮廓以最佳贴合细胞体。在此步骤中放大图像可提高操作精度。接下来，按 T 键将胞体轨迹添加到 ROI 管理器中。选择“分析”→“测量”，或按 M 键以显示结果。将这些结果复制并粘贴到数据表中。转到 ROI 管理器窗口，选择感兴趣区域，通过点击“重命名”将其名称更改为与图像名称一致。右键单击重命名后的感兴趣区域，然后点击“保存”。确保文件名注明该轨迹用于胞体，并保存文件。为了测量IBA1通道中的分支区域面积，首先选择多边形选区工具。使用该工具点击小胶质细胞突起末端以开始绘制多边形。沿着每个突起末端的尖端依次点击，围绕小胶质细胞形成一个多边形，使其最准确地代表小胶质细胞分支所覆盖的区域。当多边形绘制完成后，单击起点以闭合该多边形。然后按 T 键将轨迹添加到 ROI 管理器中。选择“分析”→“测量”，或按 M 键，将数据添加到“结果”窗口。将此数据复制并粘贴到数据表中。若要保存有关分支区域的信息，请进入“ROI Manager”窗口，选择感兴趣区域，通过点击“Rename”将其名称更改为与图像名称一致。右键单击重命名后的感兴趣区域，然后点击“Save”。确保名称注明该轨迹用于分支分析，并保存文件。本研究描述了对小鼠脑组织中IBA1和TMEM119进行免疫荧光共染色的逐步操作流程，以及对小胶质细胞密度、分布和形态特征，以及外周髓系细胞浸润的分析方法。采用荧光显微镜对背侧海马冠状切片中IBA1和TMEM119共标记的小胶质细胞进行成像，放大倍数为20X。成功的染色可显示小胶质细胞的胞体及其精细突起。该染色方法可用于确定小胶质细胞的密度与分布，识别小胶质细胞簇以及浸润的巨噬细胞。采用共聚焦显微镜以40倍放大倍数对小胶质细胞分支结构的逐步追踪过程进行成像。这些代表性结果展示了 IBA1 阳性和 TMEM119 阳性的小胶质细胞，以及细胞体追踪的一个示例。在计数细胞时保持一致性非常重要，同时需关注 IBA1 和 TMEM119 的两种信号。该技术可帮助研究人员确定大脑中受特定刺激影响的区域，随后可利用互补技术对这些区域进行更深入的研究。

immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用IBA1和TMEM119进行小鼠脑微胶质密度、形态学和周围骨髓细胞渗透分析的免疫荧光染色

我们描述了一种小鼠经心脏灌注、脑组织的取出与切片，以及免疫过氧化物酶染色、树脂包埋和脑切片超薄切片的实验方案。完成这些步骤后，免疫染色的样品即可用于透射电子显微镜观察。...

小鼠脑组织免疫电子显微镜样品制备

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。...

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

本文介绍了一种深入了解脑部炎症反应复杂性的方法。我们描述了基于免疫荧光的实验方案，结合三维共聚焦分析，用于研究局灶性脑缺血小鼠模型中小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的共表达模式。...

实验性脑损伤中小胶质细胞/巨噬细胞极化标志物的三维共聚焦分析

本入门级实验方案以小胶质细胞和神经元成分的标记物为例，介绍了完成啮齿类动物脑组织免疫组织化学染色所需的试剂、仪器和操作技术。...

冷冻切片大鼠脑组织免疫组织化学染色初学者指南：小胶质细胞与神经元染色示例

本文介绍了一种利用甲氧基-X04对阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样Aβ斑块进行可视化成像的实验方案。甲氧基-X04可穿过血脑屏障，并特异性结合致密核心Aβ斑块中的β-折叠片层结构，从而可在进行免疫染色及电镜制样前对含斑块的组织切片进行预筛选。...

相关光学显微镜与电子显微镜技术研究小胶质细胞与β-淀粉样蛋白斑块的相互作用

我们提出了一种用于鉴定含有人和小鼠IgM抗体抗原的蛋白质组分的方案，这些抗体具有特异性的κ（Vκ）轻链。该方案不仅限于IgM类抗体，也适用于在免疫沉淀过程中能够以足够高亲和力结合其抗原的所有免疫球蛋白同种型。...

针对含Kappa (Vκ) 轻链的人源（IgM）抗体的抗体结合特异性：以附着于NCAM的多唾液酸（PSA）为例的研究

小胶质细胞是大脑中的免疫细胞，可通过形态学变化来监测并响应大脑生理状态的改变，这些形态变化可进行定量评估。本方案概述了一种基于 ImageJ...

使用 ImageJ 对免疫组织化学处理组织的显微照片进行小胶质细胞形态定量分析

本文介绍了一种在小鼠脑内局部或全脑范围内瞬时开放血脑屏障（BBB）以递送荧光标记抗体并激活小胶质细胞的实验方案。同时介绍了一种通过组织学方法检测抗体递送效果及小胶质细胞激活状态的技术。...

利用聚焦扫描超声将抗体递送至大脑

本文介绍的实验方案允许通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞（iPSMG）移植到免疫功能健全的小鼠脑内。文中展示了细胞的制备与鼻腔移植方法，以及为维持iPSMG存活而给予细胞因子混合物的操作步骤。...

通过无创经鼻途径在免疫功能健全小鼠脑内移植人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞

小胶质细胞参数绘图软件（MMPS）是一种用户友好的分析流程，无需编程专业知识，可对免疫荧光图像中的单个小胶质细胞形态进行半自动分析。该软件已在啮齿类动物脂多糖诱导的神经炎症模型中得到验证，能够稳定检测与激活相关的形态学变化，实现标准化、可扩展的小胶质细胞表型分析。...

微胶质细胞参数绘图软件（MMPS）：一种用于定量分析微胶质细胞形态的开源、用户友好型工具

学习使用IBA1和TMEM119抗体对小鼠脑组织进行免疫荧光共染色，定量分析小胶质细胞密度、形态及骨髓细胞浸润。该方法可区分小胶质细胞与浸润巨噬细胞，适用于神经炎症研究。

利用 IBA1 和 TMEM119 进行免疫荧光染色以分析小鼠脑组织中小胶质细胞密度、形态及外周髓系细胞浸润

探索更多视频