体外及植物体内RING型E3泛素连接酶的功能表征

本逐步实验方案介绍了如何通过定点突变方法，在体外和植物体内检测并功能表征RING型E3泛素连接酶的酶活性。通过定点突变技术对RING结构域引入突变，可获得缺乏E3活性的突变体，并将其与野生型蛋白平行进行测试，从而将酶活性与生物学功能相关联。阐明RING型E3泛素连接酶的生化与作用机制基础，将极大促进我们对其在发育、应激信号传导以及稳态维持中生物学意义的理解。

通过对体内表达系统进行轻微修改，本方案可适用于分析任何来源的RING型E3连接酶。首先确定RING结构域中保守的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）氨基酸，然后设计引物，使其携带目标取代密码子，并在突变位点两侧各包含15个碱基对。准确识别RING结构域，特别是其保守的半胱氨酸和组氨酸残基，至关重要。

可以使用 PROSITE 等在线工具完成该操作。利用诱变引物通过 PCR 扩增将目标突变引入含有目的基因的质粒中，并确保使用高保真 DNA 聚合酶（如 Pfu）。PCR 完成后，向 PCR 反应体系中直接加入三微升 Dpnl 限制性内切酶，于 37 摄氏度孵育两小时，以消化来源于大肠杆菌的甲基化和半甲基化亲本 DNA。

使用商业质粒DNA提取试剂盒纯化突变质粒，并用50微升水洗脱DNA。随后，取0.5微升回收的突变质粒DNA，按照生产商说明书转化至DH5-alpha大肠杆菌感受态细胞中。将目标野生型RING基因和突变型RING基因克隆至pMAL-c2载体中，以实现这些基因与MBP表位标签的融合。

然后，按照论文所述，在总体积为 30 微升的体系中建立体外泛素化反应，并在 30 摄氏度下孵育混合物 2 小时。通过向样品中加入 7.5 微升 5x SDS-PAGE 上样缓冲液并煮沸 5 分钟以终止反应，随后使用 7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。将蛋白转移至 PVDF 膜，并通过 Western 印迹法结合抗 FLAG 抗体检测泛素化。

使用考马斯亮蓝染色膜以验证所检测的MBP-RING型蛋白上样量均等。将携带目的表位标签基因的根癌农杆菌菌株在含有适当选择性抗生素的LB培养基上划线培养。在28摄氏度下培养两天后，挑取单菌落，并在含有抗生素的LB液体培养基中于28摄氏度、250 rpm条件下继续培养24小时。

将100微升农杆菌培养物转移至含抗生素的3毫升新鲜LB培养基中，继续培养4至6小时。在1,800 × g条件下离心6分钟，沉淀菌体，弃上清液，并用3毫升洗涤缓冲液重悬菌体。重复洗涤两次后，将菌体重悬于诱导缓冲液中，在28摄氏度下继续孵育10至12小时。

孵育后，在1,800 × g 条件下离心6分钟，弃去上清液。用2 mL浸润缓冲液重悬细胞，并通过OD600值测定细菌浓度。用针头轻轻刺破4周龄的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片，使用注射器手工注入农杆菌（Agrobacterium），然后用记号笔标记浸润区域的范围。

36小时后，收集浸润的叶片组织，用液氮研磨成细粉。加入300微升蛋白提取缓冲液重悬组织粉末，在4摄氏度下以15,000 × g离心15分钟。将上清液转移至新离心管中，加入5× SDS-PAGE上样缓冲液至终浓度为1×，并将样品煮沸5分钟。

然后，进行蛋白质免疫印迹分析以检测植物体内泛素化。划线接种携带目标基因标签或空载体的适当农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株，并按照先前所述方法将农杆菌注射到本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中。对于E3依赖性底物蛋白降解实验，遵循先前描述的方案，并使用适当的抗体进行蛋白质免疫印迹，以检测蛋白在植物细胞中的积累情况。

对于依赖E3的超敏反应介导的细胞死亡抑制，应在农杆菌渗入后2至4天内观察渗入叶片的细胞死亡症状。典型的体外泛素化实验结果表现为从被检测蛋白的分子量开始并向更高分子量延伸的多条带弥散信号。与预期一致，缺失单个组分或使用MBP的阴性对照未出现弥散信号。

此外，PVDF膜的考马斯亮蓝染色显示，所有对照组中MBP-RHA1B或MBP的上样量均相等。为研究体外泛素化如何因特定E2与E3的组合而异，共测试了11种不同的E2酶。检测到的泛素化活性从无信号到在不同分子量处起始的多条带弥散条纹不等，表明存在不同的泛素化模式。

在体外和植物体内测试了RHA1B的RING突变体和K突变体的泛素化能力。RING突变体缺乏酶活性，这由其在体外无法产生多条带弥散信号以及在植物体内不能促进多聚泛素化信号所证实。尽管在体外检测到K突变体存在微弱的自泛素化信号，但在植物体内仅检测到背景水平的泛素化，表明K146残基对E3活性同样至关重要。

与野生型RHA1B不同，缺乏E3连接酶活性的RING突变体不会干扰超敏反应性细胞死亡。Western印迹结果证实，在野生型RHA1B存在的情况下，Gpa2蛋白未发生累积，而RING突变体对蛋白稳定性无影响。鉴于适当的E2-E3组合是泛素化反应所必需的，应同时使用代表不同E2类别的多种E2酶进行体外泛素化实验，以避免出现假阴性结果。

一种E3连接酶缺陷型突变体有助于在体内检测酶与底物之间的相互作用。此外，该突变体通常表现出显性负性表型，可在功能敲除研究中作为RNA干扰的替代策略加以利用。通过本实验方案，近期研究发现线虫效应子RHA1B以E3依赖的方式干扰植物免疫信号通路，其机制是靶向植物免疫受体Gpa2并介导其泛素化与降解。