Name: RING-E3型无二体气体在Vitro和Planta中的功能特性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习利用定点突变技术检测RING型E3泛素连接酶的体外及植物体内酶活性，通过Western blotting分析泛素化模式，揭示其在植物发育与应激信号中的生物学功能。

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我们的研究得益于美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划竞争性拨款（2017-67014-26197；2017-67014-26591）、美国农业部国家食品与农业研究所农场法案拨款、西北马铃薯协会以及爱达荷州农业部特色作物项目的资金支持。

1. 定点突变（图1）
<ol>
	<li>确定RING结构域中的保守Cys和His氨基酸（图1A），并设计携带目标替换密码子的引物，引物两端各包含突变位点上下游15个碱基（图1B）。</li>
	<li>使用含Pfu的高保真DNA聚合酶，以突变引物通过PCR扩增含有目标基因的质粒，在50 µL总PCR反应体系中进行，具体条件见表1和表2，并按照制造商说明书操作。</li>
	<li>向PCR反应产物（步骤1.2）中直接加入3 µL DpnI限制性内切酶，消化来源于Escherichia coli的甲基化及半甲基化亲本质粒DNA，37 °C孵育2 h。 
	注：甲基化是一种转录后修饰，存在于从细菌中提取的质粒DNA上。PCR扩增产生的新质粒拷贝不含甲基化修饰，因此在DpnI处理过程中保持完整。</li>
	<li>使用基于离心柱技术的商业化DNA提取试剂盒纯化突变质粒，并用50 µL水洗脱DNA。</li>
	<li>取0.5 µL回收的突变质粒DNA，按照制造商说明书转化至DH5α E. coli感受态细胞中。简要步骤如下：将感受态细胞与DNA在冰上孵育30 min，42 °C热激20 s，再放回冰上2 min；随后加入500 µL LB培养基，37 °C、250 rpm振荡培养1 h，最后涂布于选择性平板上。</li>
	<li>对从E. coli中提取的质粒DNA进行Sanger测序，验证目标突变是否成功引入。</li>
</ol>
2. 重组蛋白纯化及体外泛素化实验
<ol>
	<li>将目标野生型 RING 基因和突变型 RING 基因克隆至 pMAL-c2 载体中（按照制造商的说明书操作）； 表3) 将这些基因与MBP表位标签融合，以便利用淀粉树脂进行一步纯化。将所得的构建体导入 大肠杆菌 BL21菌株，如步骤1.5所述。</li>
	<li>培养 大肠杆菌 在50 mL LB液体培养基中培养含有目标质粒的BL21菌株，于37℃培养 &#176;2–3 小时，直至达到对数生长期（OD600 0.4–0.6范围内</li>
	<li>加入IPTG至终浓度为0.1–1 mM，以诱导表达目标MBP标签重组蛋白，并孵育 E. coli 在28℃下培养2–3小时 &#176;C. 孵育后将培养物置于冰上。 
	注意：为防止蛋白质降解，步骤 2.4–2.13 需在冰上操作。</li>
	<li>为检测诱导效率，收集1.5 mL诱导后的细胞，于13,000 x g 2 分钟后，移除上清液，并将细胞重悬于 20 &#181;L 2× SDS-PAGE上样缓冲液（24 mM Tris-HCl pH 6.8，0.8% SDS，10% (v/v) 甘油，4 mM DTT，0.04% (w/v) 溴酚蓝）。</li>
	<li>将样品煮沸5分钟，然后在10% SDS-PAGE凝胶上电泳分离。为直观评估MBP融合蛋白（目标蛋白分子量 + 42.5 kDa MBP）的积累情况，用考马斯亮蓝染色液（50%甲醇、10%乙酸、0.1%考马斯亮蓝）振荡染色20分钟，再用脱色液（20%甲醇、10%乙酸）脱色过夜。</li>
	<li>收获剩余的 E. coli 通过1,350 × g离心收集细胞 g 6 分钟后，弃去上清液，用 5 mL 柱缓冲液（20 mM Tris HCl，200 mM NaCl，1 mM EDTA，细菌蛋白酶抑制剂）重悬细胞沉淀。 
	注意：此处可暂停实验流程过夜。冷冻的细胞可在 -20 °C 保存最多 1 周。 &#176;C.</li>
	<li>分解 E. coli 将装有细菌的离心管置于冰水浴中，进行10个超声循环：每个循环包括10秒、30%振幅的超声处理，随后间隔20秒。</li>
	<li>以 13,000 x g 离心样品 g 4℃下 &#176;4°C 下离心 10 分钟，收集上清液（粗提物）。</li>
	<li>准备 500 &#181;15 mL 离心管中加入 L 的直链淀粉树脂。加入 10 mL 冷柱缓冲液，于 1,800 x g, 4 &#176;5 分钟，重复 2 次。</li>
	<li>将5 mL粗提物加入含有淀粉树脂的离心管中，4℃孵育过夜 &#176;C.</li>
	<li>以 1,800 x 离心 g 在 4 &#176;5 分钟离心并弃去上清液。</li>
	<li>向树脂沉淀中加入10 mL柱缓冲液，孵育20分钟，然后在1,800 x g 4 ℃下 &#176;5分钟，重复此步骤2次。</li>
	<li>用含有10 mM麦芽糖的0.5 mL柱缓冲液孵育样品，在4℃下孵育2小时，洗脱融合蛋白。 &#176;C. 以 1,800 x g 在 4 &#176;5分钟内收集洗脱的蛋白。重复此步骤2次。</li>
	<li>将1 mL蛋白组分在冷PBS中透析。将蛋白分装至一次性使用管中（10–20 &#181;L）以避免冻融，并于 -80 保存 &#176;C，直至需要时</li>
	<li>使用Bradford法测定蛋白浓度9.</li>
	<li>在总体积为30 μL的体系中进行体外泛素化反应 &#181;L，通过混合40 ng E1（例如AtUBA1）、100 ng E2（例如AtUBC8、SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32）和1 &#181;克 MBP-RING 类型蛋白，以及 2 &#181;g FLAG-Ub（或 HA-Ub）加入到泛素化缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，2 mM ATP，5 mM MgCl₂）中2，30 mM 磷酸肌酸，50 &#181;g/mL 肌酸磷酸激酶）。将混合物在 30 &#176;C，2 小时。 
	注意：预先配制 20x 泛素化缓冲液，并于 -20 ℃ 保存，可保存长达 6 个月 &#176;分装成小份，每次使用一份。肌酸磷酸激酶在缓冲液反复冻融时容易失去酶活性。</li>
	<li>通过将30 &#181;L 样品加入 7.5 &#181;加入5×SDS-PAGE上样缓冲液（60 mM Tris-HCl pH 6.8，2% SDS，25%（v/v）甘油，10 mM DTT，0.1%（w/v）溴酚蓝），沸水煮5分钟。</li>
	<li>使用7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后将蛋白转移至PDVF膜，通过Western blotting使用抗-FLAG（或抗-HA）抗体检测泛素化。</li>
	<li>使用考马斯亮蓝染色PVDF膜，以验证所检测的MBP-RING型蛋白上样量均一。</li>
</ol>
3. 农杆菌介导的瞬时蛋白表达 Nicotiana benthamiana 叶片及植物体内泛素化检测
<ol>
	<li>划线分离适当菌落 根癌农杆菌 携带目的基因表位标签的菌株（例如，HA-RHA1B，HA-RHA1B）C135S，HA-RHA1BK146R，HA-Ub）以及作为对照的空载体，置于含有适当选择性抗生素的LB培养基中。</li>
	<li>在 28 ℃ 下生长 2 天后 &#176;C，挑取单菌落，于含有适当抗生素的LB液体培养基中，28℃培养 &#176;C/250 rpm，再持续 24 小时。</li>
	<li>转移 100 &#181;将农杆菌培养物接种至3 mL含适当抗生素的新鲜LB培养基中，于28℃继续培养4–6小时 &#176;C，以250 rpm转速振荡培养至对数生长后期。</li>
	<li>1,800 x g 离心农杆菌细胞 g 6 分钟后，弃去上清液，用 3 mL 洗涤缓冲液（50 mM MES pH 5.6，28 mM 葡萄糖，2 mM NaH2PO4重复此步骤 2 次。</li>
	<li>第二次洗涤后，将细胞重悬于诱导缓冲液（50 mM MES pH 5.6，28 mM葡萄糖，2 mM NaHPO₄）中。2PO4, 200 &#181;M 乙酰丁香酮，37 mM NH4Cl, 5 mM MgSO₄4.7H2O，4 mM KCl，18 &#181;M FeSO₄4.7H2O₂，2 mM CaCl₂2）。在28℃下，用诱导缓冲液再孵育细胞10–12小时 &#176;C. 
	注意：乙酰丁香酮可诱导T-DNA转移。</li>
	<li>以 1,800 x g 离心细胞 g 6 分钟，弃去上清液，用 2 mL 浸润缓冲液（10 mM MES pH 5.5，200 &#181;M 乙酰丁香酮）。 
	注意：如果 农杆菌 在诱导缓冲液中孵育后形成聚集体，将离心管静置数分钟使聚集体沉降至管底，然后转移上清液 农杆菌 将悬浮液转移至新离心管，然后进行步骤 3.6。</li>
	<li>使用 OD 测定细菌浓度600 值（600 nm 吸光度下的光密度）。调整 OD600 将数值调整至所需值。 
	注意：通常 OD600 0.2–0.4 的 OD 值最适合单个农杆菌菌株的表达。若使用多种不同农杆菌菌株的组合，则应控制总体 OD 值600 农杆菌菌株的值不应超过1。</li>
	<li>农杆菌浸润4周龄 N. bethamiana 用针轻轻刺破叶片，然后手工注射 农杆菌 用无针注射器进行注射。用记号笔标记出浸润的叶片区域（通常直径为1–2 cm）。</li>
	<li>在农杆菌浸润后36小时收集浸润的叶片组织。使用液氮将组织研磨成细粉。</li>
	<li>用300 μL裂解缓冲液重悬组织粉末 &#956;L 蛋白提取缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，5 mM EDTA，2 mM DTT，10% 甘油，1% 聚乙烯聚吡咯烷酮，1 mM PMSF，植物蛋白酶抑制剂混合物），于 15,000 × g 4°C 下 15 分钟 &#730;C.</li>
	<li>将上清液转移至新离心管中。加入5倍SDS-PAGE上样缓冲液，使终浓度为1倍，煮沸5分钟。</li>
	<li>在10% SDS-PAGE凝胶上分离粗蛋白，转至PVDF膜，并用抗HA抗体探针检测植物体内泛素化。</li>
</ol>
4. 建立酶活性与植物体内功能之间的关联
注意：例如，RHA1B 通过促进抗性蛋白 Gpa2 的降解来抑制 HR 细胞死亡。此步骤展示了如何验证 RHA1B 的这些致病活性依赖于 E3 连接酶功能。
<ol>
	<li>划线接种携带目标基因（本例中为 HA-RHA1B、HA-RHA1BC135S、HA-RHA1BK146R、myc-Gpa2、RBP1）的相应 Agrobacterium tumefaciens 菌株，同时设置空载体作为对照。按照步骤 3.1–3.8 进行 Agrobacterium 的制备，并将其注射至 N. bethamiana 叶片中。</li>
	<li>对于 E3 依赖性底物蛋白降解实验，执行步骤 3.9–3.12，并使用适当的抗体（如抗-HA 和抗-MYC 抗体）进行蛋白质印迹分析，以检测植物细胞中蛋白的积累情况。</li>
	<li>对于 E3 依赖性超敏反应（HR）介导的细胞死亡抑制实验，在农杆菌浸润后 2–4 天内观察浸润叶片的超敏反应细胞死亡症状。</li>
</ol>

<ol><li>Freemont, P. S., Hanson, I. M., Trowsdale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gysteine-rich+sequence+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gysteine-rich sequence motif.</a> Cell. 64, 483-484 (1991).</li>
<li>Borden, K. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+fingers+and+B-boxes%3A+Zinc-binding+protein-protein+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RING fingers and B-boxes: Zinc-binding protein-protein interaction domains.</a> Biochemistry and Cell Biology. 76, 351-358 (1998).</li>
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<li>Borden, K. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solution+structure+of+the+RING+finger+domain+from+the+acute+promyelocytic+leukaemia+proto-oncoprotein+PML%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein PML.</a> The EMBO Journal. 14, 1532-1541 (1995).</li>
<li>Lorick, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING+fingers+mediate+ubiquitin-conjugating+enzyme+%28E2%29-dependent+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 11364-11369 (1999).</li>
<li>Jiménez-López, D., Muñóz-Belman, F., González-Prieto, J. M., Aguilar-Hernández, V., Guzmán, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repertoire+of+plant+RING+E3+ubiquitin+ligases+revisited%3A+New+groups+counting+gene+families+and+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Repertoire of plant RING E3 ubiquitin ligases revisited: New groups counting gene families and single genes.</a> PLoS ONE. 13, 1-28 (2018).</li>
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<li>Kud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potato+cyst+nematode+effector+RHA1B+is+a+ubiquitin+ligase+and+uses+two+distinct+mechanisms+to+suppress+plant+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The potato cyst nematode effector RHA1B is a ubiquitin ligase and uses two distinct mechanisms to suppress plant immune signaling.</a> PLoS Pathogens. 15, 1007720(2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
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<li>Dove, K. K., Stieglitz, B., Duncan, E. D., Rittinger, K., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+RBR+E3+ligase+ubiquitin+transfer+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into RBR E3 ligase ubiquitin transfer mechanisms.</a> EMBO Reports. 17, 1221-1235 (2016).</li>
<li>Metzger, M. B., Pruneda, J. N., Klevit, R. E., Weissman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RING-type+E3+ligases%3A+Master+manipulators+of+E2+ubiquitin-conjugating+enzymes+and+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">RING-type E3 ligases: Master manipulators of E2 ubiquitin-conjugating enzymes and ubiquitination.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1843, 47-60 (2014).</li>
<li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SINAT5+promotes+ubiquitin-related+degradation+of+NAC1+to+attenuate+auxin+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals.</a> Nature. 419, 167-170 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

阐明RING型E3泛素连接酶的生化基础与作用机制，有助于深入理解其在发育、应激信号传导以及稳态维持过程中的生物学意义。本文所述方案结合了定点突变方法与体外及植物体内功能研究。通过在RING结构域的保守位点引入单个氨基酸替换，可获得E3功能缺陷型突变体，并与野生型蛋白平行开展实验，从而将酶活性与生物学功能相关联。
正确识别RING结构域，特别是其保守的Cys和His残基，至关重要。可以使用PROSITE等在线工具进行识别10。为了破坏负责招募E2酶的RING结构域，通常将Cys替换为其结构最相似但无法形成用于锌离子配位的二硫键的Ser。Lorick等人的研究表明，这些关键Cys残基中的任何一个发生突变，都会消除单亚基RING型E3泛素连接酶的泛素化活性5。尽管某些Cys残基在包含RING型蛋白的多亚基E3泛素连接酶复合物中也具有重要作用，但由于这些泛素化复合物具有复杂且动态的三维结构，且RING型蛋白的功能多样，因此在多亚基E3泛素连接酶中对RING结构域内的保守残基进行单个替换，尚未成功产生缺乏连接酶活性的表型11。
在定点突变实验中，我们发现使用较小的质粒载体和较少的扩增循环次数通常可获得更高的突变效率。Pfu 酶可用其他任何高保真性和高延伸性的 DNA 聚合酶替代。此外，如果目的基因含有稀有密码子，可使用另一种 E. coli 菌株 Rosetta，以获得更高产量的重组蛋白。另外，IPTG 诱导的孵育时间和温度也可进一步优化。较低温度会降低 E. coli 的分裂速率，这可能有利于某些蛋白的表达。尽管较高浓度的 IPTG 可提高蛋白表达水平，但它也会抑制 E. coli 的分裂过程，因此不推荐使用。
单亚基RING型E3连接酶不仅可作为分子支架，将E2-Ub中间体与底物紧密定位在一起，还能刺激其对应E2的泛素转移活性。此外，由于E2/E3组合对于决定修饰底物命运的多泛素链的长度和连接方式至关重要，因此在研究RING型E3连接酶时必须考虑其酶学伙伴E212。如图3B所示，并非所有测试的E2都与RHA1B连接酶相容。因此，体外泛素化实验应并行使用代表不同E2类别的多种E2酶，以避免出现假阴性结果。
本文介绍了一种体外酶学检测方法，用于检测待测RING型蛋白的自身泛素化能力。然而，通过少量修改，该方案可轻松适用于检测底物蛋白的体外泛素化。为此，步骤2.15中的体外泛素化反应体系应添加潜在E3泛素连接酶底物的重组蛋白（500 ng）。在30 °C孵育2小时后，加入15 µL抗HA亲和基质（若使用HA-Ub）或抗FLAG亲和基质（若使用FLAG-Ub），于4 °C振荡孵育2小时以捕获泛素化蛋白。随后用冷的泛素洗涤缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，0.1 mM EDTA，0.05% Tween 20，1× PMSF）洗涤树脂4次，每次洗涤后弃去上清液，仅保留40 µL缓冲液，然后进入步骤2.16。通过特异性识别表位标签Ub和底物蛋白的抗体分别检测泛素化信号，若信号出现在底物蛋白的分子量位置，则证实了底物与酶之间的特异性泛素化关系。
此外，由于E3连接酶与其底物之间的相互作用是瞬时的，且泛素化靶蛋白会迅速降解，因此在体内鉴定E3连接酶底物通常面临多种挑战。使用一种仍能与靶标结合但不再对其泛素化的E3连接酶缺陷型突变体，是添加蛋白酶体抑制剂MG132之外的一种非常有用的替代方法；而MG132并不总能充分抑制26S蛋白酶体的功能13。
RING型E3连接酶的一个共同特征是倾向于形成并以同源和/或异源二聚体形式发挥作用。有趣的是，RING结构域中保守残基的替换通常与显性负性表型相关，即突变的RING型E3连接酶可阻断天然野生型蛋白的酶活性13。因此，在植物中过表达RING突变体可能是敲除E3连接酶基因的一种替代方法。

绝大多数E3泛素连接酶属于RING（Really 我有趣 New G型蛋白。RING指结构域最初由Freemont鉴定发现 等.1 并被功能上描述为介导蛋白质-蛋白质相互作用的结构域2典型的RING指结构是一种特殊的锌结合结构域，其共识序列为八个保守的半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基，由其他氨基酸残基（X）以特定间距排列组成，即C-X2- C-X9–39-C-X1–3- H-X2–3- C/H-X2- C-X4–48- C-X2- C. 两个 Zn2+ 离子通过核心C和H残基以独特的“交叉支架”拓扑结构与C稳定结合1/ C2 和 C/H5/ C6 协调第一个 Zn2+ 离子，而C3/4 和 C7/ C8 结合第二个（图1A)3,4根据第五个 Zn 位点中存在 C 或 H 而定2+-协调位点，RING指蛋白被划分为两个经典亚类：C3HC4 和 C3H2C3（分别为 RING-HC 和 RING-H2）。由于泛素连接酶E3的RING结构域介导了E2结合酶与底物之间的相互作用，这些关键的C和H残基的突变已被证明会破坏连接酶活性5此外，还描述了五种较为少见的RING E3连接酶亚类（RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T和RING-G）。6RING型E3泛素连接酶可进一步分为简单型和复合型E3酶。简单型单亚基RING E3连接酶同时含有底物识别位点和与E2结合的RING结构域。相比之下，多亚基RING型E3复合物则通过招募底物或介导E2-泛素中间体与E3复合物的结合来发挥作用。RING结构域中的赖氨酸残基作为自泛素化的主要泛素结合位点，可能对E3连接酶活性也具有重要作用。
并非所有含RING结构域的蛋白质都具有E3泛素连接酶功能。因此，对RING指结构域的生物信息学预测以及其介导E2依赖性蛋白质泛素化的潜能，必须通过生化实验加以验证，并与被测蛋白的生物学功能相关联。本文详细描述了一种逐步实验方案，用于在体外和植物体内通过定点突变方法检测并功能表征RING型E3泛素连接酶的酶活性。该实验流程的代表性结果以RING型E3泛素连接酶RHA1B为例进行展示。RHA1B是由植物寄生性胞囊线虫Globodera pallida产生的一种效应蛋白，可抑制植物免疫反应并调控植物根部细胞的形态。为抵御病原体或寄生生物的侵染，植物进化出了核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列（NB-LRR）类免疫受体，这类受体能够识别病原体或寄生生物的存在，并由此触发超敏反应（HR），即在侵染位点发生快速且局部的细胞死亡，以阻止病原体定植。其中一种免疫受体是马铃薯Gpa2蛋白，它能够赋予植物对某些G. pallida菌株（田间种群D383和D372）的抗性7。
利用本实验方案，近期研究发现RHA1B通过靶向植物免疫受体Gpa2进行泛素化和降解，以依赖E3的方式干扰植物免疫信号传导8。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>直链淀粉树脂</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>细菌蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>VWR</td><td>97061-690</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>贝克曼库尔特</td><td>型号：Avanti J-25</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝</td><td>VWR</td><td>97061-738</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>肌酸磷酸激酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化 &amp;amp; 浓缩试剂盒</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>D4029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;DpnI&lt;/em&gt;</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324504</td><td></td></tr><tr><td>FeSO₄·7H₂O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7002</td><td></td></tr><tr><td>FLAG-Ub</td><td>BostonBiochem</td><td>U-120</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>VWR</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HA-Ub</td><td>BostonBiochem</td><td>U-110</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>VWR</td><td>模型：10153-318</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>VWR</td><td>型号：1525 数字培养箱</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>型号：MaxQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>罗氏</td><td>10724815001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>大学化学试剂库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麦芽糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63418</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄·7H₂O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>模型：5424</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提纯化试剂盒</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>D4015</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗FLAG抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗HA抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗MYC抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004609M2</td><td></td></tr><tr><td>研钵</td><td>VWR</td><td>89038-144</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>型号：2000 分光光度计</td><td></td></tr><tr><td>针</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-826-5C</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Bio-Rad</td><td>型号：C1000</td><td></td></tr><tr><td>研钵杵</td><td>VWR</td><td>89038-160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pfu Ultra&lt;/em&gt;</td><td>安捷伦科技</td><td>600380</td><td></td></tr><tr><td>植物蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>pMAL-c2</td><td>NEB</td><td>N8076S</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯聚吡咯烷酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Qsonica 超声波破碎仪</td><td>模型：Q125</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>T4连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

体外及植物体内ring型e3泛素连接酶的功能表征

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

泛素化作为一种蛋白质的翻译后修饰，在真核细胞的稳态调控中发挥着重要作用。76个氨基酸组成的泛素分子共价连接到靶蛋白上，根据多聚泛素链的长度和拓扑结构不同，可导致多种结果，从蛋白质降解到修饰蛋白的定位和/或活性改变。泛素化过程由三种酶依次催化完成：E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。其中E3泛素连接酶决定底物特异性，因此是一个极具研究价值的对象。本文介绍了一种系统性的方法，用于研究RING型E3泛素连接酶的酶活性与其生物学功能之间的关系。该四步实验方案包括：1）通过定点突变技术靶向保守的RING结构域，构建E3连接酶缺陷型突变体；2–3）在体外和植物体内检测其泛素化活性；4）将上述生化分析结果与被测蛋白的生物学意义相关联。构建一个仍能与底物相互作用但丧失泛素化功能的E3连接酶缺陷型突变体，有助于在活体条件下验证酶与底物之间的相互作用。此外，保守RING结构域中的突变通常会产生显性负性表型，可在功能缺失研究中作为RNA干扰方法的替代策略加以利用。本研究方法最初针对植物寄生线虫效应因子RHA1B的生物学功能进行优化，该因子可劫持植物细胞中的宿主泛素化系统以促进寄生。通过略微修改体内表达系统，本方案可适用于分析任何来源的RING型E3泛素连接酶。

本部分提供了用于检测单个亚基E3泛素连接酶RHA1B的实验方案的代表性结果，该蛋白具有PROSITE预测的RING-H2型结构域（第132–176位氨基酸）10。如图1所示，为了获得缺乏E3活性的突变蛋白，需要对RING结构域中8个保守的半胱氨酸（C）或组氨酸（H）残基中的至少一个进行诱变（图1A）（图1B）。因此，作为第一步，构建了RHA1B的两种突变体：RHA1BC135S（RING结构域保守C3位点的半胱氨酸被丝氨酸取代）和RHA1BK146R（RHA1B中唯一的赖氨酸被精氨酸取代）。尽管单亚基E3连接酶介导泛素从携带泛素的E2酶转移至底物蛋白，而非直接与泛素相互作用，但E3蛋白自身在赖氨酸位点的自泛素化可能对其最大酶活性是必需的。
图 2A 中的蛋白质印迹结果展示了一个典型的体外泛素化反应阳性结果，表现为从目标蛋白的分子量（例如，MBP融合的RHA1B，约100 kDa）开始并向上延伸的多条带弥散信号。抗HA抗体识别了被整合到不同长度多聚泛素链中的HA标签泛素，从而形成这种典型的与泛素相关的梯状弥散条带。为验证阳性结果，图 2A 还展示了所有关键的阴性对照，这些对照分别缺失单个组分（E1、E2、Ub 或 MBP-RHA1B），或以MBP作为对照，均未出现弥散的泛素化信号。此外，PVDF膜的考马斯亮蓝染色显示，在所有对照中，MBP-RHA1B 或 MBP 的上样量均一致。
图2B 显示体外泛素化结果因特定的E2/E3组合而异。在此示例中，测试了代表10个不同E2家族的11种不同E2酶。检测到的泛素化活性范围从无信号（无弥散条带）到在不同分子量处起始的多条带弥散，表明存在不同的泛素化模式。
图3展示了受试蛋白的RING突变体和K突变体的泛素化实验结果。RHA1BC135S缺乏酶活性，这体现在其无法在体外产生多条带弥散信号（图3A），也无法在植物体内促进多聚泛素化信号（图3B）。值得注意的是，在植物体内过表达HA标签的Ub本身在所有受试样本（包括载体对照）中均引起基础水平的泛素化，这与野生型RHA1B酶活性所介导的强泛素化信号形成对比。此外，对RHA1BK146R突变体的分析表明，K146残基对RHA1B的E3活性同样至关重要。尽管在体外检测到微弱的自泛素化信号（图3A），但植物体内的实验确定该突变体缺乏E3活性（图3B，仅检测到背景水平的泛素化信号）。
在构建并进行生化验证E3缺陷型突变体后，可设计功能研究以确定被测试的RING型E3泛素连接酶所介导的生物学功能。以RHA1B为例，该线虫效应子可抑制植物免疫信号通路，表现为抑制Gpa2诱导的超敏反应（HR）性细胞死亡。如图4A所示，与野生型RHA1B不同，缺乏E3连接酶活性的RHA1BC135S突变体不能抑制HR细胞死亡。鉴于蛋白质泛素化最常见的结果是通过蛋白酶体介导其降解，位于RING结构域的突变也可用于验证E3依赖性降解其直接和/或间接底物的能力。因此，图4B中的蛋白质印迹（Western blotting）结果显著表明，在野生型RHA1B存在时Gpa2蛋白未发生积累，而RHA1BC135S突变体对Gpa2蛋白的稳定性无影响。
<img alt="定点突变示意图；包含引物设计、PCR、甲基化、质粒纯化、大肠杆菌转化等步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：定点突变原理及操作步骤的示意图。（A）RING-CH/H2 结构域，其中保守的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）氨基酸残基已标出。（B）诱变引物设计示例。（C）定点突变的操作步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质泛素化实验；Western印迹与考马斯亮蓝染色；MBP-RHA1B检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：典型的体外泛素化实验结果。（A）上层凝胶显示包含所有阴性对照的泛素化实验结果，下层凝胶显示上样量均一。（B）根据E2酶的不同，预期结果的范围变化。本图经Kud等8修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示MBP-RHA1B泛素化的Western印迹分析；蛋白质相互作用实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：RING突变体和K突变体（RHA1BC135S 和 RHA1BK146R）的泛素化实验结果。 （A）RHA1BC135S 和 RHA1BK146R 的体外泛素化结果。（B）RHA1BC135S 和 RHA1BK146R 在植物体内的泛素化实验结果。该图改编自 Kud 等人8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="植物抗病性测定（A）和蛋白质表达的蛋白质印迹分析（B）；分子生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60533/60533fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：E3依赖性生物学功能的代表性功能研究。 展示E3依赖性生物学功能的一个功能研究示例。（A）E3依赖的HR细胞死亡抑制；（B）植物免疫受体Gpa2的降解。本图经Kud等8修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60533/60533fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">PCR 反应体系配置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 µL</td>
			<td>质粒 (~100 ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 µL</td>
			<td>F 突变引物 (10 µM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 µL</td>
			<td>R 突变引物 (10 µM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 µL</td>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 µL</td>
			<td>缓冲液 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 µL</td>
			<td>Ultra Pfu 聚合酶 (2.5 U/µl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>39 µL</td>
			<td>ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 µL</td>
			<td>总体积</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：PCR反应体系的建立
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">PCR扩增程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>95 ˚C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>95 ˚C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>60 ˚C</td>
			<td>30 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>72 ˚C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>重复步骤2-4共30次</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>72 ˚C</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：PCR扩增仪程序
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">RHA1B 示例的连接反应体系设置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 µL</td>
			<td colspan="2">经 BamHI 和 SalI 消化线性化的 pMAL-c2::MBP 载体 (60 ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 µL</td>
			<td colspan="2">经 BamHI 和 SalI 消化的 RHA1B/RHA1BC135S 或 RHA1BK146R 插入片段 (25 ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 µL</td>
			<td colspan="2">T4 连接酶缓冲液 (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 µL</td>
			<td colspan="2">T4 连接酶 (400 U/µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µL</td>
			<td colspan="2">总体积</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：RHA1B示例的连接反应体系设置。

本文旨在为RING型E3泛素连接酶的全面生化与功能研究提供一个框架。这一多步骤流程包含详细的实验方案，可用于验证待测蛋白的酶活性，并阐明如何将酶活性与生物学功能相联系。

体外及植物体内RING型E3泛素连接酶的功能表征

泛素化作为一种蛋白质翻译后修饰，在真核细胞稳态的调控中发挥着重要的作用。这种共价……

本逐步实验方案介绍了如何通过定点突变方法，在体外和植物体内检测并功能表征RING型E3泛素连接酶的酶活性。通过定点突变技术对RING结构域引入突变，可获得缺乏E3活性的突变体，并将其与野生型蛋白平行进行测试，从而将酶活性与生物学功能相关联。阐明RING型E3泛素连接酶的生化与作用机制基础，将极大促进我们对其在发育、应激信号传导以及稳态维持中生物学意义的理解。通过对体内表达系统进行轻微修改，本方案可适用于分析任何来源的RING型E3连接酶。首先确定RING结构域中保守的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）氨基酸，然后设计引物，使其携带目标取代密码子，并在突变位点两侧各包含15个碱基对。准确识别RING结构域，特别是其保守的半胱氨酸和组氨酸残基，至关重要。可以使用 PROSITE 等在线工具完成该操作。利用诱变引物通过 PCR 扩增将目标突变引入含有目的基因的质粒中，并确保使用高保真 DNA 聚合酶（如 Pfu）。PCR 完成后，向 PCR 反应体系中直接加入三微升 Dpnl 限制性内切酶，于 37 摄氏度孵育两小时，以消化来源于大肠杆菌的甲基化和半甲基化亲本 DNA。使用商业质粒DNA提取试剂盒纯化突变质粒，并用50微升水洗脱DNA。随后，取0.5微升回收的突变质粒DNA，按照生产商说明书转化至DH5-alpha大肠杆菌感受态细胞中。将目标野生型RING基因和突变型RING基因克隆至pMAL-c2载体中，以实现这些基因与MBP表位标签的融合。然后，按照论文所述，在总体积为 30 微升的体系中建立体外泛素化反应，并在 30 摄氏度下孵育混合物 2 小时。通过向样品中加入 7.5 微升 5x SDS-PAGE 上样缓冲液并煮沸 5 分钟以终止反应，随后使用 7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。将蛋白转移至 PVDF 膜，并通过 Western 印迹法结合抗 FLAG 抗体检测泛素化。使用考马斯亮蓝染色膜以验证所检测的MBP-RING型蛋白上样量均等。将携带目的表位标签基因的根癌农杆菌菌株在含有适当选择性抗生素的LB培养基上划线培养。在28摄氏度下培养两天后，挑取单菌落，并在含有抗生素的LB液体培养基中于28摄氏度、250 rpm条件下继续培养24小时。将100微升农杆菌培养物转移至含抗生素的3毫升新鲜LB培养基中，继续培养4至6小时。在1,800 × g条件下离心6分钟，沉淀菌体，弃上清液，并用3毫升洗涤缓冲液重悬菌体。重复洗涤两次后，将菌体重悬于诱导缓冲液中，在28摄氏度下继续孵育10至12小时。孵育后，在1,800 × g 条件下离心6分钟，弃去上清液。用2 mL浸润缓冲液重悬细胞，并通过OD600值测定细菌浓度。用针头轻轻刺破4周龄的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片，使用注射器手工注入农杆菌（Agrobacterium），然后用记号笔标记浸润区域的范围。36小时后，收集浸润的叶片组织，用液氮研磨成细粉。加入300微升蛋白提取缓冲液重悬组织粉末，在4摄氏度下以15,000 × g离心15分钟。将上清液转移至新离心管中，加入5× SDS-PAGE上样缓冲液至终浓度为1×，并将样品煮沸5分钟。然后，进行蛋白质免疫印迹分析以检测植物体内泛素化。划线接种携带目标基因标签或空载体的适当农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株，并按照先前所述方法将农杆菌注射到本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中。对于E3依赖性底物蛋白降解实验，遵循先前描述的方案，并使用适当的抗体进行蛋白质免疫印迹，以检测蛋白在植物细胞中的积累情况。对于依赖E3的超敏反应介导的细胞死亡抑制，应在农杆菌渗入后2至4天内观察渗入叶片的细胞死亡症状。典型的体外泛素化实验结果表现为从被检测蛋白的分子量开始并向更高分子量延伸的多条带弥散信号。与预期一致，缺失单个组分或使用MBP的阴性对照未出现弥散信号。此外，PVDF膜的考马斯亮蓝染色显示，所有对照组中MBP-RHA1B或MBP的上样量均相等。为研究体外泛素化如何因特定E2与E3的组合而异，共测试了11种不同的E2酶。检测到的泛素化活性从无信号到在不同分子量处起始的多条带弥散条纹不等，表明存在不同的泛素化模式。在体外和植物体内测试了RHA1B的RING突变体和K突变体的泛素化能力。RING突变体缺乏酶活性，这由其在体外无法产生多条带弥散信号以及在植物体内不能促进多聚泛素化信号所证实。尽管在体外检测到K突变体存在微弱的自泛素化信号，但在植物体内仅检测到背景水平的泛素化，表明K146残基对E3活性同样至关重要。与野生型RHA1B不同，缺乏E3连接酶活性的RING突变体不会干扰超敏反应性细胞死亡。Western印迹结果证实，在野生型RHA1B存在的情况下，Gpa2蛋白未发生累积，而RING突变体对蛋白稳定性无影响。鉴于适当的E2-E3组合是泛素化反应所必需的，应同时使用代表不同E2类别的多种E2酶进行体外泛素化实验，以避免出现假阴性结果。一种E3连接酶缺陷型突变体有助于在体内检测酶与底物之间的相互作用。此外，该突变体通常表现出显性负性表型，可在功能敲除研究中作为RNA干扰的替代策略加以利用。通过本实验方案，近期研究发现线虫效应子RHA1B以E3依赖的方式干扰植物免疫信号通路，其机制是靶向植物免疫受体Gpa2并介导其泛素化与降解。

functional-characterization-ring-type-e3-ubiquitin-ligases-vitro

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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