体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

中性粒细胞及其他免疫细胞释放胞外诱捕网在先天免疫中具有重要作用，但也与炎症性疾病密切相关。尽管巨噬细胞在炎症反应中发挥关键作用，但关于其释放胞外诱捕网的过程目前知之甚少。本方案提供了一种原代人源体外模型，用于研究巨噬细胞胞外诱捕网或肥大释放现象。

该模型为我们研究此结构在体内的潜在生理生长提供了依据。该技术的主要优势在于，本方案所用细胞为直接从人血沉棕黄层制备物中分离的原代细胞。该方法无需对单核细胞进行诱导分化即可获得巨噬细胞，这一点与其他单核细胞系（如 THP-1 细胞系）不同。

该方案可轻松适用于其他免疫细胞，包括分离的中性粒细胞和小胶质细胞。巨噬细胞产生的细胞外陷阱非常脆弱，因此在各步骤之间必须小心操作，以保持染色后陷阱结构的完整性。在无菌条件下，通过向完全RPMI-1640培养基中添加干扰素γ至终浓度为20纳克/毫升，并添加脂多糖至终浓度为1微克/毫升，制备M1预刺激培养基。

通过将白细胞介素4加入完全RPMI-1640培养基中，配制浓度为20纳克/毫升的M2诱导培养基。在无菌条件下，吸除接种并培养的含有HMDM的组织培养板孔中的培养基。小心向每孔加入1毫升预热至37摄氏度的无菌PBS。

移除 PBS 缓冲液，并额外洗涤两次。向每孔含有 HMDM 的细胞中加入 1 毫升 M1 或 M2 初始培养基。将细胞置于细胞培养箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 48 小时。

在无菌条件下，配制含有不同 MET 释放刺激物的完全 RPMI-1640 培养基。进行次氯酸刺激实验时，用已预热至 37 摄氏度的 HBSS 在 Falcon 管中配制 200 微摩尔的次氯酸。完成极化处理后，吸去每孔中的细胞培养液，并分别用无菌 PBS（用于 PMA、TNF-α 和白细胞介素 8 刺激）或 HBSS（用于次氯酸刺激）以 1 毫升等分体积小心洗涤细胞三次。

在最后一步洗涤中去除 PBS 后，加入 1 毫升含有 PMA、TNF alpha 或白细胞介素 8 的完全培养基。将细胞置于细胞培养箱中，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育，TNF alpha 刺激孵育 6 小时，PMA 或白细胞介素 8 刺激孵育 24 小时。对于次氯酸实验，在最后一步洗涤中去除 HBSS 后，加入 1 毫升新鲜配制的次氯酸。

然后将细胞置于细胞培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15分钟。随后，小心吸除细胞的上清液，并用1毫升等分的HBSS溶液洗涤细胞三次。最后一次洗涤步骤完成后，移除HBSS溶液，加入1毫升完全RPMI-1640培养基。

然后将细胞置于细胞培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。用HBSS配制浓度为40微摩尔的SYTOX Green染料。向每孔含HMDM的培养孔中直接加入25微升该染料。

将细胞置于避光条件下室温孵育5分钟。随后将HMDM置于倒置荧光显微镜的显微镜载物台上的组织培养孔中进行成像。开启宽谱荧光光源、明场光源以及配备高分辨率彩色数字相机的倒置显微镜。

将滤光轮旋转至编号2的位置，以进行激发波长为504纳米、发射波长为523纳米的绿色荧光观察。使用5倍物镜，先通过显微镜的粗调焦旋钮，再用微调焦旋钮调焦，直至图像清晰、锐利。随后将显微镜切换至相机模式。

启动相关软件。点击播放按钮预览图像，并调节显微镜上的微调焦旋钮，直至软件预览窗口中的图像清晰、明锐且聚焦准确。然后点击捕获按钮。

在软件中，点击文件，另存为所需的图像文件类型。在显微镜上，将滤光片轮旋转至编号五的位置以进行明场成像，并重复图像采集步骤以获得相应的明场图像。

此处展示的是明场图像，显示了人源单核细胞来源巨噬细胞（HMDM）在受到刺激后发生的形态学变化。在实验中，经干扰素γ和脂多糖处理后极化为M1型的巨噬细胞呈现出细长、纺锤形的细胞形态。作为对比，经白细胞介素4处理48小时后极化为M2型的巨噬细胞通常呈圆形且扁平。

通过SYTOX Green活细胞荧光成像，观察到不同分化表型的人源单核细胞衍生巨噬细胞（HMDM）释放MET的能力。各HMDM表型在无任何促炎刺激条件下孵育24小时的对照组显示极少的绿色染色。M1型HMDM经次氯酸、PMA、白细胞介素8或TNFα刺激后，可观察到呈绿色条纹状的MET阳性染色。

细胞中可见的某些绿色染色表明细胞膜完整性丧失，这可能是由与细胞外诱捕释放无关的细胞死亡所导致的。将M2型HMDM细胞暴露于白细胞介素4的实验显示，细胞未释放DNA，表现为不存在细胞外DNA的丝状或条纹状结构。然而，在次氯酸和TNFα处理下，观察到细胞对绿色荧光染料存在一定程度的摄取。

成像前应避免直接强光照射，以免过度曝光染色样本。可通过qPCR分析细胞上清液中存在的核DNA和线粒体DNA来定量细胞外DNA。利用人源巨噬细胞（HMDM）对肥大细胞结构及其在慢性炎症中作用的进一步表征，相较于其他永生化细胞系来源的巨噬细胞，可能具有更高的临床相关性。