Name: 研究活体器官的肠道屏障分解 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解如何使用小鼠小肠类器官模型定量检测肠道屏障完整性。该方法利用荧光素黄渗透实验评估紧密连接蛋白功能，为研究屏障破坏诱导因素和保护策略提供可靠工具，减少动物实验需求。

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本研究得到了德国研究基金会（DFG）[KFO257，项目4（M.S.）和项目1（C.B.）；FOR2438，项目2（M.S. 和 E.N.）和项目5（C.B.）；SFB1181，项目C05（C.B.）；TRR241，项目A06（N.B.L. 和 M.S.），项目A03（C.B.），BR5196/2-1（N.B.L.）和BE3686/2（C.B.）]、埃尔兰根临床中心跨学科临床研究中⼼（IZKF）（M.S.、E.N. 和 M.B.）、W. Lutz 基金会（M.S.）以及埃尔兰根临床中心医学研究基金会（M.S.）的资助。本工作部分用于满足 Marco Bardenbacher 获得医学博士（Dr. Med.）学位的部分要求。

所有步骤均按照并遵守所有相关的监管机构和机构动物护理指南完成。
1. 类器官铺板
<ol>
	<li>按照先前所述方法分离类器官3。以下为简要步骤说明。
	<ol>
		<li>从小鼠中取出小肠。</li>
		<li>沿纵向切开小肠，并用盖玻片刮除肠腔内表面的绒毛尖端。</li>
		<li>使用剪刀将肠组织剪成小块。</li>
		<li>用移液器在冷磷酸盐缓冲液（PBS）中上下吹打10次，重复洗涤5次。</li>
		<li>将组织块置于冰上，在2 mM EDTA溶液中4 °C孵育30分钟，并置于水平摇床上震荡。静置使组织块自然沉降。</li>
		<li>待组织块沉降至管底后，弃去EDTA溶液，加入20 mL PBS缓冲液，弃去上清液。</li>
		<li>使用10 mL移液器剧烈吹打10次，以释放肠隐窝。</li>
		<li>将上清液收集至离心管中，并通过相差显微镜进行观察：取一滴上清液滴加至96孔细胞培养板中。离心管保持在冰上。</li>
		<li>重复步骤1.1.6–1.1.8，直至收集的上清液中肠隐窝数量明显减少。</li>
		<li>将含有最多隐窝的组分通过70 µm细胞筛网过滤。</li>
		<li>将隐窝悬液在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用冷PBS重悬沉淀以洗涤隐窝，然后按照步骤1.1.11重复离心操作。</li>
		<li>将沉淀重悬于每孔25 µL的细胞基质溶液与小鼠类器官培养基1:1混合液中，并将类器官接种至48孔细胞培养板中。</li>
		<li>将类器官置于37 °C、5% CO2,条件下孵育20分钟，使细胞基质溶液凝固。</li>
		<li>每孔加入300 µL小鼠类器官培养基覆盖类器官。</li>
		<li>将类器官置于37 °C、5% CO2条件下培养，每2–3天更换一次培养基。</li>
		<li>培养7天后用于实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备类器官用于屏障完整性检测。
	<ol>
		<li>在接种过程中，将所有用于储存类器官的离心管预先用牛血清白蛋白（BSA）包被：加入足量含0.1% BSA的PBS溶液，确保覆盖所有塑料表面，随后吸除BSA溶液，并将离心管置于冰上保存。</li>
		<li>将细胞基质溶液和类器官培养基置于冰上解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为分离类器官，小心吸除培养基，并将一个48孔板中单孔的类器官用1 mL冷PBS重悬。通过剧烈吹打使细胞基质溶解。类器官悬液始终保存于预先用BSA包被的离心管中，并始终保持在冰上。 
	注意：类器官在腔室盖玻片内的密度、大小和位置受传代比例、细胞基质溶液浓度以及类器官-细胞基质悬液操作方式的影响。建议提前练习细胞基质溶液的操作。通常八孔腔室盖玻片适用于本实验。一个汇合的48孔板单孔来源的类器官可分至两个八孔腔室盖玻片孔中（每孔接种40 μL类器官-细胞基质沉淀）。</li>
	<li>将类器官悬液在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，并用1 mL冷PBS重悬沉淀。</li>
	<li>将类器官悬液在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
	<li>完全弃去上清液，将来自一个48孔板单孔的类器官用40 µL冷培养基重悬。通过10 µL移液器枪头反复吹打5次，使较大的类器官结构破碎，以获得大小为40–60 µm的片段用于接种。 
	注意：使用100 µL移液器装配10 µL枪头进行类器官结构的破碎操作，建议提前练习步骤1.7以确保结果一致。在离心管中通过相差显微镜监测类器官大小，确保无多分支结构存在，且类器官片段长度约为40–60 µm。</li>
	<li>当类器官达到理想大小后，将其与40 µL细胞基质溶液混合（培养基:细胞基质溶液 = 1:1）。 
	注意：必须保持培养基与细胞基质溶液的比例恒定，以获得一致的实验结果。细胞基质溶液的稀释会降低类器官团块的刚性，并影响其扩散特性。所有含细胞基质溶液的悬液均应使用预冷的移液枪头（-20 °C）。</li>
	<li>将40 µL类器官-细胞基质溶液悬液置于八孔腔室盖玻片每孔的中央位置。</li>
	<li>将玻片置于冰袋上5分钟。此操作可维持细胞基质-类器官悬液的液态，并通过重力作用增加类器官在盖玻片表面的浓度。</li>
	<li>置于37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟，使类器官-细胞基质团块完成聚合。</li>
	<li>每孔加入150 µL类器官培养基，并在继续实验处理前于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
	<ol>
		<li>利用此阶段对类器官进行处理，根据相应的科学假设调节其屏障完整性。作为阳性对照，使用IFN-γ处理类器官48小时，以研究IFN-γ相关的紧密连接降解及通透性增加。以10 U/mL（10 ng/mL）重组小鼠IFN-γ刺激阳性对照组。保留一个孔的类器官不做处理作为阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将类器官在37 °C、5% CO2条件下继续培养最多48小时。</li>
</ol>
2. 类器官通透性检测
<ol>
	<li>在开始实验前至少2小时，将显微镜的培养室预热至37 °C，以减少类器官成像过程中的热漂移。</li>
	<li>在PBS中配制100 mM的LY溶液。置于冰上并避光保存。</li>
	<li>在PBS中配制200 mM的EGTA溶液。置于冰上保存。</li>
	<li>将带有类器官的腔室载玻片转移至倒置共聚焦显微镜的培养室中，并开启CO2培养环境（5%）。确保腔室载玻片牢固锁定在显微镜载物台上。</li>
	<li>以一个孔中的类器官作为参考，调整显微镜的成像参数。加入LY（将3 µL的100 mM LY加入150 µL培养基中），使最终体积为300 µL培养基中含有1 mM LY。在显微镜下孵育1小时，并调整焦距以对类器官腔隙进行成像。设定LY激发（488 nm）所需的激光能量及仪器相应的检测灵敏度，尝试将LY荧光信号控制在所用仪器动态范围的30–40%之间。 
	注意：在加入LY后70分钟，对未经处理的类器官调整激光激发能量和检测效率。确保激发能量足够高，以获得曝光良好的图像。为避免显微图像中LY荧光信号饱和，建议在LY扩散达到稳态后再调整这些参数。</li>
	<li>通过微分干涉差（DIC）活体成像确定类器官的位置。尽量选择直径相近的类器官（80 ± 30 μm），并对准类器官中央切片以成像其腔隙。每孔大致选定10个类器官，且仅对靠近载玻片表面、呈球形结构的类器官进行成像。 
	注意：每次运行可成像的类器官数量取决于显微镜的速度。建议在5分钟内完成成像。在常规激光扫描显微镜上，总共40个位置是一个合理的起点。</li>
	<li>在向孔中加入LY前，记录每个位置的DIC图像和LY荧光图像，用于记录类器官的形态和自发荧光，作为屏障完整性检测的基线数据。</li>
	<li>避免对具有高自发荧光的类器官进行成像。这通常是由于类器官腔内积累了死亡细胞所致，此类样本后续难以准确分析。</li>
	<li>将3 µL已配制的LY溶液（100 mM LY）稀释后，小心加入每个孔中，避免触碰腔室载玻片。每孔推荐的LY终浓度为1 mM，每孔终体积应为300 µL。</li>
	<li>快速检查已定义位置的焦距，并在必要时进行校正。 
	注意：LY可迅速穿过细胞基质，因此必须在加入荧光染料后3分钟内启动共聚焦成像。</li>
	<li>在显微镜上启动延时成像。每5分钟对每个位置采集一次荧光图像，共持续70分钟。 
	注意：类器官以5分钟间隔成像，以可视化LY随时间的摄取过程。为测量肠道屏障的破坏情况，只需在加入LY前、加入LY后60分钟以及加入EGTA后10分钟各记录一次荧光图像即可。</li>
	<li>每孔加入3 µL已配制的EGTA溶液，避免触碰腔室载玻片。腔室载玻片内EGTA的推荐终浓度为2 mM，每孔总体积应为300 µL。</li>
	<li>启动第二次延时成像。以5分钟为间隔，再次记录已定义类器官的荧光图像，共持续30分钟。</li>
	<li>根据当地安全规定妥善处理所有废弃物。 
	注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>仅分析在添加EGTA后摄取LY的类器官结果。</li>
	<li>可使用Fiji ImageJ对结果进行定量分析。</li>
	<li>通过点击 文件 |打开 并选择图像数据，在ImageJ中打开数据集。在随后出现的BIO-Formats导入选项对话框中，选择 使用超堆栈查看堆栈。</li>
	<li>通过点击 分析 | 工具 | ROI管理器，打开感兴趣区域（ROI）管理器。</li>
	<li>在ImageJ菜单栏中点击 椭圆选区 按钮，绘制一个椭圆形ROI。绘制一个包含类器官内腔的选区，然后在ROI管理器中点击 添加。</li>
	<li>对类器官外部三个具有代表性的区域重复上述步骤。</li>
	<li>点击菜单栏中的 分析，选择 设置测量。仅启用 平均灰度值，禁用其他所有测量选项，然后点击 确定。</li>
	<li>确保ROI管理器中所有ROI均被选中。在ROI管理器中点击 更多 | 多测量。在选项对话框中选择 测量所有[…]切片 和 每切片一行，然后点击 确定。</li>
	<li>选中 结果 窗口中的所有数值，并将其复制到电子表格应用程序中进行进一步分析。 
	注意：如果在延时成像过程中类器官的位置发生移动，则必须相应地调整ROI。为此，请在ROI管理器中选择正确的ROI，并将其移动至新位置，然后点击ROI管理器中的 更新。通过在ROI管理器中点击 测量，对每个时间点单独进行测量，然后使用图像窗口底部的滑块切换至下一个时间点。将所有测量值收集到电子表格中。由于成像期间类器官的个体形态和运动差异，数据需以手动方式进行分析。</li>
	<li>计算每个时间点类器官外部三个ROI的平均强度值。</li>
	<li>将类器官腔内ROI的强度除以腔外ROI的平均强度和类器官内部的平均强度。</li>
	<li>为计算类器官腔内荧光的相对增加量，将每个成像时间点的相对荧光强度（见步骤3.11）除以最小的相对荧光强度。 
	注意：使用最小相对荧光强度，因为有时荧光探针在实验初期的扩散速度较慢。</li>
</ol>

<ol><li>López-Posadas, R., Stürzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+GTPases+and+Cytoskeleton+in+Cellular+Barrier+Defects+during+Gut+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1240(2017).</li>
<li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+and+toxin+production+by+Clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).</li>
<li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport%2C+sensing+and+incretin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 16831(2015).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Measurement+of+Epithelial+Barrier+Permeability+in+Human+Intestinal+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).</li>
<li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383(2019).</li>
<li>Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+transport+was+observed+not+in+hydrophilic+compounds+but+in+dextran+in+Caco-2+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验提供了一种在活体类器官中研究肠道屏障完整性的技术。整个实验基于小鼠小肠类器官和共聚焦活细胞显微镜技术。因此，必须提前熟练掌握类器官的规范操作方法。分离后，类器官可常规进行传代，并通过冷冻保存长期储存3,9。对于本实验，我们建议在开始处理前48小时对类器官进行传代。这一时间段可使类器官充分闭合并形成球形结构。实验中类器官的接种是本实验的关键步骤。为减少个体操作差异，我们推荐采用标准化的操作流程进行接种。该步骤至关重要，规范化的操作流程可显著降低实验变异。
在接种过程中（步骤 1.7），类器官通过反复使用标准的 10 μL 移液器吸头进行传代而被破碎。不同公司的此类产品孔径大小可能存在差异。该操作应提前进行练习，并始终通过相差显微镜检查结果。一旦获得的类器官达到理想大小，即不应再改变操作流程。
类器官的接种必须根据现有的显微镜设备进行优化和调整。为了能够对类器官进行至少48小时的培养和成像，必须使用带培养功能的显微镜腔室。请选择符合您实验需求的带腔室盖玻片。接种类器官时，应确保将类器官集中在盖玻片表面。在加入细胞基质-类器官悬液后，将带腔室盖玻片置于冰袋上保持5分钟，即可实现这一目的。此步骤对于提高共聚焦活细胞成像的质量至关重要。共聚焦显微镜物镜的轴向分辨率和工作距离尤其有限，将样品尽可能靠近物镜放置，不仅可获得更清晰的图像，还能减少激发LY荧光所需的激光能量。
活细胞显微成像中，趋光性是一个重要问题。本实验方法排除了这一影响因素。功能性黏附连接复合体（AJC）的存在可通过荧光黄（LY）被排除在类器官腔外而观察到（图1，PBS组）。实验结束时加入EGTA可螯合二价离子，而二价离子是AJC蛋白发挥功能所需的辅因子。只有在具有功能性AJC复合体的活类器官中，LY才会被排除在类器官腔外。通常情况下，可使用荧光分子来评估肠道屏障的完整性。我们选择LY而非其他常用荧光染料（如荧光素标记的葡聚糖），因为后者可在肠上皮细胞中通过跨细胞途径从基底侧转运至顶侧腔室9。此外，我们选择LY还因其分子尺寸较小。LY的分子量为457 Da，因此适用于研究小分子物质的屏障通透性。荧光分子的选择应根据具体科学问题而定。由于存在光毒性导致的AJC结构损伤，需降低激光激发能量或延长成像时间间隔。本实验最适宜采用共聚焦成像技术中的转盘显微镜，此类仪器可在低激光功率下实现短曝光时间的共聚焦成像。
目前已开发出多种模型用于体外研究肠道屏障的完整性。尽管基于细胞系单层或体内实验的检测方法正在减少，基于类器官的方法却日益增多。与先前描述的方法4,5,6,7相比，我们的方法能够随时间定量评估屏障功能，从而允许在实验过程中对类器官施加额外的刺激。在此，我们在实验结束时应用EGTA作为第二种刺激，以作为阳性对照。
与体内情况相反, 在我们的实验中，荧光素（LY）被加入培养基中，并从类器官外侧的基底侧上皮向内侧的顶膜腔渗透。LY分子较小，仅用于可视化肠道屏障的紧密程度。需要在顶膜表面调节上皮层的分子和刺激物，必须直接注射到类器官的腔内。7为了减少实验工作量并能够同时测量多个类器官的屏障完整性，我们选择从外部施加荧光染料。
我们利用该检测方法研究了干扰素-γ（IFN-γ）对小鼠小肠类器官紧密连接功能的影响。能够在活体类器官中分析屏障完整性的事实，为将来应用此技术描述炎症诱导的肠道屏障破坏的抑制剂提供了可能。那些能够拮抗IFN-γ引起的屏障功能损伤的物质，可能成为治疗炎症性肠病的候选药物，因为在这些疾病中，屏障功能受损是重要的致病因素之一10。

上皮屏障的完整性由顶端连接复合体（apical junctional complex, AJC）维持，该复合体由紧密连接（tight junction, TJ）和黏附连接（adherence junction, AJ）蛋白组成1。AJC 的极化结构对其在体内的功能至关重要。AJC 的失调存在于多种疾病中，并被认为是炎症性肠病发病机制的重要触发因素。肠道屏障功能的丧失是该疾病发生的起始事件，随后发生的共生菌易位及炎症反应则带来痛苦的后果2。
已开发出多种体外和体内模型，用于研究黏附连接复合体（AJC）的调控机制. Transwell 实验基于来源于肿瘤细胞系的二维（2D）细胞单层。这类系统便于通过光学和生物化学方法进行检测，并可同时分析多个样本，但缺乏原代细胞的多种特征以及体内存在的分化过程。. 在动物模型中也可研究屏障完整性。在终末实验中，可对特定处理在体内对整个肠道通透性的影响进行定量分析。然而，这些模型需要使用大量动物，且无法对潜在的分子过程进行细致的可视化观察。如今已有改进的三维体外模型，能够高度模拟细胞分化过程、细胞极化，并再现肠道隐窝-绒毛结构。3将3D肠道类器官应用于功能分析需要对现有2D模型方法进行适应性调整。本文描述了一种用于研究活体小鼠小肠类器官肠道屏障完整性的模型。该检测方法旨在研究IFN-γ对屏障完整性及其相关紧密连接蛋白的影响。8.
与Leslie4、Zietek5或Pearce6所采用的技术（在从培养基中去除荧光黄（LY）后测量荧光）不同，我们的方法能够随时间定量检测荧光染料在管腔内的摄取。因此，该结果反映了动态摄取动力学，且我们的检测方法允许在实验过程中施加额外的刺激或添加抑制剂。两种方法均测量荧光染料从外侧基底膜侧向内侧顶膜表面的摄取，这与体内实际情况明显不同。Hill等人7描述的一个模型探讨了这一问题。通过将荧光染料显微注射到类器官的管腔内，随后定量检测荧光强度。这种扩散方向更接近体内真实的物质转运方向。然而，显微注射的技术难度显著限制了该方法的通量。与本文所述模型相比，显微注射法能够检测那些需要在上皮顶膜表面进行生物学活化的效应。
本文介绍的类器官屏障完整性模型基于活细胞显微镜技术，能够随时间分析黏附连接复合体（AJC）调控过程中的动态变化。该实验体系可用于检测药物或其他物质对肠道屏障完整性增强或抑制作用的药理学影响。此外，基于类器官的模型有助于减少药理学研究中动物的使用数量。

<table><tbody><tr><td>48孔培养板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#150687</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室载玻片</td><td>Ibidi</td><td>#80826</td><td></td></tr><tr><td>96孔培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#655101</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 - 转盘式共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>激发激光 488 nm / 发射滤光片 525/25</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788-25g</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>荧光黄 CH 二锂盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（生长因子减少型，无酚红）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>细胞外基质溶液</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>&lt;em&gt;M. musculus&lt;/em&gt; C57/Bl6</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td></td><td>24 mm x 60 mm</td><td></td></tr><tr><td>小鼠类器官生长培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#06005</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Biochrom</td><td>L182-05</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IFN-&amp;gamma;</td><td>Biolegend</td><td>Cat#575304</td><td></td></tr></tbody></table>

研究活体类器官中肠道屏障的破坏

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

类器官与三维（3D）细胞培养技术可实现对复杂生物学机制及调控过程的体外研究, 这在传统的单层细胞培养中是无法实现的。此外，单层细胞培养虽然是良好的体外模型系统，但无法模拟依赖三维结构的复杂细胞分化过程和功能。. 迄今为止，相关研究仅能在动物实验中进行，而动物实验耗时耗力，且难以通过光学技术进行评估。本文中，我们描述了一种可定量测定活体小鼠小肠类器官随时间变化的屏障完整性的检测方法。为验证本模型的有效性，我们采用干扰素γ（IFN-γ）作为破坏屏障的阳性对照，并以IFN-γ受体2基因敲除小鼠来源的类器官作为阴性对照。该检测方法使我们能够确定IFN-γ对肠道屏障完整性的影响，以及IFN-γ诱导的紧密连接蛋白claudin-2、-7和-15的降解作用。该方法还可用于研究化学化合物、蛋白质、毒素、细菌或患者来源样本对肠道屏障完整性的影响。

为了验证三维小鼠小肠类器官作为评估调节肠道屏障完整性化合物效应的模型的应用价值，我们使用了IFN-γ。具体操作中，我们分离并培养了来源于对IFN-γ有反应的野生型小鼠和IFN-γ受体2基因敲除小鼠的类器官，后者无法对IFN-γ产生响应。8经IFN-γ或PBS（对照）处理48小时后，所有类器官均暴露于LY，并通过共聚焦转盘活细胞显微镜以5分钟间隔进行为期70分钟的成像。在此模型中，肠道屏障的功能完整性导致LY被排除在类器官腔外，而LY在腔内的积聚则表明紧密连接（TJ）遭到破坏。孵育LY 70分钟后具有代表性的荧光显微图像清晰显示，仅在经IFN-γ处理的野生型动物来源的类器官腔内可见LY荧光信号，而在未刺激（PBS）对照组以及来自基因敲除动物（IFN-γR2）的类器官中均未观察到腔内荧光。ΔIEC, 图170 分钟后，管腔内未见 LY 荧光。
加入EGTA可通过螯合紧密连接的辅助因子，非特异性地破坏肠道屏障的完整性。该对照始终在实验结束时使用，以证明相应类器官摄取LY的能力（图1）。若经EGTA处理后未检测到腔内LY荧光，则将该类器官从实验中剔除。
为了对显微镜结果进行定量评估，测量了类器官腔内和类器官外部的LY荧光强度。计算了相对荧光强度值（腔内荧光强度 / 腔外与腔内荧光强度之和），并针对每个成像时间点进行了展示。建议避免对大小不一的类器官进行成像。本研究选择重点关注直径为80 ± 30 µm的类器官（图2）。代表性图像及实验流程示意图见图3。一些主要问题及相应的解决方法在图4中展示并讨论。
<img alt="PBS 和 IFN-γ 中的显微细胞，延时荧光成像，细胞反应研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：小鼠类器官中可分析肠道屏障的完整性。 将来自 IFN-γR2WT 和 IFN-γR2ΔIEC 的肠道类器官在 IFN-γ 存在下培养 48 小时，或不做处理。为研究肠道屏障的完整性，加入 LY（457 Da），并以 5 分钟为间隔共采集 70 分钟的共聚焦荧光图像。图中显示了 0 分钟、70 分钟时间点以及加入 EGTA 后的代表性图像（绿色 = 萤光素黄；比例尺 = 20 µm）。本图经 Bardenbacher 等人8 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="类器官通透性分析；干扰素-γ效应的荧光显微镜图像及图表数据，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：小肠类器官屏障完整性模型可提供定量结果。（A）测定类器官内部和外部的LY荧光强度。计算相对荧光强度值（内部荧光 / 外部荧光 + 内部荧光），并以初始相对荧光强度 + 标准误（SEM）为基准，显示各时间点的结果。（B）所分析类器官的大小分布。为降低因表面积与体积比变化引起的标准化偏差和误差，仅分析直径为 80 ± 30 µm 的类器官。显示各组类器官直径的平均值 + 标准差（SD）（IFN-γR2WT，n = 20；IFN-γR2ΔIEC，n = 18）。不同组之间的平均直径值无显著差异（单因素方差分析）。（C）在加入LY后70分钟测定类器官的通透性。通透性定义为70分钟时的管腔内荧光强度除以观察期间测得的最小相对荧光强度。每根柱代表均值 + SD，数据来自两次独立实验获得的10个类器官（IFN-γR2WT，n = 20；IFN-γR2ΔIEC，n = 18）。干扰素-γ仅在IFN-γR2WT类器官中显著增加LY摄取。***Student t检验p值 &lt;0.001。该图经Bardenbacher等8修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用显微成像的类器官研究工作流程；含LY、EGTA使用的示意图和显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：代表性图像的示意图流程。（A）该实验方案主要步骤的示意图。（B）该实验方案主要步骤的代表性图像。（B1）通过适合进行通透性分析的类器官中央切面的微分干涉差（DIC）显微图像。虚线表示宽度为89 µm。（B2）与（B1）中相同的类器官在添加LY之前的荧光显微图像。该图像显示类器官的自发荧光。（B3）添加LY后70分钟的类器官图像。所示类器官未摄取LY，因此屏障功能完整。虚线标示了用于进一步分析的感兴趣区域（ROIs）。类器官的内腔及周围三个代表性区域已标记。（B4）添加EGTA后的类器官图像。该类器官可用于进一步分析，因其在EGTA处理后显示出LY摄取。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类器官自发荧光示意图；LY摄取分析的故障排除提示和荧光图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：常见问题的故障排除。（A）常见问题及解决方案表格。（B）示例图像。（B1）不适合本实验的大尺寸多分支类器官的微分干涉差（DIC）图像。（B2）在向培养基中添加LY之前即表现出高自发荧光的类器官共聚焦图像。该类器官被排除在定量分析之外。（B3）在添加LY前表现出低自发荧光的类器官共聚焦图像。此情况下的荧光信号被用于定量分析。（B4）在加入EGTA 30分钟后未显示任何LY摄取的类器官图像，因此被排除在定量分析之外。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种用于量化小肠类器官屏障完整性的技术。该方法基于活体类器官，能够以时间分辨的方式连续检测不同屏障完整性调节物质或其组合的影响。

类器官与三维（3D）细胞培养技术使得在体外研究以往难以实现的复杂生物学机制与调控过程成为可能，……

为了研究肠道屏障的完整性，我们建立了一种用于检测小鼠小肠类器官中肠道屏障完整性的方法。与常用的单层细胞培养相比，我们的检测基于三维小肠类器官。将二维检测方法适配至我们的模型对其实际应用至关重要。该检测基于体外培养的类器官，其应用将有助于确定肠道屏障完整性的诱导剂和抑制剂。紧密连接蛋白的调控是所有上皮细胞的重要特征。我们的检测方法能够实现上皮屏障功能的分析与评估。为了检测从小鼠肠道组织分离的类器官的屏障完整性，首先使用足量的含0.1% BSA的PBS溶液预包被所有将在类器官铺板过程中用于储存类器官的离心管，确保覆盖所有塑料表面。立即吸除BSA溶液，并将离心管置于冰上。接着，将细胞外基质溶液和类器官培养基在冰上解冻，并小心吸出48孔类器官培养板中每个孔内的培养基。用一毫升冷的PBS洗涤每个孔，然后剧烈吹打以溶解细胞基质。当获得相对均一的细胞悬液后，通过离心用新鲜PBS洗涤类器官两次，并将每份类器官培养物重悬于40微升冷培养基中。使用10微升移液枪头反复吹打五次，使较大的类器官结构解离，收集大小为40至60微米的结构，并将每份类器官悬液与40微升 freshly prepared 细胞基质溶液混合。将每个类器官细胞基质溶液悬液加入八孔板盖玻片各孔的中央，并将玻片置于冰袋上静置五分钟。孵育结束后，将玻片置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育20分钟，以促进类器官细胞基质结构的聚合，随后每孔加入150 µL类器官培养基，在细胞培养孵育箱中继续孵育24小时。孵育结束后，用10 ng/mL重组小鼠干扰素γ处理阳性对照孔，持续48小时。进行通透性检测时，将带孔的盖玻片转移至倒置共聚焦显微镜中预热至37摄氏度的培养室，并将培养室的二氧化碳浓度调节至5%。将盖玻片牢固锁定在显微镜载物台上，调整显微镜成像参数，以观察腔室中某一孔内的类器官。随后，在显微镜培养室内，向其中一个孔中加入3微升新配制的100毫摩尔荧光素黄溶液（溶于150微升培养基中），孵育1小时。孵育结束后，调节焦距以观察参考类器官的管腔结构，并设定激发荧光素黄所需的激光能量以及仪器相应的检测灵敏度，使荧光素黄信号的成像强度达到仪器可用动态范围的30%至40%。或者，可通过改变曝光时间来调整信号强度。利用微分干涉差活细胞成像，在每孔中寻找约10个靠近盖玻片表面、呈近似球形结构的类器官，选择直径相近的类器官，并聚焦于类器官的中央切面以成像其管腔。记录每个位置的微分干涉差图像和荧光素黄荧光，以记录每个类器官的形态和自发荧光情况。当所有类器官完成成像后，在含 Lucifer yellow 的处理孔中加入 150 微升培养基，并每 5 分钟对所有孔进行一次成像，持续 70 分钟。成像结束后，在 100 微升培养基中加入 4 微升 freshly prepared EGTA，将稀释后的 EGTA 加入相应的孔中。然后，每5分钟记录一次每个孔中类器官的荧光，持续30分钟。务必提前练习类器官的操作与培养，因为细胞活力和完整性是实验成功的关键前提。在此项代表性实验中，经胞内卢西弗黄处理70分钟后，仅在经干扰素γ处理的野生型动物来源的类器官中观察到腔内卢西弗黄荧光。在处理结束时，无论是未受刺激的对照组，还是来自干扰素γ受体-2基因敲除动物的类器官，均未显示出管腔内萤光素黄的荧光。加入EGTA后，通过螯合紧密连接的辅助因子，导致肠道屏障完整性的非特异性破坏，从而引起所有类器官（无论来源或处理条件如何）对萤光素黄的摄取和表达。类器官管腔内及每个类器官外部的萤光素黄荧光相对强度值也可进行定量分析。务必选择大小和构型相近的类器官，并设定观察轴向，以便能够辨识类器官的中央腔。除了使用诱导肠道屏障破坏的物质外，我们还可以研究抑制肠道屏障损伤的策略。由于该方法基于单个动物的原代细胞，因此可用于多种检测，从而减少每次实验所需的动物数量。

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研究活体器官的肠道屏障分解

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本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

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结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

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二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

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术后肠梗阻（POI）是腹部手术后的一种并发症，可导致发病率升高和住院时间延长。由于目前缺乏有效的预防或治疗策略，亟需加强相关研究。因此，我们建立了一种标准化且可行的小鼠模型，用于研究POI的病理生理机制，并探索潜在的治疗方案。...

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