研究活体器官的肠道屏障分解
March 26th, 2020
在这里，我们描述了一种量化小肠道器官的屏障完整性的技术。该方法以活器官为基础，能够以时间解析的方式对不同的屏障完整性调节物质或其组合进行顺序调查。
为了研究肠道屏障的完整性，我们开发了一种测量小鼠小肠道器官肠道屏障完整性的方法。相比之下，我们指的是使用过的单层细胞培养，我们的测定是基于三维小肠道器官。将二维测定技术适应我们的模型对于其实用性至关重要。
该测定基于体外培养的器官，其应用将有助于定义肠道屏障完整性的诱导剂和抑制剂。紧结蛋白的调节是所有上皮细胞的一个重要特征。我们的测定能够功能和分析上皮屏障的完整性。
为了测量从小鼠肠道组织分离出的器官的屏障完整性，首先预涂所有在电镀过程中用于储存器官的离心管，在PBS中有足够的0.1%BSA覆盖所有塑料表面。立即取出 BSA 溶液，将管子放在冰上。接下来，解冻冰上的细胞基质溶液和器官培养基，小心地从48个井的有机体培养板的每个井中去除培养基。
在大力移液以溶解细胞基质之前，用一毫升的冷PBS清洗每一个井。当获得相对均匀的细胞悬浮液时，用新鲜PBS洗涤两次，通过离心，并在40微升的冷介质中重新悬浮每个器官培养。通过10微升移液器尖端分离大型器官结构五次，收集40至60微米大小的结构，将每个器官悬浮液与40微升新鲜准备的细胞基质溶液混合。
将每个有机细胞基质溶液悬浮液加入八孔室盖玻片的单个孔中心，并将幻灯片放在冰袋上五分钟。在孵化结束时，将幻灯片在37摄氏度和5%二氧化碳下放置20分钟，使器官细胞基质结构聚合，然后向每井添加150微升的有机细胞培养基，在细胞培养箱中24小时孵化。在孵化结束时，用每毫升10毫微克的重组喃喃干扰素伽马处理正控制井48小时。
要进行渗透性测定，将室盖玻片转移到倒置共体显微镜的37摄氏度加热孵化室，将室的二氧化碳锁定5%，将盖玻片紧紧锁定在显微镜舞台上，并调整显微镜的成像设置，以可视化室的一个井中的器官。然后，在150微升的中到一井中加入三个新鲜准备的100毫摩尔路西法黄微升，在显微镜室中孵育一小时。在孵化结束时，调整焦点以可视化参考器官的流明，并定义路西法黄色激发所需的激光能量和仪器在仪器可用动态范围内的 30 到 40% 对路西法黄色信号进行图像的分别检测灵敏度。
或者，可以通过更改曝光时间来修改信号强度。通过差分干扰对比实时成像，捕捉直径可比的器官，并聚焦器官中央切片以成像流明，找到每孔靠近盖玻表面的大约10个器官的位置。记录每个位置的差分干扰对比度和路西法黄色荧光，以记录每个器官的形状和自动荧光。
当所有器官都成像后，在路西法黄色处理井中加入150微升的介质，包括路西法黄色，每五分钟对所有井进行70分钟的成像。在成像会话结束时，在 100 微升介质中添加 4 微升新准备的 EGTA。将稀释的 EGTA 添加到相应的油井中。
然后，每井每5分钟记录一次有机体荧光，每次30分钟。一定要提前练习处理和培养或器官，因为细胞的生存能力和完整性是测定成功的先决条件。在这个具有代表性的实验中，经过70分钟的治疗，路西法黄色宫内路西法黄荧光只有在用干扰素伽马治疗的野生动物的器官中才能看到。
无论是未刺激的对控制，还是从干扰素伽马受体-2敲击动物中提取的器官，在治疗期结束时均未显示卢西法弗黄色荧光。EGTA 的加入通过隔离紧密结联合因子导致肠道屏障完整性的不特异性分解，导致路西法黄色吸收和表达在所有器官中，无论来源或治疗条件如何。在器官流明内和每个器官外，路西法黄色荧光水平的相对强度值也可以量化。
请务必选择配置大小相当的器官，并选择设置轴，以便您能够想象器官的中心流明。除了使用诱导肠道屏障分解的物质外，我们还可以研究抑制肠道屏障破坏的策略。由于这种方法基于单个动物的原发细胞，它可用于许多检测，减少了每个实验所需的动物数量。
概述
本研究提出了一种新方法，用于量化源自小鼠组织的小肠类器官的屏障完整性。该技术允许对随时间变化的屏障完整性进行调节的各种物质进行调查。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 胃肠病学
背景
- 肠屏障完整性对维护肠道健康至关重要。
- 传统的检测方法通常依赖于二维细胞培养。
- 三维类器官模型提供了一个更具生理相关性的系统。
- 紧密连接蛋白在上皮屏障功能中起关键作用。
研究目的
- 开发一种实用的检测方法，用于测量类器官中的肠道屏障完整性。
- 识别屏障完整性的诱导剂和抑制剂。
- 增强对上皮细胞调节的理解。
使用的方法
- 培养并准备类器官进行分析。
- 使用荧光素黄进行渗透性检测。
- 利用荧光成像来评估屏障完整性。
- 对荧光强度数据进行统计分析。
主要结果
- 荧光素黄的荧光显示了处理后的类器官中的屏障完整性。
- 未处理的对照组没有显示荧光，表明屏障完整。
- EGTA处理破坏了所有类器官类型的屏障完整性。
- 该方法允许对屏障调节进行比较研究。
结论
- 开发的检测方法对于研究肠道屏障完整性是有效的。
- 它可以用来探索屏障破坏和保护策略。
- 这种方法减少了实验中多种动物模型的需求。
常见问题
Executive Industry Relevance
This assay enables quantitative assessment of intestinal barrier integrity in living organoids, supporting mechanistic de-risking of gut-targeted therapeutics. By measuring tight junction protein dynamics and permeability changes, it provides predictive value for early-stage target validation in gastroenterology and mucosal immunology programs. The method reduces reliance on animal models while improving translational relevance for barrier-modulating compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on barrier function using IFN-γ as a validated inducer of barrier disruption.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantification of claudin-2, -7, and -15 degradation in tight junctions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing barrier-compromising from barrier-protective compounds in primary cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes.
- Quantitative Output: Generates measurable Lucifer yellow fluorescence intensity to assess barrier integrity over time.
- Reproducibility: Standardizes organoid preparation and imaging protocols for consistent cross-well and cross-experiment comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human intestinal barrier function to study mechanisms relevant to inflammatory bowel disease and epithelial pathologies.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by maintaining physiological 3D structure and cellular differentiation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying barrier breakdown or protection in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for gastrointestinal and immunomodulatory programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying IFN-γ-mediated pathways in epithelial barrier regulation.
- Screening: Enables scalable compound evaluation through standardized permeability readouts in live organoids.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements that allow teams to compare barrier integrity across conditions and timepoints.
- Translational Research: Maintains continuity from in vitro findings to preclinical models by preserving 3D architecture and tight junction functionality.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiple assays, reducing animal use and increasing experimental throughput.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by linking molecular perturbations to functional barrier outcomes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined organoid preparation, treatment, and imaging workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on barrier integrity profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds that modulate intestinal permeability in discovery pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, confocal microscopy, and fluorescence quantification.
- Depends on inverted confocal microscopy with environmental control for live imaging.
- Necessitates standardization of organoid size, matrix preparation, and imaging parameters across teams.
- Adaptation to human or patient-derived organoids may require optimization of culture conditions.
- Practical limitations include dependency on organoid viability and integrity, which must be confirmed prior to assay initiation.
