分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

线粒体功能障碍是多种神经退行性疾病的基础。本方案为研究轴突中的线粒体动态提供了重要工具，有助于探索涉及轴突变性的神经系统疾病。通过结合线粒体标记、活细胞成像和诱导性多能干细胞技术，本方案可用于表征线粒体在人轴突中的运输过程，并分析其形态学特征。

在神经退行性疾病的干细胞培养和动物模型中，可观察到线粒体运输和形态的损伤，这为治疗这些疾病提供了潜在的治疗靶点。培养至第35天后，将由人诱导多能干细胞分化而来的神经球用1 mg/ml的细胞解离溶液在37摄氏度下解离2分钟，形成小细胞簇。孵育结束后，通过离心收集细胞簇，并将沉淀重悬于1毫升NDM培养基中。

将约五个细胞簇接种于每孔含100微升培养基的35毫米玻璃底培养皿中，培养皿预先用多聚鸟氨酸和无乳酸脱氢酶升高病毒感染的低生长因子基底膜基质包被。随后，向每孔培养物中加入1毫升NDM培养基，并补充B27、环磷酸腺苷（cAMP）、胰岛素样生长因子、人源脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子。为观察前脑神经元轴突中的线粒体，首先在37°C条件下，用50纳摩尔的红色荧光染料在NDM中对神经元染色3分钟，随后用预温的NDM洗涤两次。

接下来，将培养物置于荧光显微镜的载物台上，选择40X物镜。在相差视野下，根据轴突的形态学特征进行识别。为了清晰区分线粒体沿轴突的运动方向，需明确识别神经元的细胞体。

在区分出细胞体和轴突后，调整轴突中线粒体的曝光时间和焦距，每五秒捕获一次轴突内的线粒体运输情况，持续五分钟。为在 ImageJ 中分析线粒体运输，打开 Fiji 并选择 Bio-Formats 插件。使用 Bio-Formats 导入器导入 tiff 序列的时间序列图像，并选择标准 ImageJ 和全部打开序列。

勾选自动缩放分通道，点击“确定”，并注意记录图像的帧数和以像素为单位的尺寸。调整所有60帧的亮度和对比度后，使用分段线工具从细胞体向轴突末端画一条线。生成Kymograph时，选择多帧Kymograph插件，并设置线宽。

为测量移动线粒体的距离、时间值和速度，请在宏插件中打开 tsp050607.txt 文件，并在kymograph上沿线粒体运动轨迹从上部区域到下部区域绘制一条分段线。

在宏插件中绘制直线后，从 tsp 读取开放速度，以获取与该直线相对应的分段速度。接着打开原始图像，使用直线工具沿比例尺绘制一条直线。选择“分析”以测量该直线的长度，并将 dx 值及距离单位从像素转换为微米。

然后将时间单位从像素转换为秒。为了在 ImageJ 中分析轴突内的线粒体长度和面积，请安装 straighten_underscore.dot JAR 插件，并打开感兴趣的轴突图像。将 32 位图像转换为 8 位图像，并使用分段线工具追踪轴突。

选择 Straighten underscore JAR 插件，并将纤维宽线的宽度设置为 50 像素。再次追踪轴突以生成拉直的轴突，并调整图像阈值。选择“分析”→“设置测量”→“周长”→“拟合椭圆”和“形状描述符”以设定测量参数，并使用线条工具测量原始图像中的比例尺，操作如图所示。

在“分析”中设置比例尺时，输入已知距离的像素值及长度单位以设定比例尺。然后选择“全局”，将比例尺设置应用于所有图像。最后选择“分析”和“分析颗粒”，以测定面积，并选择“显示结果”以查看测量结果。

分化为端脑谷氨酸能神经元后，可通过检测T-B-R one和βIII微管蛋白标志物的表达对细胞进行表征。利用红色荧光染料染色并结合延时成像，可评估线粒体在轴突中的运输情况。单个线粒体可在轴突内保持静止，或进行顺向或逆向运动。

可按照图示方法定量分析线粒体沿轴突运动的速度。例如，使用市售的分析软件可发现，与野生型神经元相比，S-P-G-3-A 神经元中运动性线粒体所占百分比显著降低。为分析线粒体的面积、长度及长宽比，可在图像分析软件中将轴突拉直，并通过调整阈值进行选取。

随后可从拉直的轴突中获取线粒体的面积、周长、长度、宽度和长宽比。例如，与对照组野生型轴突相比，S-P-G 15 神经元轴突中的线粒体长度和长宽比均显著降低。实验中需注意将培养基和显微镜培养箱预热，轻柔洗涤细胞，并在成像前让细胞稳定 20 分钟。

活细胞成像后，可对培养物进行固定并进行免疫染色，以检测其他目的蛋白的表达。在活体人神经中观察线粒体动态变化具有挑战性。该技术为研究神经系统疾病中的线粒体动态变化及神经变性提供了独特的工具。