Name: 鸡寄生虫的成核和活体繁殖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解利用核转染技术对鸡艾美耳球虫进行基因转染的方法。该技术可实现基因功能研究、疫苗开发和药物靶点筛选，为球虫遗传操作提供重要参考。

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本工作得到中国国家重点研发计划（2017YFD0501200）和国家自然科学基金（31572507、31772728 和 31873007）的资助。

所有动物实验所用的鸡均按照中国农业大学机构动物护理和使用委员会指南进行饲养和管理，并遵循涉及动物的生物医学研究国际指导原则。实验经北京市实验动物管理委员会批准。
1. Eimeria 属（例如 E. tenella）孢子化子孢子的提取与纯化
<ol>
	<li>孢子囊的释放
	<ol>
		<li>将 1 × 107 个孢子化的卵囊在重铬酸钾溶液（2.5%，m/v）中以 2,300 × g 离心 5 分钟。用 PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤三次。</li>
		<li>用 1 mL PBS 重悬沉淀物，并转移至 15 mL 离心管中。加入等体积的玻璃珠（直径范围为 1 mm × 1 mm），使用涡旋混合器振荡卵囊悬液以释放孢子囊。</li>
		<li>每隔一分钟在显微镜下观察孢子囊的释放情况。当超过 90% 的卵囊破裂时，停止涡旋。
		 
		注：大多数卵囊（如 E. tenella、E. necatrix 和 E. acervulina）使用涡旋混合器处理 1 分钟后即可破裂。</li>
		<li>将孢子囊悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中，以 1,600 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用 1 mL 50% 密度梯度溶液重悬沉淀物，合并至 1.5 mL 离心管中，以 10,000 × g 离心 1 分钟。
		 
		注：密度梯度溶液的组成参见 表 1。该密度梯度为基于二氧化硅的胶体介质，由直径为 15–30 nm 的胶体二氧化硅颗粒（水中质量分数为 23%）组成，表面经聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子孢子的释放
	<ol>
		<li>用脱囊缓冲液（表 1）重悬沉淀物，在 42 °C 水浴中孵育 40–60 分钟以释放子孢子。当超过 90% 的子孢子已释放时，停止孵育，随后以 600 × g 离心 10 分钟。
		 
		注：脱囊期间每 5 分钟轻轻摇动离心管一次。</li>
		<li>用 1 mL 55% 密度梯度溶液重悬沉淀物，以 10,000 × g 离心 1 分钟。</li>
		<li>用 1 mL PBS 重悬沉淀物，使用血细胞计数板对子孢子进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. E. necatrix 裂殖子的收集与纯化
注意：实验中使用7至14日龄的艾拔益加（Arbor Acre, AA）肉鸡。将球虫-free鸡（n=3）接种2 × 105 卵囊的 E. necatrix感染后109小时，通过颈椎脱位法处死禽鸟。取出肠道以收集2nd 裂殖子的生成。对于不同的 艾美耳球虫 物种，其采集时间各不相同nd 裂殖子 generation E. necatrix 在109小时时，以及 E. tenella 接种后112小时。对于转染 E. necatrix，裂殖子是最佳选择，因为第二代裂殖子易于纯化。
<ol>
	<li>收集E. necatrix的第二代裂殖子
	<ol>
		<li>沿鸡小肠从卵黄蒂（小肠中段）至回盲瓣处纵向剪开，并在培养皿中用PBS或HBSS（Hank's平衡盐溶液）轻轻冲洗三次。</li>
		<li>将肠组织剪成0.5 cm × 0.5 cm的小片，放入锥形瓶中，加入消化缓冲液（表1）。将锥形瓶置于37 °C磁力搅拌器上，使用搅拌子搅拌30–60分钟以释放裂殖子。孵育30分钟后，每隔5分钟在显微镜下观察裂殖子的释放情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过过滤和离心纯化裂殖子。
	<ol>
		<li>使用四层纱布过滤含有消化后裂殖子的悬液14，然后在600 × g下离心10分钟。</li>
		<li>离心后，弃去含有肠组织碎片的上清液。将含有纯化裂殖子的沉淀转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>用1 mL PBS重悬沉淀，并使用血细胞计数板对裂殖子进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 裂殖子或子孢子的核转染
<ol>
	<li>转染前的寄生虫准备
	<ol>
		<li>在一个离心管中准备约 107 个裂殖子或子孢子。若转染裂殖子，需准备 3–4 个离心管。</li>
		<li>准备不少于 10 µg 的质粒 DNA 或纯化的 PCR 片段。 
		注意：本研究中使用的质粒包含两个基因：增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和来源于Toxoplasma gondii的二氢叶酸还原酶-胸苷酸合酶（TgDHFR-TS）15。</li>
		<li>准备 25 U 限制性内切酶。若质粒为线性化形式，加入限制性内切酶可提高转染效率；若质粒为环状，则省略限制性内切酶。</li>
		<li>准备 85 µL 核转染缓冲液：将 20 µL 核转染缓冲液 I 与 1 mL 核转染缓冲液 II 混合，取其中一部分使用。总体积为 100 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>核转染
	<ol>
		<li>将子孢子或裂殖子悬液在 600 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>按以下顺序向含有子孢子或裂殖子的 1.5 mL 离心管中加入 85 µL 核转染缓冲液、10 µg 质粒（或 PCR 片段）以及 25 U 限制性内切酶（通常为 5 µL）。</li>
		<li>将悬液转移至核转染杯中，并将转染杯放入核转染仪的转染槽内。</li>
		<li>按下电源按钮开启核转染仪，选择转染程序 U-033。若仪器启动后进入 Free Program Choice 模式，请按 X 按钮退出该模式。</li>
		<li>程序运行结束后，按下核转染仪的 X 按钮，屏幕应显示 OK，表示核转染成功。</li>
		<li>向核转染杯中加入 0.5–1 mL 的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）8 以终止反应，轻轻混匀后将悬液转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 泄殖腔接种或静脉注射
<ol>
	<li>将转染后的寄生虫接种至7日龄的鸡。通过泄殖腔途径接种E. necatrix的裂殖子或E. tenella的子孢子，而E. acervulina的子孢子则通过静脉注射接种。每只鸡接种约2 × 107个子孢子，每只鸡接种107个裂殖子。</li>
</ol>
5. 扩增与流式细胞分选
<ol>
	<li>在接种转染的子孢子后5-9天，从粪便中收集卵囊；在接种转染的裂殖子后第3天收集卵囊。</li>
	<li>采用荧光激活细胞分选（FACS）和150 mg/kg的乙胺嘧啶8，逐步提高转基因群体的比例。 
	注意：乙胺嘧啶可通过直接添加至饲料中使用。为便于使用，可配制水溶性乙胺嘧啶：将1 g乙胺嘧啶溶解于0.2 mL H2SO4和9.8 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）中，然后将1.5 mL该储备液加入1 L饮水中供禽类饮用。</li>
</ol>
6. 可选的柱纯化步骤
注意：如果需要更纯净的子孢子或裂殖子，可通过二乙氨基乙基-52 纤维素（DE-52 纤维素）柱层析进行纯化的可选方法。
<ol>
	<li>至少提前一天准备 DE-52 纤维素柱。
	<ol>
		<li>配制甘氨酸洗脱缓冲液（表 1）。将甘氨酸洗脱缓冲液的 pH 值调节至 7.6–8.0，并预热至 41 °C。</li>
		<li>向柱中加入 2.5 g DE-52 纤维素。加水浸泡过夜。弃去上清液。</li>
		<li>加水浸泡 1 小时。弃去上清液。</li>
		<li>加入 0.1 M NaOH，浸泡至少 2 小时。重复此步骤一次。</li>
		<li>将上清液更换为水。待纤维素完全沉降至底部（约半小时）后，重复此步骤一次。</li>
		<li>弃去上清液，加入 0.1 M HCl，浸泡至少 2 小时。重复此步骤一次。</li>
		<li>弃去上清液，用甘氨酸洗脱缓冲液浸泡纤维素两次。</li>
		<li>通过加入 0.1 M HCl 或 0.1 M NaOH 测量并调节 pH 值至 7.6–8.0。 
		注意：此步骤中液体体积至少为 DE-52 纤维素体积的 5 倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节流速至 40–50 r/min。</li>
	<li>当纤维素沉降完成后，将子孢子或裂殖子悬液加入层析柱中。调节流速至 30–40 r/min。 
	注意：在加入层析柱前，需用甘氨酸洗脱缓冲液重悬子孢子或裂殖子沉淀。</li>
	<li>用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱并收集至 50 mL 离心管中。根据洗脱过程中显微镜检查子孢子或裂殖子的结果决定收集终止时间。</li>
	<li>将收集的甘氨酸洗脱缓冲液在 600 × g 条件下离心 10 分钟。将子孢子或裂殖子沉淀转移至新的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对子孢子或裂殖子进行计数。</li>
</ol>

<ol><li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox%2C+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li>
<li>Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+in+Toxoplasma+gondii+with+chloramphenicol+acetyltransferase+as+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker.</a> Science. 262 (5135), 911-914 (1993).</li>
<li>Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+DNA+transformation+in+the+obligate+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii+by+complementation+of+tryptophan+auxotrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).</li>
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<li>Goonewardene, R., Daily, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+the+malaria+parasite+and+expression+of+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).</li>
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<li>Tao, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Eimeria+magna+Perard%2C+1925+Displays+Similar+Parasitological+Properties+to+the+Wild-type+Strain+and+Induces+an+Exogenous+Protein-Specific+Immune+Response+in+Rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.).</a> Frontiers in Immunology. 8, 2(2017).</li>
<li>Shi, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Transfection+of+Eimeria+intestinalis+and+Investigation+of+Its+Life+Cycle%2C+Reproduction+and+Immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 807(2016).</li>
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</ol>

20世纪90年代，人们开发出了一种用于顶复门寄生虫的转染系统，并将其应用于艾美耳球虫的研究。近年来，已成功实现对E. tenella8,9和E. nieschulzi15的稳定转染。我们通过转染第二代裂殖子实现了E. necatrix的稳定转染11。通过翅静脉接种转染后的E. acervulina子孢子，解决了E. acervulina子孢子无法通过泄殖腔途径接种的问题（Zhang等，未发表数据）。本文中，我们描述了一种详细的转染操作流程，以帮助研究人员对艾美耳球虫进行核转染。
既往研究表明，通过剖腹手术将转染后的子孢子注入兔肠腔，可实现对E. magna16和E. intestinalis<sup ...

Eimeria spp. 引起球虫病，导致畜牧业和家禽业遭受重大经济损失。尽管抗球虫药物以及一定程度上的减毒抗球虫疫苗已广泛用于球虫病的防控，但仍存在耐药性、药物残留以及疫苗株恢复毒力后扩散等缺陷1。随着分子生物学的发展，转染技术已成为研究 Eimeria 基因功能、开发新型疫苗以及筛选新药物靶点的重要工具。
近几十年来，转染技术已成功应用于顶复门寄生虫，如Plasmodium和Toxoplasma gondii2,3,4,5,6。一项利用β-半乳糖苷酶（β-gal）作为报告基因的研究，首次在E. tenella中实现了Eimeria属的转染实验7。随后，对E. tenella8,9、E. mitis10以及E. acervulina（Zhang等，未发表数据）的转染在鸡体内也相继获得成功。最近，我们通过核转染技术成功实现了利用E. necatrix裂殖子进行的转染11。
研究表明 艾美球虫属 表达异源抗原的重组疫苗具有开发为重组疫苗的潜力，例如表达以下抗原的疫苗 空肠弯曲菌 抗原A（CjaA）或鸡白细胞介素2（chIL-2）12,13因此，本方案描述了一项核转染研究 艾美球虫 鸡中 spp. 的研究。该方案描述了子孢子或裂殖子的纯化、质粒 DNA 的核转染、泄殖腔接种/静脉注射以及体内扩增，以帮助研究人员开展转基因研究。 艾美耳球虫 寄生虫

<table><tbody><tr><td>ATP二钠盐</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>纤维素DE-52</td><td>Solarbio</td><td>C8350</td><td></td></tr><tr><td>恒流泵</td><td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td><td>HL-2B</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MACGENE</td><td>CM15019</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>Z250473-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>No. V900116</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Biotopped</td><td>G6200</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>MACGENE</td><td>CC016</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>No. V900041</td><td></td></tr><tr><td>低速离心机</td><td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td><td>DT5-2</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>SCILOGEX</td><td>MS-H280-Pro</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo细胞分选仪</td><td>BeckMan Coulter, US</td><td>201309995</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>核转染装置</td><td>LONZA/amaxa</td><td>90900012 (Nucleofector II)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll（密度梯度储备液）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>牛磺脱氧胆酸钠水合物</td><td>Sigma</td><td>T0875</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 微型离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>DMEM的组成：每升含4.5 g葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和25 mM HEPES。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Solarbio</td><td>T8150</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td><td>HQ-60-II</td><td></td></tr><tr><td>水浴恒温器</td><td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td><td>GD120,GM0815010</td><td></td></tr></tbody></table>

核转染与鸡体内扩增 艾美耳球虫 寄生虫

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

转染是一种将遗传物质（如DNA和双链RNA）导入细胞以修饰目的基因的技术过程。目前，转基因技术已成为研究中不可或缺的工具 艾美球虫，家禽和家畜球虫病的致病原。本方案详细描述了艾美耳球虫的稳定转染技术：孢子子或第二代裂殖子的纯化与核转染，以及转染后寄生虫的体内扩增。利用本方案，我们成功实现了多种艾美耳球虫物种的转染 艾美球虫综上所述，核转染是促进艾美球虫寄生虫遗传操作的一种有用工具。

该方案已用于转染艾美耳球虫寄生虫。在本研究中，2nd 裂殖体和裂殖子的产生 E. necatrix 被展示在 图2A 和 图2B，而 图2C 和 图2D 显示了孢子囊和孢子子 E. tenella 使用密度梯度溶液后，卵囊的 E. necatrix (图3A）和 E. tenella (图3B子孢子转染后产生的第一代卵囊转染效...

本文提供了一种通过核转染子孢子或第二代裂殖子实现鸡艾美球虫（Eimeria）寄生虫稳定转染的方法。表达外源抗原基因的基因修饰艾美球虫可作为疫苗递送载体。

转染是一种技术过程，通过该过程将遗传物质（如DNA和双链RNA）导入细胞，以修饰基因……

建立艾美球虫属（Eimeria）物种的转染技术方案将有助于推进基因功能研究、新型疫苗开发以及艾美球虫新药物靶点的筛选。利用该技术，我们成功实现了多种艾美球虫的转染，其中核转染是一种有效的工具，可促进对艾美球虫类寄生虫进行遗传操作的应用。艾美球虫的核转染为其他无法在体外培养的寄生虫的转染研究提供了参考，将加速对其遗传操作的研究进程。如果您首次尝试该技术，应在转染开始前充分准备好所有试剂及其仪器，以避免实验过程中手忙脚乱。该方法的实施有助于专注于艾美球虫转染的研究人员观察本实验的精细步骤。首先进行孢子囊的释放，将1×10⁷个孢子化卵囊在重铬酸钾溶液中以2,300×g离心5分钟。用 PBS 洗涤三次。用 1 毫升 PBS 重悬沉淀，并将混合物转移至 15 毫升离心管中。加入等体积的直径为 1 毫米的玻璃珠，使用涡旋振荡器振荡卵囊悬液，以释放孢子囊。每隔一分钟，通过显微镜监测孢子囊的释放情况。当超过90%的卵囊破裂时，停止涡旋振荡。将孢子囊悬液转移至新的1.5毫升离心管中，在1,600 ×g下离心5分钟。用1毫升50%密度梯度溶液重悬沉淀物，并在10,000 × g下离心1分钟。为释放子孢子，用脱囊缓冲液重悬沉淀物，于42°C水浴中孵育40至60分钟以释放子孢子。在脱囊过程中，每5分钟摇动试管一次。当超过90%的子孢子已释放时，停止孵育。在600 × g下离心10分钟。用1毫升55%密度梯度溶液重悬沉淀物，然后在10,000 × g下离心1分钟。用1毫升PBS重悬沉淀，并使用血细胞计数板对子孢子进行计数。为收集柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子，从卵黄蒂至回盲口纵向切开鸡的小肠，并在培养皿中用PBS或HBSS轻柔清洗三次。将小肠剪成小段，放入锥形瓶中，并加入消化缓冲液。将烧瓶置于37摄氏度的磁力搅拌器上，加入搅拌子，持续搅拌30至60分钟以释放裂殖子。孵育30分钟后，每隔5分钟通过显微镜检查监测裂殖子的释放情况。为纯化裂殖子，将含有消化后裂殖子的悬液倒入四层纱布上，过滤至50毫升离心管中，随后以600 × g离心10分钟。离心后，弃去含有肠道碎片的上清液。将含有纯化裂殖子的沉淀转移至1.5毫升离心管中。用1毫升PBS重悬沉淀，并使用血细胞计数板对裂殖子进行计数。首先，将子孢子或裂殖子悬液在600 × g条件下离心10分钟，然后弃去上清液。随后按以下顺序向含有子孢子或裂殖子的1.5 mL离心管中加入85 µL核转染缓冲液、10 µg质粒DNA和25单位限制性内切酶。将悬液转移至核转染杯中。将转染杯放入核转移槽内。按下电源按钮启动核转染仪，并选择转染程序 U-033。程序结束后，按下核转染仪的 X 按钮，屏幕显示 OK，表示核转染成功。向核转染杯中加入 0.5 至 1 毫升的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）以终止反应

nucleofection-and-in-vivo-propagation-of-chicken-eimeria-parasites

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

鸡寄生虫的成核和活体繁殖

使用细尖微量移液器，我们将质粒DNA注射到鸡胚体节或神经管的亚区域中。通过调整质粒浓度以获得单个转染细胞。随后，我们让这些细胞发育形成克隆群体。...

鸡胚中的单细胞转染

一种针对孵化后期（晚于汉伯格和汉密尔顿分期（HH）22期）鸡胚的基因转移方法被描述。该方法克服了传统方法的若干缺点。 在卵内...

通过基因转导将基因导入较老龄鸡胚 体外孵化 电穿孔

来源：Yates, J. G. E., 等。从羊水制备高滴度重组新城疫病毒。J. Vis. Exp.

从鸡胚尿囊液中纯化病毒

在本视频中，我们介绍了核转染技术，这是一种基于电穿孔的转染方法，用于将编码荧光报告蛋白的质粒DNA导入鸡艾美球虫（Eimeria）的子孢子阶段寄生虫中。...

寄生虫形态的核转染：一种基于电穿孔的转染方法将编码荧光蛋白的质粒导入子孢子细胞核

鸡胚视网膜细胞培养是研究光感受器生物学的重要工具。我们开发了一种基于高效基因转导技术的方法 ex ovo...

用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

可孵化的鸡胚被广泛用于大量生产人流感A病毒，因其提供了一种便捷且经济高效的方法，可获得高产量的病毒。...

流感病毒在鸡胚中的增殖

鸡球虫（Eimeria）感染的诊断仍然具有挑战性。基于寄生虫形态学和宿主病理学的方法通常无法得出明确结论，而基于PCR的分子检测方法则在成本和专业技术方面要求较高。本实验方案旨在建立环介导等温扩增（LAMP）技术，作为一种简便的球虫感染分子诊断方法。...

环介导等温扩增（LAMP）检测法用于特异性检测感染鸡的Eimeria物种

本文的总体目标是描述如何对鸡胚进行in...

在卵内 鸡胚血管内注射

该方法展示了鸡胚作为一种简单且经济高效的体内模型，可用于将处于可存活但不可培养（VBNC）状态的细菌病原体L.

鸡胚作为 在体 内 复苏可存活但不可培养病原体的模型

人类胚胎干细胞（ES细胞）的传代培养

了解利用核转染技术对鸡艾美耳球虫进行基因转染的方法。该技术可实现基因功能研究、疫苗开发和药物靶点筛选，为球虫遗传操作提供重要参考。

核转染与鸡体内扩增艾美耳球虫寄生虫

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核转染与鸡体内扩增 艾美耳球虫 寄生虫

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