Name: 脊柱植入物感染的体内小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解脊柱植入物感染的体内小鼠模型，利用生物发光金黄色葡萄球菌Xen36和不锈钢K型钢丝植入物，通过生物发光成像技术实时纵向监测细菌负荷，为研究宿主、植入物和治疗因素对感染的影响以及评估新型治疗策略提供可靠平台。

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作者感谢北美小儿骨科协会Biomet脊柱研究基金、美国国立卫生研究院临床与转化科学研究所KL2基金以及HH Lee外科研究基金对本实验的主要资助。

所有动物的饲养和操作均严格遵循《动物福利法》（AWA）中规定的联邦法规、1996年版《实验动物护理与使用指南》、公共卫生服务局（PHS）关于实验动物人道护理与使用的政策，以及本机构在《动物护理与使用培训手册》中制定的政策和程序；所有涉及动物的操作均经加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（ARC）批准。
1. S. aureus 生物发光菌株的选择
<ol>
	<li>使用生物发光的 S. aureus Xen36 菌株作为目标接种物。 
	注：该菌株源自亲本菌株 S. aureus ATCC-49525，后者为来自败血症患者的临床分离株。S. aureus Xen36 独特地利用一个 luxABCDE 操纵子，该操纵子经过优化并整合到宿主的天然质粒中。19 因此，Xen36 菌株能够产生峰值波长发射为 490 nm 的蓝绿色生物发光。该发光信号仅由存活且具有代谢活性的细菌产生。</li>
</ol>
2. 准备 S. aureus 用于接种
<ol>
	<li>在LB培养基（含1.5%琼脂）中加入200 μg/mL卡那霉素，以分离金黄色葡萄球菌（S. aureus）Xen36并防止潜在污染，利用与lux操纵子相连的卡那霉素抗性基因进行筛选19。</li>
	<li>将金黄色葡萄球菌（S. aureus）Xen36菌株划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板（胰蛋白胨大豆肉汤[TSB]加1.5%琼脂），于37 °C培养12–16小时。</li>
	<li>挑取单个金黄色葡萄球菌（S. aureus）Xen36菌落，分别接种于TSB培养基中，在37 °C摇床（200 rpm）中培养12–16小时。</li>
	<li>将所得菌液按1:50比例稀释。</li>
	<li>于37 °C继续培养2小时，以获得对数中期细菌。</li>
	<li>将细菌离心沉淀，用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬并洗涤三次。</li>
	<li>测定600 nm处的吸光度。理想的OD600值应在0.700至0.750之间，相当于4×105 CFU/mL。通过系列稀释调整至所需细菌接种量（1 × 103&#160; CFU/2 µL）。 
	注意：建立慢性感染的最佳Xen36菌量为1 × 103 CFU。较低剂量会被宿主免疫系统清除，而较高剂量则导致伤口破裂。伤口破裂无法区分深部植入物感染与浅表伤口感染，因此在本模型中应避免（图1）20。</li>
</ol>
3. 小鼠
<ol>
	<li>使用12周龄的雄性C57BL/6J野生型小鼠。</li>
	<li>每笼饲养小鼠数量最多不超过4只。</li>
	<li>始终提供饮水。维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期，并避免在黑暗期进行实验操作。</li>
	<li>由于苜蓿可能干扰荧光信号，饲粮中应不含苜蓿。</li>
	<li>研究或兽医人员需每日评估小鼠状况，以确保实验全程中小鼠的健康与福利。</li>
</ol>
4. 小鼠手术操作
<ol>
	<li>将小鼠置于异氟烷（2%）麻醉舱中约5分钟以诱导麻醉。通过监测呼吸是否保持节律性、频率较清醒时减慢，且对有害刺激（如手术操作、脚趾夹捏）无反应，确认麻醉深度适当。</li>
	<li>将已麻醉的小鼠转移至准备台，使用啮齿类动物专用剪毛器去除从骶部至胸椎上段的毛发。</li>
	<li>使用聚维酮碘溶液和异丙醇交替进行三次清洗，以清洁并消毒皮肤。</li>
	<li>将已麻醉并消毒的小鼠以俯卧位转移至无菌手术床，通过鼻罩持续吸入异氟烷（2%）维持麻醉状态。</li>
	<li>最大程度屈曲髋关节，并通过膝关节在脊柱上的对应位置确定腰椎第4节（L4）椎体的大致位置。</li>
	<li>使用15号手术刀片沿纵轴做2 cm长的皮肤切口。</li>
	<li>触诊棘突以确认中线位置，并将切口逐层分离至骨面。</li>
	<li>在L4棘突右侧沿骨膜下进行解剖，向外侧延伸至横突。</li>
	<li>使用5-0可吸收编织缝线，在L4椎体头侧和尾侧穿过筋膜，暂不打结，留作后续关闭切口之用。</li>
	<li>使用25 G脊髓穿刺针对L4棘突进行扩孔，并沿椎板植入一根直径0.1 mm、长1 cm的“L形”外科级不锈钢植入物，长臂朝向头侧。</li>
	<li>将1 × 103 CFU/2 µL的生物发光金黄色葡萄球菌（S. aureus Xen36）接种于植入物表面，注意确保溶液完全接触植入物。</li>
	<li>接种后等待约10秒，再结扎先前预留的可吸收缝线，以确保接种物被完全包裹在植入物周围。</li>
	<li>使用可吸收缝线连续缝合皮肤切口。</li>
	<li>术后立即皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）镇痛，并在之后每12小时给药一次，持续3天。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上恢复，并监测其是否恢复正常活动。</li>
	<li>术后获取X线影像，以确认植入物位置正确。</li>
</ol>
5. 利用活体纵向生物发光成像测量细菌负荷
<ol>
	<li>使用吸入式异氟烷（2%）对小鼠进行麻醉。通过监测呼吸频率是否保持节律性且比清醒时更缓慢，并且对有害刺激（例如手术操作、脚趾夹捏）无反应，来确认麻醉深度适当。</li>
	<li>使用啮齿类动物专用剪毛器去除从骶部至胸椎上段的毛发。</li>
	<li>将小鼠放置于生物发光成像平台的视野范围内，进行活体生物发光成像（BLI）19。</li>
	<li>以5分钟的采集时间捕获生物发光信号。采用大 binning 设置，视野为15 cm（B）。</li>
	<li>在术后第0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28和35天（或根据具体实验设计选择其他时间点）重复步骤5.1–5.4，以监测细菌负荷。</li>
	<li>通过颜色标尺显示BLI数据，并将其叠加于灰度照片上。使用BLI软件划定标准的椭圆形感兴趣区域（ROI），以定量分析总荧光通量（每秒光子数）或平均最大通量（每秒每平方厘米每球面度光子数/秒/厘米2/球面度）。</li>
</ol>
6. 定量分析黏附于植入物及周围组织的细菌
<ol>
	<li>根据 AVMA 指南，通过暴露于二氧化碳处死小鼠，处死时间为术后第 35 天或选定的其他术后时间点。通过二次颈椎脱位确认小鼠死亡。</li>
	<li>按照第 4.3 步对背部皮肤进行消毒，并将小鼠俯卧位放置于无菌手术区域。</li>
	<li>使用 15 号手术刀片锐性切开先前的切口。</li>
	<li>使用无菌剪刀钝性分离至 L4 棘突，并识别手术植入物。</li>
	<li>使用持针器轻轻旋转并从 L4 棘突位置取出植入物。</li>
	<li>使用无菌镊子和剪刀，采集约 0.1 g 植入物周围紧邻的棘突骨组织及软组织，置于含 4 颗尖锐匀浆珠的小锥形犀牛管中，加入 1 mL PBS。</li>
	<li>通过称量采集前后锥形管的重量，记录软组织重量。</li>
	<li>将植入物放入含 0.5 mL 含 0.3% Tween-80 的 TSB 溶液中，超声处理 15 分钟。</li>
	<li>将所得的植入物悬液涡旋振荡 2 分钟，并在 12–16 小时内过夜培养。</li>
	<li>使用匀浆器对先前置于植入物周围 1 mL PBS 中的软组织和棘突进行匀浆处理。</li>
	<li>将所得的软组织悬液涡旋振荡 5 分钟，并在 12–16 小时内过夜培养。</li>
	<li>过夜培养后，分别计数来自植入物及周围组织的菌落形成单位（CFU）。软组织结果以每克采集组织的总 CFU 数（CFU/g）表示，超声处理后的植入物结果以 CFU/mL 表示。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

脊柱植入物相关感染对患者预后不利1,2,3,4,5。与身体其他许多部位不同，由于存在不稳和神经功能受损的风险，脊柱内的感染性植入物通常无法移除。在这种生物膜细菌对全身抗生素治疗耐药的情况下，这一独特挑战 necessitates 治疗方法的创新12。既往针对脊柱植入物感染（SII）新型治疗方法的研究受限于成本高昂且效率低下的动物模型。为了更有效地研究此类感染并评估潜在治疗方案的疗效，我们建立了一种非侵入性、纵向观察的小鼠SII模型，并结合活体生物发光成像技术进行监测。
以往用于研究器械相关脊柱感染的动物模型需要通过离体组织分析来评估结果，因此需要较大的动物群组，且无法对感染过程进行长期动态监测<sup class...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60560">In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection</a>. The Authors section was updated from:
Benjamin V. Kelley1 
Stephen D. Zoller1 
Danielle Greig1 
Kellyn Hori1 
Nicolas Cevallos1 
Chad Ishmael1 
Peter Hsiue1 
Rishi Trikha1 
Troy Sekimura2 
Thomas Olson2 
Ameen Chaudry2 
Michael M. Le2 
Anthony A. Scaduto1 
Kevin P. Francis1 
Nicholas M. Bernthal1 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles 
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
to:
Benjamin V. Kelley1 
Christopher Hamad1 
Stephen D. Zoller1 
Danielle Greig1 
Zeinab Mamouei1 
Rene Chun1 
Kellyn Hori1 
Nicolas Cevallos1 
Chad Ishmael1 
Peter Hsiue1 
Rishi Trikha1 
Troy Sekimura2 
Brandon Gettleman3 
Autreen Golzar2 
Adrian Lin2 
Thomas Olson2 
Ameen Chaudry2 
Michael M. Le2 
Anthony A. Scaduto1 
Kevin P. Francis1 
Nicholas M. Bernthal1 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles 
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles 
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60560">In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection</a>. The Authors section was updated.

Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

本方法旨在描述一种新型的小鼠脊柱植入物感染（SII）模型。该模型设计用于提供一种经济且准确的工具，以灵活评估宿主、病原体和/或植入物变量在体内的影响。在此模型中测试潜在的治疗方法和治疗策略，旨在为后续在大型动物模型和临床试验中的应用提供研究方向。
脊柱手术后与植入物相关的感染是一种严重的并发症，不幸的是，在接受择期脊柱手术的患者中，其发生率约为3–8%1,2,3,4,5，而在接受多节段或翻修手术的患者中可高达65%6。脊柱植入物感染的治疗通常需要多次住院、多次手术以及长期抗生素治疗。脊柱植入物感染（SII）会导致患者预后不良，包括神经功能受损、残疾以及死亡风险增加。SII的管理费用极为昂贵，每位患者的治疗成本可超过90万美元7。
Staphylococcus aureus 是 SII 最常见的致病性病原体8,9,10,11。细菌可在手术期间直接定植于植入物上，或在术后通过伤口进入，亦可通过血行播散在后期感染。当存在金属植入物时，S. aureus 会形成生物膜，从而保护细菌免受抗生素治疗和免疫细胞的清除。尽管移除感染的植入物可能有助于有效根除感染，但在脊柱部位，这种操作往往不可行，因其可能导致脊柱不稳定并增加神经功能受损的风险12。
在无法移除感染性植入物的情况下，需要采用新的方法来预防、检测和治疗 SII。传统上，用于高效评估新型疗法安全性和有效性的 SII 动物模型十分有限。既往的 SII 动物模型需要使用大量动物，并且获取数据点需实施安乐死，包括菌落计数、组织学检查和培养13,14,15。由于缺乏纵向的活体监测，这些模型每只动物仅能提供一个数据点，因此成本高昂且效率低下。
既往研究利用小鼠膝关节置换术感染模型，证实了非侵入性活体光学成像在纵向监测感染负荷方面的价值与准确性16。通过检测生物发光信号，可在单只动物体内以人道、准确且高效的方式，对细菌负荷进行长期动态量化。此外，已有研究证明，活体生物发光信号与附着于植入物上的菌落形成单位（CFUs）之间具有高度相关性17。这种对感染过程的时序追踪能力，加深了人们对植入物相关感染机制的深入理解。同时，通过此类方法进行感染的纵向监测，也有助于准确评估抗生素治疗及新型抗菌药物的疗效16,17,18。
利用这些工具，我们开发并验证了一种术后脊柱植入物感染的模型。在本方法中，我们采用生物发光的S. aureus Xen36菌液建立体内小鼠脊柱植入物感染（SII）模型，以对细菌负荷进行长期动态监测16,17,18。该新型模型为在开展大动物模型研究和临床试验之前，高效评估SII的潜在检测、预防和治疗策略提供了有力工具。

<table><tbody><tr><td>分析天平 ME104</td><td>Mettler Toledo</td><td>30029067</td><td>120 g 量程，0.1 mg 可读性，背光 LCD 显示屏，内置校准功能，金属底座</td></tr><tr><td>BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD 211825</td><td>BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤（大豆-酪蛋白消化物培养基）</td></tr><tr><td>Biomate 3S 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208300</td><td>分光光度计；Thermo Scientific；BioMate 3S；六位比色皿架；光谱带宽：1.8 nm；长寿命氙灯；可存储多达 40 种检测方法；尺寸：16 英寸长 × 13 英寸宽 × 9 英寸高；重量：19 磅；100/240 V 美标电源线</td></tr><tr><td>Bioshield 720+ 摆桶式转子</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003183</td><td>转子，摆桶式；Thermo Scientific；BIOShield 720 高速转子；容量：4 × 180 mL（0.72 L）；角度：90 度；最高转速/相对离心力：6300 rpm/7188 × g；最大半径：16.2 cm</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 2510R-MTH（超声破碎仪）</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>CPX952217R</td><td>*类似型号，原型号已停产* Branson Ultrasonics MH 系列加热型超声波清洗槽，120 V，0.75 加仑</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm 匀浆器</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M</td><td>Bullet Blender Storm 是 Bullet Blender 系列中最强大的型号。仅需几分钟即可均质化多达 24 个最难处理的样品（如小鼠股骨、皮肤、软骨、肿瘤等）。Air cooling&amp;trade; 技术可最大程度减少样品升温。可使用 1.5 ml 螺口 RINO&amp;reg; 管或 snap-cap Eppendorf&amp;reg; Safe-lock&amp;trade; 管。</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>66118-10</td><td>Germinator 500 专为金属显微解剖器械的去污染而设计。仅可用于&lt;br/&gt; 研究目的。Germinator 500 不应作为终端灭菌传统方法的替代品。&lt;br/&gt; 由于缺乏对玻璃珠灭菌效果进行常规监测的方法，无法保证有效灭菌。&lt;br/&gt; Germinator 500 的设计和制造符合《美国药典》第二十三版第 1211 部分“干式灭菌器孢子悬液试验验证”标准。&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Heracell 150i CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026282</td><td>单层 150 L</td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5 成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS148590</td><td>IVIS Lumina X5 高通量二维光学成像系统将高灵敏度生物发光与荧光检测以及高分辨率 X 射线成像集成于紧凑型台式设备中。其二维光学成像视野可容纳最多 5 只小鼠，并配备一系列独特附件以加快实验设置和标记流程，使获取疾病解剖学与分子层面的可靠数据&amp;mdash;以及答案&amp;mdash;变得前所未有的简便快捷。</td></tr><tr><td>MAXQ 4450 数字恒温培养摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4450</td><td>摇床，恒温型；Thermo Scientific；数字控制；MAXQ 4450；转速范围 15 至 500 rpm（±1 rpm）；温度范围为环境温度以上 5 °C 至 80 °C；120 V，50/60 Hz</td></tr><tr><td>PBS，磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP24384</td><td>PBS，磷酸盐缓冲液，1× 溶液，pH 7.4</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21 通风型离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td>24 × 1.5/2.0 mL 转子，配备 ClickSeal 生物防护盖</td></tr><tr><td>SORVALL LEGEND X1R 120V 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004261</td><td>离心机，台式；Thermo Scientific；Sorvall Legend X1R（制冷型），1 L 容量；最高转速/相对离心力 15,200 rpm/25,830 × g；无氟制冷，温度范围 -10 °C 至 +40 °C；120 V，60 Hz</td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌 - Xen36</td><td>Perkin Elmer</td><td>119243</td><td>金黄色葡萄球菌 - Xen36，一种用于体内和体外药物发现的生物发光致病菌株。本产品源自美国典型培养物保藏中心（ATCC）的亲本菌株，经许可使用。Staph. aureus-Xen36 在其天然质粒上稳定携带 Photorhabdus luminescens 的 lux 操纵子拷贝。</td></tr><tr><td>TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V 高压灭菌器</td><td>Heidolph Tuttnauer</td><td>23210401</td><td>灭菌器，台式；Heidolph；Tuttnauer；型号 2540E；自带可再填充水箱，控制灭菌用水纯度；120 V，50/60 Hz；1400 W，配备电子控制系统</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP338-500</td><td>Tween 80，Fisher BioReagents，用于选择性蛋白提取的非离子型去垢剂</td></tr><tr><td>涡旋混合器 VX-200</td><td>Labnet Internation</td><td>S0200</td><td>120 V 触控或连续混合模式，230 V：0 - 2,850 rpm，120 V：0 - 3,400 rpm</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Pfizer Injectables/Hospira</td><td>00409-4888-10</td><td>0.9% 氯化钠注射液，USP 标准</td></tr></tbody></table>

体内小鼠脊柱植入物感染模型

In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

脊柱植入物感染的预后较差，因为诊断困难，且手术清除感染与维持脊柱机械稳定性之间存在矛盾。本方法旨在描述一种新型的小鼠脊柱植入物感染（SII）模型，该模型的建立旨在提供一种经济、快速且准确的体内工具，用于评估针对脊柱植入物感染的潜在治疗药物和治疗策略。
本方法介绍了一种后路脊柱手术模型，将不锈钢克氏针穿入12周龄C57BL/6J野生型小鼠的L4棘突，并接种1 × 103 CFU的生物发光金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Xen36）菌株。术后第0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28和35天对小鼠进行纵向活体生物发光成像。通过定量标准化视野内的生物发光成像（BLI）信号，以评估活体内细菌负荷量。
为了定量分析黏附在植入物及周围组织中的细菌，需将小鼠实施安乐死，并采集其植入物及周围的软组织。通过超声处理将细菌从植入物上分离，随后进行过夜培养，然后计数菌落形成单位（CFU）。该方法获得的结果包括通过活体金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物发光（平均最大荧光通量）测定的纵向细菌计数，以及安乐死后获得的CFU计数。
尽管以往的脊柱内固定感染动物模型依赖于侵入性、离体的组织分析方法，本文介绍的小鼠脊柱内固定感染（SII）模型则采用非侵入性、实时的活体光学成像技术，通过检测生物发光细菌来替代静态的组织学研究。该模型的应用范围广泛，可包括使用其他类型的生物发光细菌菌株、结合其他基因工程小鼠以同时研究宿主免疫反应，以及评估现有或探索新的诊断和治疗手段，如抗生素或植入物表面涂层。

本文所述方法用于评估抗生素治疗方案在小鼠体内SII模型中的疗效。具体而言，比较了联合使用万古霉素和利福平的抗生素治疗方案与单独使用万古霉素治疗及未经治疗的感染对照组的疗效。
手术前，将小鼠随机分配至联合治疗组、单药治疗组或感染对照组。通过统计功效分析计算样本量。根据预期的平均最大荧光值分别为 1 × 105 ± 3.2 × 104 和 1.4 × 105 来确定样本量，计算得出每组样本量 N=10。小鼠接受手术植入，并接种 S. aureus Xen36，于术后第 0、1、3、5、7、10、14、18、21、25、28 和 35 天检测体内 S. aureus 的生物发光信号。术后第 35 天处死小鼠，定量检测植入物附着细菌及周围组织的菌落形成单位（CFU）。
单药治疗组的小鼠皮下注射万古霉素（110 mg/kg，每日两次）的治疗剂量。该剂量的选择旨在模拟万古霉素在人体内典型的药物暴露曲线下面积<sup class="xref...

该方案描述了一种新型的体内小鼠脊柱植入物感染模型，其中不锈钢克氏针植入物被生物发光的Staphylococcus aureus Xen36感染。通过生物发光成像对细菌负荷进行纵向监测，并在安乐死后通过菌落形成单位计数加以验证。

脊柱植入物感染预后不良，因其诊断困难，且手术清除感染与维持脊柱机械稳定性之间存在矛盾。

术后感染是脊柱手术的一种严重并发症。该脊柱植入物感染小鼠模型可使研究人员研究宿主、植入物及治疗因素对感染的影响。该技术能够人道且高效地在活体内定量检测细菌负荷的实时纵向变化。使用金黄色葡萄球菌（S.aureus）zen 36 的冻存菌种，在含有每毫升200微克卡那霉素的LB琼脂平板上划线接种，并于37摄氏度培养12至16小时。培养结束后，挑取S.aureus zen 36培养物中的单个菌落，分别接种于含有每毫升200微克卡那霉素的胰蛋白胨大豆肉汤中，在37摄氏度、200转/分钟条件下培养12至16小时。次日，将菌液按1:50的比例接种至新鲜肉汤中，继续培养2小时，以获得处于对数生长中期的细菌用于后续实验。孵育结束后，通过离心收集细菌细胞，并用一毫升新鲜 PBS 洗涤细胞三次，每次洗涤使用一毫升 PBS。最后一次洗涤后，测定 600 纳米处的吸光度。理想的光密度值为 0.750。然后，将细菌重新悬浮于浓度为每2微升磷酸盐缓冲液（PBS）含1×10³个菌落形成单位的溶液中。使用剪毛器去除12周龄雄性C-57黑六小鼠骶部及上胸椎区域的毛发。在皮肤准备前立即通过皮下注射给予镇痛药物，并于三天后重复给药。使用三次交替的碘伏和酒精棉球对术区进行消毒。第三次擦拭后，将小鼠置于无菌手术床上呈俯卧位，并最大程度屈曲髋关节。在切开之前，确认小鼠对脚趾夹捏无反应。触摸髂嵴，定位至约腰椎第四椎体水平，使用15号手术刀片做一纵向、长约2厘米的皮肤切口。触摸棘突以确认中线位置，并将切口沿中线向下延伸至骨面。在L-4棘突右侧沿骨膜下进行分离，向外侧延伸至横突，将一根5.0号可吸收编织缝线经筋膜分别穿过L-4椎体头侧和尾侧并打结固定。使用25号脊髓穿刺针对L-4棘突进行扩髓，沿椎板植入一根直径0.1毫米、长1厘米的L形外科级不锈钢植入物，长臂朝向头侧。将1 × 10³ 菌落形成单位/2 µL的生物发光金黄色葡萄球菌S.aureus zen 36接种于植入物上，注意确保所有溶液均与植入物接触。立即打结固定缝线，以确保接种物被限制在植入物周围，并使用第二根可吸收缝线连续缝合皮肤。将小鼠置于带有监测功能的加热垫上，直至完全恢复。术后获取X光片，以确认植入物位置适当。为测定细菌负荷量，在感染后的指定日期，使用电推剪去除从骶骨至胸椎上段重新生长的毛发，并将小鼠放置于生物发光成像平台。使用13厘米视野的大视野弯曲设置，采集生物发光信号5分钟。然后，利用生物发光成像软件圈定一个标准的卵圆形感兴趣区域，以定量分析生物发光的平均总通量和最大总通量。在适当的实验终点，按照前述手术方法准备小鼠后，使用15号手术刀片沿原切口锐性切开，并用无菌剪刀钝性分离至L-4棘突。当能够识别植入物时，使用持针器轻轻旋转并取出植入物，并用无菌镊子和剪刀采集约一克棘突骨及手术植入物周围软组织。将组织置于含有四个尖锐匀浆珠的预称重小

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