Name: 通过在空气-液体界面中暴露培养的人类肺细胞，评估空气中颗粒的急性吸入毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 了解利用气液界面培养人肺细胞评估空气中颗粒物急性吸入毒性的体外暴露系统。该方法通过径向气溶胶分布实现均匀暴露，为毒理学研究提供可靠的预测模型并减少动物实验。

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本工作由德国联邦教育和研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung，BMBF，德国（资助号 031A581，子项目 A-D））和德国研究基金会（Deutsche Forschungsgesellschaft，DFG，研究培训组 GRK 2338）资助。

注意：一次暴露实验的方案涵盖三天时间。
第1天
1. 细胞的常规准备与培养
注意：本实验使用人肺腺癌上皮细胞系 A549 进行暴露实验。细胞操作必须在无菌条件下进行。其他适合在气液界面（ALI）培养的细胞系也可使用。
<ol>
	<li>配制培养基（含10%胎牛血清（FBS）和5 µg/mL庆大霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM））和暴露用培养基（含5 µg/mL庆大霉素、终浓度为100 mM HEPES的DMEM）。</li>
	<li>在37 °C、含5% CO2的湿润环境中，用生长培养基培养A549细胞。</li>
	<li>在75 cm2（T-75）细胞培养瓶中加入14 mL生长培养基，将细胞培养至融合度达80–90%后进行传代（每2–3天一次），传代次数不超过35代。</li>
	<li>计算细胞悬液体积以及所需细胞培养插件数量（包括三个作为培养箱对照的插件、用于洁净空气和颗粒物暴露的插件）和细胞培养板数量。</li>
	<li>在消化和接种细胞前，向6孔板的每孔中加入2.5 mL预温的生长培养基。小心地将无细胞的细胞培养插件放入各孔中，并向每个插件中加入1 mL生长培养基。将6孔板置于培养箱中（37 °C，5% CO2）孵育至少30分钟。</li>
</ol>
2. 细胞的胰蛋白酶消化
<ol>
	<li>将磷酸盐缓冲液（PBS）和培养基置于37 °C预热，胰蛋白酶/EDTA（0.05%/0.02%）溶液置于室温。</li>
	<li>吸除细胞培养瓶中的培养液，用8 mL预热的PBS轻轻洗涤细胞。</li>
	<li>移除PBS，向细胞中加入2 mL胰蛋白酶/EDTA（0.05%/0.02%）溶液，在37 °C培养箱中孵育最多6分钟。在显微镜下观察细胞脱落过程。</li>
	<li>加入8 mL预热的培养基以中和胰蛋白酶活性，通过轻轻横向敲击培养瓶使细胞脱落，并通过反复吹打悬浮细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至50 mL离心管中。测定细胞数量，用于后续操作（如细胞接种、传代）。</li>
</ol>
3. 细胞数量的测定
注意：细胞浓度使用细胞计数器或计数板确定。
<ol>
	<li>将100 µL细胞培养悬液加入盛有10 mL等渗溶液的杯子中稀释。缓慢倾斜杯子，不要振荡。</li>
	<li>根据A549细胞的特异性测量参数，测定每毫升活细胞数量及细胞活力。</li>
</ol>
4. 在细胞培养小室的微孔膜上接种细胞
注意：暴露系统配备有特殊适配器，可兼容不同供应商和不同尺寸的商用小室。本暴露实验使用6孔板及相应细胞培养小室。所有操作步骤均需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>在无菌细胞培养条件（层流）下提供预热的培养基。</li>
	<li>制备足够体积的细胞悬液，细胞浓度为 3.0 x 105 个细胞/mL。</li>
	<li>将培养板平衡 30 分钟后，吸除细胞培养插件中的培养基，并在每个细胞培养插件中接种 1 mL 密度为 3.0 x 105 个细胞/mL 的 A549 细胞。通过轻轻摇晃均匀分布细胞悬液。</li>
	<li>将含有细胞悬液的细胞培养插件在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 24 小时。</li>
</ol>
5. 测试物质的压片
注意：测试物质使用完全可控的液压机压制成粉饼。该压机系统可施加最大18 kN的压力，该压力以压机系统当前的油压（单位为bar）显示。未知测试物质的压制条件（压制压力、压制时间）需通过预实验确定并表征。根据物质的压制特性，可采用不同的压制参数和类型的压头。
警告：压片有毒或危险物质时需佩戴防护装备。
<ol>
	<li>通过压片机前侧的时间控制装置设定压制时间。</li>
	<li>打开压缩空气阀处的压缩空气供应。使用压片机前侧的压力调节器或压缩空气供应源上的压缩空气阀，将压缩空气压力调节至约 2 bar（由前侧压力表指示）。拉出抽屉，按下压片按钮，并通过数字压力开关读取压制压力。
	<ol>
		<li>若压力过高或过低，仅需读取压力调节器上的压力值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装样品容器，并确保玻璃圆筒正确居中（补充图 1）。向样品容器中加入少量待测物质。将冲头插入样品容器中，并轻微来回旋转，使粉末在容器内均匀分布。</li>
	<li>将装有冲头的样品容器放入抽屉中，按下压片按钮。压片机的液压活塞将作用于冲头，并在设定的压制时间内对样品施加压力。打开抽屉并取出冲头。</li>
	<li>重复步骤 5.3 和 5.4，直至样品容器至少半满为止。</li>
	<li>完成压制操作后，从抽屉中取出样品容器，并将其倒置以去除松散和沉积的颗粒。</li>
	<li>若当天不再使用样品容器，应用封口膜（parafilm）密封，以防止待测物质干燥或吸湿。</li>
</ol>
第2天
6. 组装暴露系统并连接外周设备
注意：更详细的视图见图3、补充图2和补充图3。请根据制造商的说明组装两个模块和气溶胶发生器。
<ol>
	<li>将暴露系统放置在坚固且平整的表面上，供水端朝前。将质量流量控制器与气溶胶发生器连接，并通过三颈瓶连接至洁净空气暴露模块。</li>
	<li>连接流量控制器与真空泵。将流量控制器的管路与气溶胶导引模块附件上的管路接头相连。将流量控制器另一侧的管路连接至真空泵。确保气流方向从模块经由流量控制器流向真空泵。</li>
	<li>将水浴与加热供水系统连接。供水管路由水浴通向气溶胶导引模块的进水口。将气溶胶导引模块的出水口与采样模块的进水口连接。再由采样模块的出水口连接回水浴，形成闭合循环。</li>
	<li>将气溶胶发生器（包括旋风分离器）放置在靠近暴露模块的位置，并使用大号微孔滤膜连接旋风分离器、暴露模块及洁净空气模块的多余管路，暴露腔室的抽气端则使用小号微孔滤膜（例如一次性滤膜）。旋风分离器作为生成颗粒物环境的储留装置，可截留约大于7 µm的颗粒，而较小的颗粒则被输送至暴露模块。</li>
	<li>使用USB线缆将用于控制气溶胶生成的计算机连接至气溶胶发生器顶部的USB接口，并将电源连接至电源接口。将电源装置的交流电源插头接入电源插座（220–240 V）。</li>
	<li>通过两台泵连接培养基供给与移除管路。也可不使用泵，而手动添加培养基。</li>
</ol>
7. 洁净空气与颗粒物暴露的准备工作
<ol>
	<li>开启真空泵、流量控制器和水浴（37 °C），预热至少30分钟。</li>
	<li>打开压缩空气供应。将质量流量控制器设定为向气溶胶发生器供气的管路提供8 L/min，向三颈瓶供气的管路提供3 L/min。关闭质量流量控制器的标签页。 
	注意：这些数值可能根据测试物质的特性而有所变化。</li>
	<li>通过计算机调节流量控制器，以控制模块流量（1.5 L/min）和腔室抽吸流量（30 mL/min）。</li>
</ol>
8. 径向流动系统的泄漏测试
注意：为了确保模块已正确重新组装，必须在真空条件下对两个模块（暴露模块和洁净空气模块）进行泄漏检查。
<ol>
	<li>从气溶胶导引模块上拆下进气适配器和冷凝液反射器。使用堵头封闭气溶胶导引模块上的三个气溶胶进气孔，并使用盲板封闭采样模块上的培养基供应接口。</li>
	<li>将未安装滤膜的真空管路连接至气溶胶导引模块的管路接头。使用手轮闭合模块，并监测流量控制器的数值。闭合数分钟后，该数值应降至 5 mL/min 以下。</li>
	<li>完成气密性检查后，移除所有堵头和盲板，将进气适配器和冷凝液反射器重新安装至气溶胶导引模块，并连接培养基供给与排出管路。</li>
</ol>
9. 气溶胶生成
<ol>
	<li>启动计算机和软件（补充图4）。通过双击计算机桌面上的气溶胶发生器启动按钮来启动气溶胶发生器软件。此时会弹出一个消息窗口，询问是否重置设置。如果当天首次启动软件，请点击是。将载物台位置和刮刀位置设置为默认值。若要保留载物台位置和刮刀位置的当前值，或载物台未处于起始位置，则点击“否”。</li>
	<li>将一个样品刮刀旋入位于气溶胶发生器顶部中央开口处的管道中。 
	注意：根据压片特性的不同，可使用不同类型样品刮刀。</li>
	<li>如果样品刮刀未处于最低位置，请使用回零模式按钮进行调整。</li>
	<li>将装有压片测试材料的样品容器倒置，套在样品刮刀上。确保样品容器的玻璃部分朝向前方。确认样品容器上的两个孔对准气溶胶发生器顶部的两个定位销。将锁紧板插入样品容器上方的槽口中，并拧紧黑色螺丝。</li>
	<li>将进给速度（0.24 至 20 mm/h）和旋转速度（1 至 800 转/小时）调整至所需设定值。可通过增加或减少进给速度值或载气流速来调节颗粒浓度。</li>
	<li>使用向下箭头按钮将装有样品容器的载物台下压，直至样品刮刀接近压片样品。</li>
	<li>打开质量流量控制器上的压缩空气供应阀，向气溶胶发生器供气，并点击启动按钮开始生成气溶胶。将进给速度设为 15–20 mm/h，以避免过长的等待时间。</li>
	<li>使用小型手电筒（从分级除尘管玻璃管后下方照射）观察细微粉尘云，以监控颗粒生成是否正常。当连续有气溶胶蒸气进入分级除尘管时，将进给速度调回所需设定值，并点击停止按钮。</li>
</ol>
10. 暴露实验
<ol>
	<li>使用预热的暴露培养基启动培养基供应，并在模块打开的情况下填充采样模块，直至覆盖下流管。使用培养基泵或手动添加培养基（每个独立暴露腔室25 mL）。</li>
	<li>将盲细胞培养小室（无细胞的插入小室）插入暴露模块中。启动泵使暴露培养基流下，直至下流管被培养基覆盖，并确保插入小室的底面与培养基接触。</li>
	<li>启动气溶胶发生器，关闭暴露模块，并将暴露模块连接至气溶胶发生器的暴露模块出口。在开始暴露实验前，给予气溶胶发生器至少20–30分钟的预运行时间，以确保颗粒生成稳定。</li>
	<li>在预运行期间，准备用于孵育对照组和暴露后细胞培养小室的后孵育板。每孔加入1.5 mL生长培养基，并将板置于培养箱中孵育（37 °C，5% CO2）。</li>
	<li>预运行结束后，用橡胶塞密封分级除尘器（Elutriator）的暴露模块出口，并取出盲插入小室。重新补充暴露培养基（通过泵或手动添加），直至下流管被培养基覆盖。此时，打开质量流量控制器的阀门，向洁净空气模块供应压缩空气（3 L/min）。</li>
	<li>使用镊子从6孔板中取出细胞培养小室。小心倾倒出细胞培养小室中的生长培养基，通过倾斜小室将液体倒出，并用移液器吸除并弃去残留液体。将小室分别放入两个模块的暴露腔室中，即暴露模块和洁净空气模块。</li>
	<li>关闭两个模块，并通过将暴露模块连接至气溶胶发生器的暴露模块出口、同时将洁净空气模块连接至载气供应端，启动暴露实验。 
	注意：可通过调节Feed值、载气流速或暴露时间来调整颗粒浓度。</li>
	<li>实验结束后，断开暴露模块和洁净空气模块的连接，并密封暴露模块出口。</li>
	<li>点击Stop按钮，关闭压缩空气供应和气溶胶发生器。</li>
	<li>打开暴露模块和洁净空气模块，使用镊子将细胞培养小室转移至预先准备好的后孵育板中。将6孔板在气液界面（ALI）条件下孵育24小时（37 °C，5% CO2）。 
	注意：若计划进行更多暴露实验，请重复步骤10.5–10.10。</li>
	<li>将用作孵育对照的细胞培养小室提升至气液界面（ALI），其条件与暴露组细胞培养小室相同，并在ALI条件下孵育24小时（37 °C，5% CO2）。</li>
	<li>使用Homing Mode按钮取出试剂容器。点击右上角的X关闭气溶胶发生器软件，并关闭计算机。</li>
	<li>完成所有暴露实验后，清洁气溶胶发生器及两个暴露模块。若测试物质将在接下来几天内继续使用，请用Parafilm封住试剂容器。</li>
</ol>
第3天
11. 细胞活力
注意：在颗粒沉积后24小时，通过WST-1检测法测定线粒体活性以评估细胞活力。该检测按照试剂盒生产商的说明书进行。也可使用其他细胞活力检测方法（如XTT法）测定细胞活力。
<ol>
	<li>将培养基在 37 °C 下预热，并避光融化 WST-1 溶液。准备适量新的 6 孔板，每孔加入 2.5 mL 培养基，将板放入培养箱中孵育。</li>
	<li>用培养基将 WST-1 溶液按 1:7 的比例稀释，制备足够量的 WST-1 稀释液。</li>
	<li>在暴露处理 24 小时后，将细胞培养小室插入新准备的 6 孔板中。向每个细胞培养小室中加入 1 mL 新鲜配制的 WST-1 溶液。轻轻摇动 6 孔板，使溶液在细胞表面均匀分布。将含细胞培养小室的 6 孔板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>从每个 6 孔板中取上清液 100 µL，每样本设三个复孔，转移至 96 孔板中。使用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度，参考波长为 650 nm。</li>
</ol>
12. 统计学
<ol>
	<li>将各个培养箱对照组的细胞活力归一化为100%。</li>
	<li>以各个培养箱对照组为基准，表示暴露组细胞的活力。测试物质的细胞毒性与相应的培养箱对照组进行比较，并作为毒性的指标。</li>
</ol>

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</ol>

作者AT、KG、AB、SH、HM、TG、HT和DS无任何利益冲突需要披露。Cultex Technology GmbH公司（曾用名：Cultex Laboratories GmbH）生产本文中所使用的仪器（例如，CULTEX RFS、CULTEX DG）。NM在本研究期间曾为Cultex Laboratories GmbH的雇员。OK目前为Cultex Technology GmbH（曾用名：Cultex Laboratories GmbH）的雇员。该设备的专利PCT/EP2009/007054由Cultex Technology GmbH创始人Ulrich Mohr教授博士（曾用名：Cultex Laboratories GmbH）持有。

近年来，为了获取有关可吸入颗粒物急性吸入危害的信息，并根据3R原则减少和替代动物实验，已开发出多种非动物吸入毒性测试模型25.
在细胞培养模型方面，细胞暴露可在浸没条件下或气液界面（ALI）进行。在浸没条件下暴露细胞可能影响测试物质的理化性质，从而影响其毒性特征12。然而，体外ALI吸入模型比浸没暴露更接近人体实际暴露情况，具有更高的生物学和生理学相似性，因此更适合用于分析空气中颗粒物的急性吸入毒性。CULTEX RFS与其他现有暴露模块相比的重要意义不仅在于其可在ALI条件下进行细胞暴露，还在于能够实现颗粒物高度均匀的分布与沉降。与采用线性气溶胶导引的顺序式暴露模型不同，该暴露方法的模块化设计实现了径向供气，从而使颗粒物在细胞表面的沉降更加均匀17。
成功开展暴露实验最重要的要点是洁净空气对照组的质量必须稳定且一致。必须特别注意确保洁净空气对照组的细胞活力不会随时间推移而下降，并且应...

吸入有毒的空气颗粒物是公共卫生领域的一大关切，已在全球范围内导致多种健康风险，并造成每年数以百万计的死亡1,2。气候变化、持续的工业发展以及对能源、农产品和消费品日益增长的需求，导致近年来肺部疾病不断增加3,4,5,6。了解和评估可吸入物质的急性吸入毒性，是进行危害评估和风险管理的基础，但目前仍缺乏大量此类物质的相关信息7,8。自2006年起，欧盟化学品法规REACH（化学品的注册、评估、授权和限制）要求所有已存在或新上市的产品在投放市场前，必须进行包括吸入途径在内的毒理学表征。因此，REACH强调采用替代方法和非动物测试手段，推动实施&#34;3R&#34;原则（减少、优化和替代动物实验），并使用适当的体外模型9。近年来，已开发出多种有效且非动物的吸入毒性测试模型（例如体外细胞培养、芯片上肺模型、精确切割肺组织切片（PCLS）），用于评估空气颗粒物的急性吸入毒性5,7,10,11。在体外细胞培养模型中，细胞可在浸没条件下或气液界面（ALI）进行暴露（图1）。然而，浸没暴露实验在评估空气化合物（尤其是颗粒物）毒性方面的有效性有限。浸没暴露方法无法模拟人体内的真实情况；覆盖在细胞表面的培养基可能影响测试物质的理化性质，从而改变其毒性特征12,13。ALI体外吸入模型可使细胞直接接触测试物质，避免培养基对测试颗粒的干扰，因此相较于浸没暴露，能更真实地模拟人体暴露情况，具有更高的生理和生物学相似性12,14。
然而，在急性吸入毒理学领域，对于REACH等监管流程，目前仅有动物模型可用，因为尚无足够的体外替代方法得到充分验证并被官方接受14。为此，测试模型必须根据欧洲替代动物试验参考实验室（EURL-ECVAM）关于测试有效性的原则进行验证15。
一项前期预验证研究和一项 recently completed 验证研究成功证明了 CULTEX RFS 暴露系统的应用范围及其可转移性、稳定性和可重复性13。该暴露系统是一种基于体外细胞的暴露系统，凭借其径向气溶胶分布设计以及测试气溶胶以连续气流方式通过细胞表面的机制，可在气液界面（ALI）实现细胞对气体、颗粒物或复杂大气环境（例如香烟烟雾）的均一暴露16。该径向流动系统的基本模块包括进气适配器、具有径向气溶胶分布功能的气溶胶导流模块、采样与插口模块，以及带手轮的锁紧模块（图 2）。生成的颗粒物通过进气适配器和气溶胶导流模块到达细胞，并沉积在细胞培养插入物上，这些插入物位于采样模块中三个呈径向排列的暴露腔室内。气溶胶导流模块和采样模块均可通过连接外部水浴进行加热17。
在这两项研究中，所有暴露实验均使用A549细胞。A549细胞系是一种人类永生化上皮细胞系，其特性已被充分表征，在众多毒理学研究中被用作II型肺泡上皮细胞的体外模型。该细胞具有板层小体，能够产生表面活性物质以及多种与炎症相关的因子18。此外，由于其可分泌黏液，也表现出支气管上皮细胞的特性19。更重要的是，这些细胞可在气液界面（ALI）条件下培养。尽管该细胞系在形成细胞间连接方面存在缺陷，但与原代细胞相比，其培养更为简便、成本更低，且实验结果不受供体差异的影响20。
将A549细胞以每孔3.0 × 105个细胞的密度接种于6孔细胞培养小室（PET膜，表面积4.67 cm2，孔径0.4 mm）中，在浸没条件下培养24小时。随后，在三个独立实验室中，将细胞在气液界面（ALI）暴露于洁净空气以及20种测试物质的三种不同暴露剂量（25、50和100 µg/cm2）。暴露剂量与沉积时间相关，分别经过15、30或60分钟的沉积后，在细胞表面实现25 µg/cm2、50 µg/cm2和100 µg/cm2的恒定颗粒沉积速率。然而，颗粒沉积后并未被洗去，而是保留在细胞表面持续24小时。因此，颗粒的沉积时间分别为15、30和60分钟，但细胞的总暴露时间持续24小时。测试物质的沉积速率根据先前方法在预实验中确定17。
在颗粒物沉积后24小时，通过细胞活力检测评估细胞活力作为毒性的指标。研究特别关注洁净空气对照组的质量、暴露方案的优化与改进、实验室内部及实验室之间的可重复性，以及预测模型（PM）的建立。在三个暴露剂量中的任意一个剂量下，若物质导致细胞活力下降至50%以下（PM 50%）或75%以下（PM 75%），则被认为具有急性吸入危害性。随后将结果与现有的体内实验数据进行比较（依据经合组织试验指南（TG）403或TG 436中至少一项可靠研究21,22），总体一致性达到85%，特异性为83%，敏感性为88%23。
除了细胞活力检测外，还可评估其他终点指标，如细胞因子释放、通过LDH实验检测细胞裂解液或细胞膜完整性，但这些指标在验证研究中并非必需。因此，该暴露系统（例如CULTEX RFS）已被证实可作为评估测试空气中颗粒物急性吸入毒性的定性预测性筛选工具，是一种有前景的动物实验替代方法。建议采用以下方案进行利用该暴露系统开展空气中颗粒物的暴露实验。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养基与耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>FG 0415</td><td>用作生长培养基</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany</td><td>22320</td><td>用作暴露培养基</td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素（10 mg/mL）</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>A 2710</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Th. Geyer, Renningen, Germany</td><td>L 0180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA（0.05%/0.02%）</td><td>Biochrom, Berlin, Germany</td><td>L 2143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY 杯</td><td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td><td>REF 05651794</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板</td><td>Corning, Wiesbaden, Germany</td><td>3516</td><td>6&amp;shy;-孔板</td></tr><tr><td>Corning Transwell 细胞培养小室</td><td>Corning, Wiesbaden, Germany</td><td>3450</td><td>24 mm 小室；6-&amp;shy;孔板；0.4 &amp;micro;m 孔径</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>压缩空气（DIN EN 12021）</td><td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td>2290152</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td>ab155902</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器与设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY 细胞计数仪</td><td>Sch&amp;auml;rfe System GmbH, Reutlingen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环恒温器</td><td>LAUDA, Lauda-K&amp;ouml;nigshofen, Germany</td><td>Ecoline RE 100</td><td></td></tr><tr><td>CULTEX HyP - 液压压片机</td><td>Cultex&amp;reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX 插入套管</td><td>Cultex&amp;reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - 径向流系统 II 型（颗粒暴露模块）</td><td>Cultex&amp;reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - 径向流系统 II 型（洁净空气暴露模块）</td><td>Cultex&amp;reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX 供应系统</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流量控制器 0–30 mL/min（IQ-Flow）</td><td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流量控制器 0–1.5 L/min（EL-Flow）</td><td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤膜（大尺寸）</td><td>Munktell &amp;amp; Filtrak GmbH, Sachsen, Germany</td><td>LP-050</td><td>Munktell 无菌滤膜；颗粒截留效率 &gt; 99.999%</td></tr><tr><td>滤膜（小尺寸）</td><td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany</td><td>9933-05-DQ</td><td>Balston 一次性滤膜</td></tr><tr><td>培养基泵</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td><td>Ismatec IPC 高精度多通道分配器</td><td>数字式蠕动泵</td></tr><tr><td>无限 M200 Pro 多功能酶标仪</td><td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>KNF, Freiburg, Germany</td><td>N86 KT.18</td><td></td></tr><tr><td>V&amp;ouml;gtlin 质量流量控制器 0.2–10 L/min</td><td>TrigasFI GmbH</td><td>V&amp;ouml;gtlin red-y compact 调节器，型号：GCR-C3SA-BA20</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>LAUDA, Lauda-K&amp;ouml;nigshofen, Germany</td><td>Ecoline Staredition RE 104</td><td></td></tr></tbody></table>

在气液界面暴露培养的人肺细胞评估空气颗粒物的急性吸入毒性

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

本文介绍了一种专门设计的模块化体外暴露系统，该系统可实现培养的人肺细胞在气液界面（ALI）对气体、颗粒物或复杂大气环境（如香烟烟雾）的均匀暴露，从而为人体肺泡区域的顶面提供接近生理条件的空气暴露。与采用线性气溶胶导引的顺序暴露模型相比，这种径向流动系统的模块化设计满足了测试大气持续生成与输送至细胞、颗粒物均匀分布与沉降以及大气持续排出的所有要求。该暴露方法主要用于细胞对空气传播颗粒物的暴露，但根据气溶胶生成方法及暴露模块材料的不同，也可适用于液态气溶胶以及高毒性与强反应性气体的暴露。
在最近完成的一项验证研究框架内，该暴露系统已被证实为一种可转移、可重复且具有预测性的筛选方法，可用于定性评估空气颗粒物的急性肺细胞毒性，从而有可能减少或替代通常用于此类毒理学评估的动物实验。

CULTEX RFS 是一种专门设计的模块化体外暴露系统，可实现细胞在气液界面（ALI）的直接且均一的暴露。在之前的一项预验证研究中，已成功证明了该暴露系统的普遍适用性及其可转移性、稳定性和可重复性。在德国联邦教育与研究部资助的一项最新研究项目中，该暴露系统已成功通过验证，并被确立为用于预测受试化合物急性吸入危害的预测模型（PM）。由于在预验证研究中发现洁净空气对照的质量是一个关键参数，因此在验证研究初期实施了多项方案和方法优化（例如更换细胞培养插件、通过将 HEPES 浓度提高至 100 mM 来稳定暴露培养基的 pH 值），从而在所有三个实验室中均获得了高度稳定且可重复的结果，并显著改善了洁净空气对照的细胞活力数据（图4）。随后，在三个独立实验室中，A549 细胞在气液界面（ALI）暴露于 20 种预先选定并编码的测试物质，每种物质设置三个不同的暴露剂量（25、50 和 100 µg/cm2），并将细胞毒性（作为毒性的指标）与相应的培养箱对照进行比较。其中，13 种编码物质进行了三次重复...

我们介绍一种稳定、可转移且具有预测性的体外暴露系统，通过在气液界面（ALI）暴露培养的人肺细胞，用于筛选和监测空气颗粒物的急性肺部细胞毒性。

在此，我们介绍一种专门设计的模块化体外暴露系统，该系统可实现培养的人肺细胞在气液界面（ALI）的均匀暴露……

通过使用该体外暴露系统，在气液界面（ALI）处暴露培养的人肺细胞以筛选空气中颗粒物的急性肺细胞毒性，有助于减少动物实验。该暴露系统的主要优势在于其径向气溶胶分布设计，可实现颗粒物在细胞表面的均匀分布。在接种细胞前，向六孔板的每个孔中加入2.5毫升温育过的生长培养基。将无细胞的细胞培养小室小心放入各孔中，并向每个细胞培养小室加入一毫升培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。细胞经胰酶消化后，取100微升细胞悬液，加入盛有10毫升等渗溶液的容器中进行稀释。缓慢倾斜培养杯，避免振荡。使用细胞计数仪，根据A549细胞的特定测量参数，测定每毫升的活细胞数量及细胞活力。在培养板温度平衡后，吸除细胞培养小室内的培养基，并在每个细胞培养小室内接种1毫升密度为3×10⁵个细胞/毫升的A549细胞。轻轻摇晃使细胞悬液分布均匀，孵育24小时。通过压片机前侧的时间控制器设定加压时间。打开压缩空气阀以接通压缩空气供应。使用压机前侧的压力调节器，将压缩空气压力调节至约两个巴。拉出抽屉，按下“压机”按钮，然后在数字压力开关上读取压制压力。用少量待测物质填充物质容器。将柱塞插入物质容器中，并轻微来回旋转，使容器内的粉末均匀分布。将带有柱塞的物质容器放入抽屉中，按下“压制”按钮。打开抽屉，取出柱塞。一个关键步骤是压紧测试物质，必须将这些物质在容器内特异性压缩成粉饼，以确保颗粒暴露的稳定性。从气溶胶导流模块上取下进气适配器和冷凝液反射器。使用堵头封闭气溶胶导流模块上的三个气溶胶进料孔，并使用假板封闭采样模块上的培养基供应连接口。使用气溶胶导引模块的管路连接器连接真空管路。用手轮关闭模块，并测量流量控制器的数值。关闭数分钟后，数值降至每分钟5毫升以下。启动气溶胶发生器软件。如果样品刮刀未处于最低位置，请按下“回零模式”按钮。将装有压紧测试材料的样品容器倒置在样品刮刀上方。确保物质容器的玻璃面朝前。将锁紧板放入物质容器上方的插槽中，并拧紧黑色螺丝。将进料（Feed）和旋转（Rotation）的数值调整至所需设定值。使用向下箭头将带有物质容器的载玻片下压，直至物质刮刀接近被压紧的物质。轻触质量流量控制器，打开气溶胶发生器的压缩空气供应，并通过点击“开始”按钮启动气溶胶生成。将进料速率设置为每小时15至20毫米，以避免过长的等待时间。通过将小型手电筒置于沉降管玻璃管后下方，观察细微粉尘云，以控制颗粒物的正确生成。启动预热的暴露培养基供给，向采样模块中加入培养基直至覆盖排水管，此时模块应保持开放状态。将盲式细胞培养插件插入暴露模块中，泵入暴露培养基直至排水管被培养基覆盖，并使插件的底面与培养基接触。启动气溶胶发生器，关闭暴露模块，并将暴露模块连接至气溶胶发生器的暴露模块出口。在预运行30分钟后，用橡胶塞密封分离器的暴露模块出口，并移除盲插件。补充暴露介质，直至介质覆盖下降管。使用镊子将细胞培养小室从六孔板中取出。小心倾倒细胞培养小室中的培养基，通过倾斜小室将液体倒出，并用移液器吸除并弃去残留液体。将小室放置于暴露模块和洁净空气模块的暴露室中。关闭模块，通过将暴露模块连接至气溶胶发生器的暴露模块出口，同时将洁净空气模块连接至载气供应端，开始暴露实验。实验完成后，断开暴露模块和洁净空气模块的连接，并密封气溶胶发生器的暴露模块出口。单击“停止”按钮，关闭压缩空气供应和气溶胶发生器。打开暴露和洁净空气模块，使用镊子将细胞培养小室转移至预先准备好的六孔板中。将六孔板以及未暴露的细胞培养小室在37摄氏度、5%二氧化碳条件下于气液界面培养24小时。暴露后24小时，将细胞培养小室插入新准备的六孔板中。向每个细胞培养小室中加入一毫升新鲜配制的WST1溶液。轻轻摇动培养板，使溶液在细胞上均匀分布。将含细胞培养小室的六孔板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育一小时。随后，从每个六孔板中取上清液100微升，设三个重复，转移至96孔板中。使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度，参考波长为650纳米。CULTEX RFS 是一种专门设计的模块化体外暴露系统，可在气液界面处实现细胞对空气颗粒物的直接且均匀的暴露。将细胞暴露于洁净空气中，其细胞活力随时间未出现下降。该暴露系统已成功验证，并建立为预测所测试化合物急性吸入危害的模型。将A549细胞暴露于不同测试物质，这些物质表现出无毒性、中等毒性或强毒性。请严格控制孵育时间、颗粒物生成的前置时间以及颗粒物沉积时间。该暴露方法主要用于细胞的颗粒物暴露，但通过调整气溶胶生成方法，也可扩展应用于液态气溶胶和气体的暴露。该筛选方法可实现对可吸入颗粒物急性吸入毒性的体外定性评估，从而减少通常用于此类毒理学评估的动物实验。请勿忘记，操作有毒测试物质可能具有极高危险性，处理此类化合物时，必须采取预防措施，例如佩戴手套和口罩。

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Research

科研

JoVE Journal

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医学

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