压力处理下细菌生长的多尺度分析

该方法的总体目的是分析压力治疗对单细胞和种群水平细菌细胞的影响。它提供了压力对细菌生长几个方面的影响的全球视野，包括细胞活力、形态和DNA含量。它还允许描述人口恢复的特点。

该方法可用于制药工业筛选新的抗菌分子的活动，并了解其对细菌生存能力和生长的影响。压力诱发治疗效率低下，如剂量和时间依赖性。可能需要运行初步测试，以确定最佳剂量和治疗持续时间之前开始此协议。

此方法的可视化演示允许描绘每个关键步骤的重要细节以及如何正确执行它们。首先，用单一的E.Coli MG1655 HU-PAmCherry接种5毫升的澳门币20分型EZ富量定义介质，并在37摄氏度下生长，并在夜间以每分钟140次旋转的速度摇晃。第二天早上，提取100微升样品，用900微升的介质稀释，以测量600纳米的光学密度。

然后，在含有新鲜介质的试管中稀释培养基，以0.01的OD600纳米。在37摄氏度下孵育接种试管，在140 RPM时摇晃，直到光学密度达到0.2，对应于富介质中的全指数相。然后，对延时显微镜成像、稀释和电镀测定、流式细胞学分析以及显微镜快照成像的培养样品进行等分。

将试管中剩余的 4.4 毫升细胞培养素暴露在特定压力处理中。例如，4.4微升头孢素，每毫升5微克，在37摄氏度时孵育，在140 RPM时摇晃。在新鲜介质的 200 微升培养样品中，准备 10 倍连续稀释，最多 10 至负 7。

通过非常温和的涡旋或反转管子，在每种稀释之间混合。板100微升适当稀释在非选定的LB加糖板和孵化过夜在37摄氏度。第二天，计算菌落的数量，以确定每个培养样本中可行细胞的浓度。

绘制每毫升CFU作为未经治疗和治疗的细胞培养的时间函数。在分光光度计上测量培养的 OD600。在四摄氏度下用新鲜介质稀释培养样品，以获得 OD600 的样品，浓度为 0.06，对应于每微升约 15，000 个细胞。

对于DNA染色，将稀释的细菌样品与每毫升10微克的DNA荧光染料溶液混合，体积为1对1，在黑暗中孵育15分钟。在注射样品之前，通过非常温和的涡流或倒置管混合样品。以每分钟约12万个细胞的流速将样品传递到流量细胞计中。

获得前向散射和侧散射光以及DNA荧光染料/荧光信号，并设置适当的设置。绘制向前散射细胞密度直方图，以表示细胞大小的分布，并绘制DNA荧光染料/荧光信号细胞密度直方图，以表示细胞群体中的DNA含量。首先，在37摄氏度下预热恒温显微镜室，以稳定温度。

准备手稿中描述的加糖安装幻灯片。将幻灯片放在显微镜舞台上，使用具有面部对比度目标的透射光和以 560 纳米的光源激发进行图像采集。选择包含隔离单元格的视图字段，以便于在图像分析期间实现自动细胞检测。

确保至少对 300 个单元格进行成像，以便对细胞总体进行可靠的统计分析。首先，从微流体板中去除保护溶液，代之以微流体软件用户指南中描述的新鲜预热至37摄氏度的中热。将微流体板连接到歧管系统。

在微流体软件中，单击密封按钮将板密封到歧管系统。之后，单击"启动"按钮。将微流体板与歧管系统放在显微镜台，在37摄氏度下预热两小时，以避免微流体室膨胀。

单击"密封关闭"按钮，密封微流体系统上的微流体板。用 150 微升培养样品替换井 8 中的介质，用或不用带压力的试剂将井 1 到 5 的介质替换为所需的介质。密封微流体板并放在显微镜舞台上。

在微流体软件中，运行细胞加载过程。在透光下观察显微镜，检查细胞的加载是否令人满意。在透光模式下小心聚焦，并选择几个显示分离细菌且不过度拥挤的视点，每 100 平方微升大约 10 到 20 个细胞。

在微流体软件中，单击"运行自定义序列"按钮，然后在两个 PSI 的 10 分钟内对压力诱导介质进行编程，然后在压力治疗的通缉期内在一个 PSI 上进行注射。在延时模式下执行显微镜成像，每 10 分钟一帧，使用透射光的相位对比度和 560 纳米的激发光源（如果需要）用于 mCherry 信号。同时启动显微图像采集和微流体注射方案。

打开斐济软件和微生物J插件。对于快照分析，请将与一个显微镜对应的所有图像放入 MicrobeJ 加载栏中，以串联图像并保存获得的图像堆栈文件。对于延时数据，只需将图像堆栈放入 MicrobeJ 的加载栏中。

基于相位对比图像的分割运行细胞轮廓的自动检测，基于染色DNA荧光信号的分割运行核素的检测。目视检查细胞检测的准确性，并根据需要使用 MicrobeJ 编辑工具进行校正。保存获得的结果文件。

单击"结果J"图标以完成分析并获取 ResultJ 窗口。生成许多不同类型的输出图形。绘制细胞形状或长度的规范化直方图，每个细胞的均核数。

这项研究分析了大肠杆菌K-12细胞在暂时接触头孢素（一种特别抑制细胞分裂的抗生素）时的行为。在头孢素存在的情况下生长的细胞培养物与无压力培养物一样，有类似的OD600。当头孢菌素存在时，活细胞的浓度没有增加。

当头孢素被移除时，细胞又开始分裂，并在两小时后达到相当于无压力培养物的浓度。不同的应力导致 OD 和 CFU 每毫升曲线的不同脱钩，具体取决于诱导的效果。接触头孢素引起细胞大小和DNA含量的平行增加。

当头孢素被切除时，种群细胞大小和DNA含量逐渐下降，并在两小时后变得类似于无压力人群。头孢素引发形成具有正常细胞宽度的长细胞，然后没有分裂隔膜。定量图像分析证实细胞大小和DNA含量增加。

延时图像证实，细胞伸长和染色体复制和分离不因接触头孢素而抑制。对丝状细胞系的分析表明，细胞分裂在洗掉药物后大约20分钟重新开始。在诱导压力治疗之前，确保细菌数量呈指数级增长，这一点至关重要。

用于这些方法的应激诱导治疗对实验可能有害，如基因毒性化合物。因此，请小心处理化合物，并戴上手套、面罩、护目镜和实验室外套。