Name: טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למד שיטה לטיהור וניתוח מסחטות של Caenorhabditis elegans ושלפוחיות חוץ-תאיות. הפרוטוקול מאפשר איסוף וספירה באמצעות זרימה ציטומטרית לניתוח RNA-SEQ ופרוטאומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים בהכרת ניק טרזפולוס עבור לוחיות התולעים והריאגנטים; המרכז הגנטיקה של caenorhabditis (cgc) במשרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440) עבור הקו N2 נמטודות; לוסיה וויטק, PhD, לסיוע בניתוח המעקב הננו-חלקיק; ג'סיקה יאנג, PhD, ומארי קלייר, MD, PhD, עבור מדיה תאית ממוזגת הנגזרת מפני היפנוסק; וואי פאנג לסיוע עם הדמיה TEM. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק P30AG013280 כדי MK ו NIH גרנט AG054098 כדי JCR.

1. הכנה
<ol><li>הוסף 2 גרם של ג'לטין ל 100 מ ל של dH2O ו חום במיקרוגל עד שהוא מתחיל לרתוח. ואז לערבב ולתת לו להתקרר 20 דקות.</li>
	<li>להעביר את הפתרון באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר ולוותר על צינורות סטריליים. לטפל עצות פיפטה עם ג'לטין מיד לפני השימוש על ידי ליטוף וסילוק הפתרון ג'לטין. טיפים מטופלים יכולים לשמש באופן מיידי או מאוחסן.</li>
	<li>חותכים את הקרום ממסנן כובע סטרילי.</li>
	<li>רטוב 20 ס מ ריבוע של 5 יקרומטר ניילון רשת שינוי בד ומקום סביב החלק העליון של מסנן כובע סטרילי. לאבטח את זה עם כמה רצועות גומי עבות. התראה: בזהירות בדוק את הבד כדי לוודא שאין קמטים. אלו הם מרווחי האוויר שגורמים לשאיבה.</li>
</ol>2. חישוב אוכלוסיות גדולות של תולעים (איור 1א)
<ol><li>מערבולת ופיפטה 10 μL של תולעת ההשעיה על מכסה לוחית הגידול תולעת או מגלשת זכוכית. חזור על תהליך זה 3x. הקלט את מספר החיות בכל טיפה.</li>
	<li>כוונן את השעיית התולעת לשתי בעלי חיים לכל μL.</li>
	<li>מערבולת ההשעיה והפיפטה 9 טיפות (10 μL) על שקופית או מכסה צלחת. לספור באופן ידני את מספר בעלי החיים. הקלט את מספר החיות בכל טיפה.</li>
	<li>חשב את השגיאה הממוצע והתקן של הממוצע (S.E.M.) כאחוז מאוכלוסיית התולעת.</li>
	<li>חשב את המספר הכולל של בעלי חיים בכל אוכלוסייה על-ידי חלוקת הערך הממוצע ב-10 μL ולאחר מכן הכפלת הנפח הכולל של השעיית התולעת ב-μL.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig1.jpg"> איור 1: תצפיות על הליכי יצירה, כימות וטיהור C. אלגיה EVs. (א) סכימטי לספירת אוכלוסיות גדולות של בעלי חיים. (ב) סכימטי ליצירת תולעים לקציר EVs. (ג) סכמטי לטיהור EVs מג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. טיפוח הג לטיהור EV
<ol><li>ליצור אוכלוסייה גדולה של הפיתוח מסונכרנים C. אלגיה. לשם כך, בצע את השלבים שלהלן.<ol>
<li>הוסף בעל חיים בודד בלוח 6 ס מ הצמיחה נורמלי התקשורת. דגירה לשני דורות ולאחר מכן לשטוף את החיות על שתי צלחות גבוהות בינונית הצמיחה.</li>
		<li>דגירה עד התולעים התישה את האוכל.</li>
		<li>מסנן L1 תולעים עם שינוי 5 יקרומטר ניילון מוכן בשלב 1.4. הצב את כובע הברגים על הבקבוק הסטרילי, הפעל את הוואקום ושפוך את התולעים מעל המסנן. העבר את אותו כמות המדיום מעל אגרגטים התולעת במסנן.</li>
		<li>לכמת את התולעים ולחשב את המספר הכולל (ראה שלב 2). מורעב לאחרונה (&lt; 24 שעות) תולעים גדלו על צלחת צמיחה גבוהה התוצאה כ 80,000 הזחלים L1.</li>
		<li>צנטריפוגה L1 הזחלים ב 2,000 x g עבור 3 דקות. resuspend ל ~ 100,000 בעלי חיים לכל mL.</li>
		<li>מקום ~ 50,000 בעלי חיים לכל לוחית צמיחה גבוהה. לטפח את בעלי החיים ב -20 ° c עד שהם מבוגרים גראב (כ 72 h).</li>
		<li>אקונומיקה מבוגרים gravid באמצעים סטנדרטיים ולאפשר לעוברים לבקוע ב 10 מ ל של פתרון בסיס S עם 2.5 μg/mL כולסטרול.</li>
		<li>לכמת L1 הזחלים (ראה שלב 2) ולאחר מכן להוסיף 50,000 תולעים לכל צלחת צמיחה גבוהה.</li>
		<li>מטפחים לוחות ב -20 ° צ' עד שבעלי חיים הם מבוגרים צעירים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>. הכינו את סי-אלגיה לדור הסודי<ol>
<li>לשטוף תולעים מצלחות על ידי הוספת 15 מ ל של M9 סטרילי עם 50 μg/mL carbenicillin לכל צלחת צמיחה גבוהה. תן ללוחות הרוויים לשבת 5 דקות. להוציא תולעים על ידי מקיפים את החוצץ סביב הצלחת. הימנע מלמחוץ. שופכים את המאגר מכל צלחת לתוך צינורית 50 mL נפרדת. חזור על שטיפת שלב 2x יותר עבור סך של 45 mL של מאגר לכל צלחת.</li>
		<li>ניתן לתולעים להתפשר על 15 דקות. Decant הסופרנט ולהוסיף 50 mL של מאגר M9 טרי לצינור. חזור על הסכום הכולל של 4x.</li>
		<li>הגבר את התולעים בחלק העליון של 30% סוכרוז שלב הדרגתי ולשחזר בעלי חיים ב-S בסיס פתרון24.<ol>
<li>בקצרה להשעות את התולעים ב 15 מ ל של קרח קר 100 mM הנאל, להוסיף 15 מ ל של קרח קר 60% סוכרוז, ולהפוך לערבב. עם פיפטה מזכוכית בעדינות שכבה 5 מ ל של קרח קר 100 מ"מ בחלק העליון של תערובת סוכרוז.</li>
			<li>צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 5 דקות. תולעים יהיה מרוכז בממשק בין הנרוג לבין הסוכות.</li>
			<li>בעדינות פיפטה את בעלי החיים מהממשק לתוך צינור 50 mL חדש. הוספת פתרון בסיס של S ל 50 mL. אפשר לתולעים להתיישב 5 דקות.</li>
			<li>Decant סופרנטנט ולהוסיף טרי 50 mL של פתרון בסיס S. חזור על זה לפחות 3 x.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לכמת את מספר התולעים כמתואר בשלב 2.</li>
		<li>להשעות את התולעים לצפיפות של חיה אחת לכל μL עם פתרון בסיס מעוקר S המכיל 2.5 μg/mL של כולסטרול 50 μM של carbenicillin.</li>
		<li>כדי להכין את המדגם לדור הפרשה, להוסיף עד 400 mL של ההשעיה של התחתון סטרילי 2 L מבולבל בקבוקון.</li>
		<li>בקבוקי המקום על המסובבי העגול בחממה 20 ° c ב 100 סל ד עבור 24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EV טיהור
<ol><li>קציר ומשבר<ol>
<li>הסר את בקבוקון 2L של תולעים מן החממה ואת הגלולה בעלי חיים בבקבוקונים 50 mL (500 x g עבור 2 דקות).</li>
		<li>יוצקים את סופרנטנט דרך מסנן ואקום 0.22 יקרומטר כדי להסיר פסולת חלקיקים כלשהם. הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הסופרנט המסונן המכיל את הסוד ואת השלפוחיות הצבע ב-80 ° c.</li>
		<li>לספור את מספר החיות כפי שמתואר בשלב 2.</li>
		<li>לקבוע את הכדאיות של התולעים על ידי הצבת טיפה של תולעים מושעה על מדשאה חיידקית. לחכות 15 דקות ולאחר מכן להבקיע בעלי חיים כמעבר, משותק, או מת.</li>
		<li>לרכז את 0.22 יקרומטר מסוננים supernatant כדי 700 μl באמצעות מחדש ניטרוצלולוזה 10 יחידות מסנן kda. הוסף 150 μL S בסיס הפתרון ולאחר מכן הפיפטה מעל המסנן ומערבולת. חזור על 2x.</li>
		<li>צנטריפוגה את הסופרנטאנט המרוכז ב-18,000 x g במשך 20 דקות ב -4 ° c והעבר את הסופרנטאנט לשפופרת חדשה. שלב זה מסיר את כל הפסולת הפוטנציאלית או חלקיקים גדולים יותר שייתכן שהצטברו במהלך הטיפול.</li>
		<li>הוסף את הקוקטייל המעכב של הפרוטאז + EDTA לכל הוראות היצרן. הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את הסופרנט המרוכז המכיל את הסוד ואת השלפוחית הדעת ב-80 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כרומטוגרפיה של החרגת גודל<ol>
<li>יוצקים 80 – 200 יקרומטר agarose שרף (גודל הנקבוביות מטווח של 70,000 כדי 40,000,000 kda עבור חלבונים כדורית) לתוך מחסנית הכוח הכבידה ריק העמודה. תזרים S בסיס הפתרון עד המיטה שרף הוא ארוז בנפח הסופי של 10 mL. הערה: אם נשפך יותר מדי שרף לתוך מחסנית העמודה, לאחר מכן פזר את החלק העליון של העמודה והסר את העודף באמצעות הפיפטה.</li>
		<li>לעבור 40 מ ל של פתרון בסיס סטרילי מסוננים דרך העמודה ולתת לו לזרום תחת כוח הכבידה. התראה: בדוק כי השרף אינו מופרע.</li>
		<li>הנח למאגר לזרום עד שהחלק העליון של השרף לא יהיה שקוע ולאחר מכן כסה את החלק התחתון של מחסנית העמודה. הצב שפופרת אוסף מתחת לעמודה.</li>
		<li>הסר את המכסה הממוקם על מיכל הדיו. הוסף את הסוד מרוכז שהתקבל בשלב 2.1 הdropwise לחלק העליון של מיטת העמודה. פיפטה 1 מ ל של הפתרון הבזלי של S dropwise. הצב שפופרת אוסף טרייה מתחת לעמודה.</li>
		<li>באיטיות למלא את מאגר העמודות העליון עם פתרון בסיס של 5 mL לא להפריע שרף. לאסוף את 2 mL הראשון של הללויה ואז במהירות לשנות צינורות לאסוף את הבאים 4 mL. זהו השבר המועשר עבור EVs.</li>
		<li>לרכז את להתחמק כדי 300 μL עם מחדש ניטרוצלולוזה 10 משקל מולקולרי kDa לגזור (MWCO) מסנן העברה העברת הצינור נמוך מיקרוצנטריפוגה צינורית.</li>
		<li>לשטוף ממברנה מסנן 2x עם 100 μL של פתרון בסיס S על ידי vortexing עבור 20 S וללטף את המאגר על פני המסנן. הוסף לדוגמה הראשונית עבור נפח סופי של 500 μL.</li>
		<li>הוסף קוקטייל מעכב פרוטאז לכל הוראות היצרן.</li>
		<li>בצע את הניסויים במורד הזרם מיד (RNAseq, LC-MS-ms, GC-ms-ms, מערב, FACS, וכו ') או לאחסן ב-80 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. זרם Cy, כימות של EV שפע
<ol><li>הכנת צבע<ol>
<li>הכן 10 מ"מ מלאי של DI-8-ANEPPS באמצעות DMSO טרי. הפץ ל-10 μL ואחסן ב-20 ° c.</li>
		<li>להכין פתרון 1 מ"מ עבודה על ידי הוספת 90 μL של PBS מסוננים סטרילי לצינור עם 10 μL של מלאי צבע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה לדוגמא ניסויית<ol>
<li>הוסף 840 μL של תמיסת S בסיס לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן להוסיף 60 μL של EVs מטוהרים שנוצר בסעיף 4.2 ומערבולת.</li>
		<li>Aliquot 300 μL של המדגם לשתי צינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים. יש עכשיו קבוצה ניסיונית של שלושה צינורות המכילים 300 μL של מדולל EVs כל אחד. סמן את הצינורות #1-3. כדי לדגימות #2 ו#3 הוסיף 7 μL של מניות DI-8-ANEPPS שהוכנו ב5.1.2. ואז להוסיף 7 μL של 1% טריטון-X 100 לצינור #3. מערבבים כל צינור על ידי vortexing.</li>
		<li>Sonicate לדוגמה #3 על ידי הצבת קצה sonicator באמצע המדגם פועם 10 פעמים ב 20% כוח מחזור העבודה 30%. התראה: ודא שהקצה של הגשוש הsonicator נמצא באמצע המדגם כך שדור קצף יישמר למינימום. קצף עלול לפגוע במדגם על ידי גרימת EVs לצבור.</li>
		<li>הוסף 300 μL של הפתרון בסיס של שני צינורות מיקרוצנטריפוגה. להוסיף 7 μL של DI-8-אנPS עובד מגיב הכין בשלב 5.1 לצינור השני תווית "לצבוע בלבד". סמן את הצינור השני "מאגר בלבד". הערה: הכינו את דגימות הבקרה של צבען בלבד והחוצץ בלבד והדגימות הנסיוניות עם אותו מקור S בסיס.</li>
		<li>הרחק את הדגימות מן האור הישיר ובטמפרטורת החדר עבור 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנהל ניסויי FACS.<ol>
<li>הגדר את המסנן עירור של FACS ל 488 ננומטר (כחול) ומסנן הפליטה ל 605 ננומטר (כתום). הגדר את קצב הזרימה ל-1.5 μL לכל דקה.</li>
		<li>הפעל שילוב כיול של facעובאד (אופציונלי אך מומלץ).</li>
		<li>הפעל כל דוגמה במכונת FACS עבור 3 דקות (180 s). שים לב לשעות הריצה המדויקות בשניות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נתח את נתוני ה-FACS.<ol>
<li>פתח את הקבצים באמצעות תוכנת ניתוח של FACS.</li>
		<li>החלף את ציר Y ל -488-ארגוני (שטח) על-ידי לחיצה על הציר, בחירה מהתפריט הנפתח.</li>
		<li>הגדר שער מלבני החל בחלק העליון של העלילה, הפורש מרמה של 102 עד 104 (&lt; 300 חלקיקים ננומטר בגודל). הארך את השער כלפי מטה עד שהוא מכיל 2.5% מכלל האירועים. נקוב בשמו של השער "די-8-אנפס +".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קוונפיקציה של דגימת שפע EV
	<ol>
<li>העתק שער זה והדבק אותו על שתי הדגימות האחרות בערכת הניסוי שלך וכן על הפקדים ' מאגר בלבד ' ו'צבע בלבד '. יצא את הניתוח לגיליון אלקטרוני.</li>
		<li>אם דגימות ה-FACS לא התרחשו עבור המומלץ 3 דקות (180 s), לנרמל את כל ספירות האירועים במדגם לאירועים לכל 180 s. לדוגמה, אם מדגם הופעל עבור 250 s, מספר האירוע DI-8-ANEPPS + משתנה באמצעות 250 s/180 s.</li>
		<li>הסר את אירועי רקע הצבע על-ידי הפחתה של מספר האירועים DI-8-ANEPPS בפקד צבען בלבד מאלה שב#2 לדוגמה.</li>
		<li>הסר אירועי רקע איזוtype על-ידי הפחתת מספר האירועים של DI-8-ANEPPS + ב#1 לדוגמה.</li>
		<li>הסרת אירועים שאינם תלויי-ניקוי על-ידי הפחתת מספר האירועים של DI-8-ANEPPS ב#3 לדוגמה. ערך זה הוא המספר של EVs בתום התום.</li>
		<li>חשב את מספר EVs ב-1 μL של דגימה על-ידי חלוקת הערך המחושב בשלב 5.5.5 על-ידי אמצעי האחסון שנותח ב-μL (4.5 μL שנותחו כמתואר בשלב 5.3) ומתרבים על-ידי פקטור הדילול (10x כפי שמתואר בשלב 2.5). הכפל ערך זה לפי מספר ה-μL שנותר בהכנה של EV. זהו המספר של EVs זמין עבור ניתוח במורד הזרם.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig2.jpg"> איור 2: סכמטית של זרימה cy, try הכנה לדוגמא לכמת שפע EV. (א) ההכנה EV מחולקת לשלושה דגימות זהות. לדוגמה מס ' 1 הוא הפקד השלילי ללא צבען. DI-8-ANEPPS מתווסף לאחר מכן לדגימות #2 ו#3. טריטון-X 100 לאחר מכן נוסף למדגם #3. החץ הירוק מציין כי רק #3 לדוגמה מsonicated לאחר מכן. הנתונים מתוך הזרימה לעזור לקבוע את המספר המוחלט של כביסה רגיש EVs בדגימות FACS ולאחר מכן לחשב את השפע של EVs בהכנה הכוללת. השער לקביעת אירועים בצבע חיובי מוגדר עם #1 לדוגמה, אשר אינו מכיל צבע. הכתיבה האדומה על נתוני הגיליון האלקטרוני היא להמחיש כי האירועים לצבוע חיובי מן המדגם טיפול בחומרי ניקוי מופחתים מן המדגם עם צבע. (ב) משוואות עבור כימות EVS ב-facs מנותח מדגם וחישוב המספר הכולל של EVs במדגם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Unique+Intercellular+Delivery+Vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles.</a> Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li>
<li>Lakhter, A. J., Sims, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Emerging+Roles+for+Extracellular+Vesicles+in+Diabetes+and+Related+Metabolic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders.</a> Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).</li>
<li>Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extracellular+membrane+vesicles+in+the+pathogenesis+of+various+diseases%2C+including+cancer%2C+renal+diseases%2C+atherosclerosis%2C+and+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+a+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis.</a> Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).</li>
<li>Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exosomes%2Fmicrovesicles+in+the+nervous+system+and+use+in+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies.</a> Frontiers in Physiology. 3, 228(2012).</li>
<li>Duijvesz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+exosomes+leads+to+the+identification+of+novel+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer.</a> PLoS One. 8, 82589(2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+Fetuin-A+identified+by+proteomics%3A+a+novel+urinary+biomarker+for+detecting+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury.</a> Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).</li>
<li>Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+provide+a+protective+and+enriched+source+of+miRNA+for+biomarker+profiling+compared+to+intracellular+and+cell-free+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Michael, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+human+saliva+as+a+source+of+microRNA+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers.</a> Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).</li>
<li>Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P4-ATPase+TAT-5+inhibits+the+budding+of+extracellular+vesicles+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos.</a> Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).</li>
<li>Naik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P4-ATPase+ATP9A+is+a+novel+determinant+of+exosome+release%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release.</a> PLoS One. 14, 0213069(2019).</li>
<li>Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V0-ATPase+mediates+apical+secretion+of+exosomes+containing+Hedgehog-related+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).</li>
<li>Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+Intra-+and+Intercellular+Trafficking+of+Hedgehog+for+Tissue+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning.</a> Journal of Developmental Biology. 4, (2016).</li>
<li>Qi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Derived+from+Human+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Promote+Tumor+Growth+Through+Hedgehog+Signaling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).</li>
<li>Sigg, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+Proteomics+Uncovers+Ancient+Associations+of+Cilia+with+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways.</a> Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+ciliated+sensory+neurons+release+extracellular+vesicles+that+function+in+animal+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication.</a> Current Biology. 24, 519-525 (2014).</li>
<li>Beer, K. B., Wehman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+extracellular+vesicle+release+in+vivo-What+we+can+learn+from+flies+and+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms.</a> Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).</li>
<li>Deatherage, B. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicle+release+in+bacteria%2C+eukaryotes%2C+and+archaea%3A+a+conserved+yet+underappreciated+aspect+of+microbial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life.</a> Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> C. elegans. 2, 51-67 (1999).</li>
<li>Kibria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+automated+surface+protein+profiling+of+single+circulating+exosomes+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood.</a> Scientific Reports. 6, 36502(2016).</li>
<li>Rose, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+of+peripheral+blood+cell+%CE%B2-adrenergic+receptor+density+and+urinary+endothelial+cell-derived+microparticles+in+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension.</a> PLoS One. 11, 0156940(2016).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Fernandez, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence-based+isolation+of+live+C.+elegans+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae.</a> Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).</li>
<li>de Rond, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Generic+Fluorescent+Markers+for+Detection+of+Extracellular+Vesicles+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry.</a> Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).</li>
<li>Russell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+Caenorhabditis+elegans+for+multi-omic+analysis+%5BInternet%5D%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet].</a> bioRxiv. , (2018).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

אתגר בסיסי של השדה EV הוא הפרדת מגוון רחב של EV תת2. השיטות המתוארות כאן להשתמש בסינון, צנטריפוגה דיפרנציאלי, וגודל כרומטוגרפיה הדרה כדי לייצר אוכלוסייה טהורה של EVs קטן מכיוון ~ 100 ננומטר EVs הוכחו בעבר להיות מופרש לתוך הסביבה החיצונית ותפקוד במסלולים הקשורים מבחינה פיזיולוגית תקשורת16. EVs מטוהרים באמצעות גודל כרומטוגרפיה הדרה יכול עדיין להיות תערובת של אקסוזומים ומיקרושלפוחיות קטנות כי אלה מחלקות EV הם בגודל דומה. בעלי חוליות מחלקות EV מופרדים בדרך כלל על ידי immunoprecipitation משום שיטה זו מבודדת EVs באמצעות קשירה סמנים בררני חלבון ממברנה. השיטות שתוארו להקל על זיהוי של C. אלגיה EV ממברנה סמן חלבונים. לכן, בעתיד ניתן יהיה להפריד בנפרד ממחלקות EV קטנות באמצעות שיטות immunoprecipitation מקבילה. בתאוריה, immunoprecipitation יכול לבודד EVs מפני תולעים מוזן היטב כי E. coli EVs לא צריך לקיים אינטראקציה עם הנוגדן. החוקרים מעוניינים לזהות את החלבון ואת מטענים הגנטי של מחלקות EV גדול יותר (> 200 ננומטר) יכול לעשות זאת על ידי דילוג על צעד סינון 0.22 יקרומטר ולאחר מכן ניתוח את הגלולה במקום supernatant. חשיפת החלבון ומטעני המטענים הגנטיים של EVs גדולים תקים הבנה מקיפה יותר של התהליכים הפיזיולוגיים הפועלים באמצעות משפטי ה . בנוסף לעובדה שהוא מופרש לתוך הסביבה, EVs הג מועברים באופן פנימי בין רקמות. לכן, שיטות אלה מבודדים רק קבוצת משנה של סה כ EVs. עם זאת, גילוי מטענים של EVs פנימי אינו אפשרי משום שאין שיטה להפרדת EVs מתולעים ליsed. ניתוח מטענים של הקבוצה הזאת מופרש מבחוץ EV מספק אמצעי לזהות פוטנציאל כללי החלבון EV סמנים מסוגל תיוג פנימי EVs כמו גם.
קנה המידה של ההכנה של EV יהיה תלוי בדרישות של הניסוי. סך של 500,000 מבוגרים צעירים מספק מספיק EVs לניהול הזרימה cy try, LC-MS-MS, ו RNAseq ניתוח במקביל. ניתן לשנות מספר זה למעלה או למטה בהתאם לצרכים הניסיוניים. הגורם המעשי הגדול ביותר לשינוי גודל הוא מספרם של 10 ס"מ לוחות גידול גבוה הנדרש. לוחות צמיחה גבוהה מוכן עם 500 μL של 20x מרוכז לילה NA22 התרבות תתמוך באוכלוסיה של ~ 50,000 מבוגרים משלב הזחל L1 עד היום הראשון של הבגרות. לכן, כדי לבצע ניסוי עם 500,000 מבוגרים, 13 לוחות צמיחה גבוהה נדרשים: צלחת אחת כדי לייצר את האוכלוסייה של L1s, שתי צלחות כדי לייצר את המבוגרים עבור הלבנת, ו 10 צלחות לצמיחת החיות ניסיוני. מדדים אלה מותנה הצמיחה בקטריאלי התנאים הגידול של לוחיות הצמיחה גבוה. לכן, מומלץ להפוך את כל הצלחות באופן מתוקננת ולאחר מכן לכייל עם כמויות ידועות של בעלי חיים.
התולעים נספרות בשני שלבים במהלך תהליך הטיפוח: 1) לפני זריעת תולעים על צלחות ו -2) לפני יצירת המדיה הממוזגת. צפיפות בעלי חיים הוכח להשפיע על התנהגות, פיתוח, ואת התגובות הלחץ15,16,17,18 ואולי, לכן, גם להשפיע EV cargos. לכן, בהתאם לצפיפות הטיפוח העקבית, יש צורך להעריך במדויק את אוכלוסיית התולעים. בדיקת מספר התולעים בתשע טיפות מעניקה ביטחון סטטיסטי לאומדנים על האוכלוסייה. זה חיוני לטפל בכל טיפה בנפרד, והוא בין כל טיפה והכנסת את הצינורות באותו מרחק לתוך השעיית התולעת. נקיטת אמצעי זהירות אלה יבטיחו ערכי S.E.M. של ~ 5 – 10% מכלל האוכלוסיה. אם S.E.M. עבור אוכלוסיית התולעת גבוהה מ-20%, אז משהו השתבש.
לאחר 24 שעות הדגירה הנטולת חיידקים, צעיר, פראי סוג C. אלגיה לזחול מיד בנוסף על מדשאה חיידקית. הדבר מעיד על כך שהדגרה אינה משפיעה באופן חמור על בריאותם. עם זאת, צעד זה משפיע על הפיזיולוגיה של בעלי החיים ולכן עשוי להשפיע על הרכבו של cargos EV. לכן, כאשר עובדים עם גנוטיפים חולים מאוד או בעלי חיים מבוגרים, זה הכרחי לבדוק את הכדאיות לאחר שלב הדגירה. אם כל החיות אינן שורדות את הדגירה, אז להגדיל את גודל האוכלוסייה ניסיוני ולהקטין את זמן הדגירה. בעבודה עם כמויות גדולות של מדיה ממוזגת, זה מעשי יותר להשתמש ברכז התאים מעורבב עם מסנן עשוי מחדש ניטרוצלולוזה. EVs לא לאגד לכימיה מסנן זה בחוזקה כמו סוגי סינון אחרים14.
היחס של החלבון הכולל התאושש מהמדיה הממוזגת למספר בעלי החיים המאבקים כדי להפוך את ההכנה הוא מדד שימושי. אם יחס זה גבוה בהרבה מהצפוי, ייתכן שהערכות האוכלוסייה היו כבוי או שבעלי חיים מתו והתדרדרו באמצעי התקשורת הממוזגים. אם יחס זה נמוך בהרבה מהצפוי, ייתכן שחלבון מסוים אבד על המסננים במהלך תהליך הריכוז. בעוד שיטות FACS יהיה ישירות לכמת את EVs בהכנה, מדד זה הוא שימושי כי זה יכול להדגיש חריגות לדוגמה בשלב מוקדם בתהליך. עוד שיטה שימושית לאימות איכות ההכנה של EV היא שידור אלקטרון מיקרוסקופ, כפי שמוצג באיור 4D. למרות שהפרוטוקול של מיקרוסקופ אלקטרוני שידור אינו נכלל באופן רשמי בסעיף שיטות זה עקב אורך, זה יכול להתבצע על ידי שיטות סטנדרטיות. מומלץ לנהל סוג זה של ניתוח, לפחות בתחילה, כשיטה חינם FACS להערכת איכות ההכנות EV. לקבלת התוצאות הטובות ביותר להשתמש ברשתות formvar משוחררים טרי-פחמן וכתמים את הדגימות עם 2% חומצה phosphotungstic במקום אצטט uranyl.
DI-8-ANEPPS נבחר משום שהוא הוכח ככמת ממברנות EV, מחוץ ביצוע צבעים אחרים EV כללי עם דגימות ביופסיה אנושית ו ליפוזומים25. המדידות מהירות, לקיחת רק 3 דקות של איסוף זמן עבור כל מדגם. הקוונפיקציה של EVs רגיש לניקוי יש משמעות פונקציונלית ישירה כי הוא הפיכת על הבחנה פיזית בסיסית בין EVs ליפופרוטאין מוצק אגרגטים. חשוב מכך, שיטה זו אינה מושפעת כמות החלבון הכולל או מספר של אגרגטים שאינם EV ולכן יכול לכמת EVs שהתקבלו באמצעות שיטות טיהור שונות בצורה לא משוחדת. מטרי ה-EV מאומת המדד אנו מתארים כאן יהיה שימושי במיוחד עבור מחקרים המפגינים השפעות פיזיולוגיות של EVs מטוהרים. זה יכול גם להועיל בשדה EV באופן כללי כדי להקים מתודולוגיה FACS כמדד אוניברסלי, כך מוחלט EV הריקודים המוחלט ניתן להשוות באופן ישיר על פני הלימודים. צבעים חיוניים יכולים גם לתייג את C. אלגיה EVs, אבל הם לא בהירים כמו EVs מתויג עם די-8-anepps.
גישה זו לטיהור מהווה הפיכת הפרשה הפעילה של EVs מחוץ לגופם של תולעים חיות שלמות. זה מתיר C. אלגיה EVs להיות מבודדים בטוהר דומה ושפע כמו מתרבות התא, מפרטים כי הם מספיקים לזיהוי מאות חלבון ו-RNA מטענים באמצעות LC-ms-ms ו rnaseq ניתוח26. כך, הספרייה הגדולה של ריאגנטים זמין עבור מחקר C. אלגיה יכול להיות ממונפת על חקירת ההשפעה של הניתוח הגנטי והפיזיולוגי על הרכב מטענים EV.

הפרשה של ממברנה מאוגד מנשא שלפוחיות (EVs) מקלה על תהליכים פיזיולוגיים גלובליים על ידי פעיל הובלת חלבון ספציפי, חומצות גרעין, מטבוליט, ו מטענים השומנים בין תאים1. תאים מפרישות EVs כי לאורך רצף של גדלים החל 2 יקרומטר או גדול ככל קטן כמו 20 ננומטר2. EVs קטנים (< 200 ננומטר) נלמדים יותר ויותר בשל משתמע מתהליכים פתולוגיים, כולל הפרעות מטבולית, סרטן, מחלות לב וכלי דם, ומחלות ניווניות3,4,5. פתווגיות אלה הוכחו גם להשפיע על חלבון ההרכב הגנטי של EVs מטענים של EVs קטן. לכן, חתימות ביואריקר של הפתולוגיה הם יותר ויותר נחשפים דרך EV מטענים גילוי שיטות כגון LC-ms-ms ו rnaseq6,7,8,9.
ג. אלגיה הייתה מודל חסרי חוליות שימושי לזיהוי מסלולים מסוג EV איתות ששומרו. למשל , כאשר מדובר בדבר הראשון שנראה לראשונה כדי לגרום ל-ev biogenesis בשנת c. אלגיה העוברים, ואת יומן ההומויום האנושי הוכח להשפיע EV שחרור בתאי האדם10,11. ג. אלגיה EVs דווחו לשאת אותות קיפוד הדרושים להתפתחות הקוטיקולה. משלוח של קיפוד ומורגנים אחרים הוכח לשחק תפקיד התפתחותי גדול של EVs, והוא שימור ב zebrafish, עכברים, ובני אדם12,13,14,15. ג. אלגיה מתאימה מאוד לגילוי EV ביוארקר משום שהוא מפריש EVs מחוץ לגופה הפועל בתקשורת חיה-לבעלי חיים16,17 (איור 1א). עם זאת, המתודולוגיה שהוקמה באמצעות מחקר הקודם לא ניתן להשתמש מכיוון מקור המזון E. coli גם מפריש EVs18. בשיטה זו, רוב המדגם מורכב של E. coli זיהום, הגבלת העוצמה של הגישות הפרוטאומית או RNAseq לגילוי של C. אלגיה EV cargos. השיטות המתוארות כאן פותחו כדי להניב מאוד טהור C. אלגיה EVs ברמות שפע אופייני של תרבות התא טיפוסי ניסויים ובכך להקל גישות omics עבור גילוי ביואריקר EV.
אוכלוסיות גדולות של תולעים נדרשות כדי לייצר מספר מספיק של EVs עבור ניתוח מטענים. לכן , כלולים גם שיטות לביצוע טיפוח כמותי של אוכלוסיות גדולות בפיתוח מבחינה כמותית. בדרך כלל, כאשר מספר גדול של תולעים נחוצים עבור ניסויים, הם מתורבתים במדיה נוזלית. בעוד זה יעיל ליצירת אוכלוסיות גדולות של תולעים, הפיזיולוגיה של בעלי חיים שונה באופן משמעותי מתולעים מעובדות בתנאים סטנדרטיים על הצמיחה נמטודות בינונית (ngm) אגר צלחות. בעלי חיים שאינם מתורבתים בנוזל גדלים לאט יותר, הם דקים יותר, מציגים טרוגניות התפתחותיים, וחשופים לרמה גבוהה של השתנות אצווה. לכן, אנו מציגים אמצעי פשוט אך יעיל לטיפוח כמותי של אוכלוסיות גדולות של מסונכרן מבחינה נפשית באמצעות לוחיות גידול גבוהות של 10 ס מ. הרכב המדיה של צלחות צמיחה גבוהה כולל יותר peptone מאשר לוחיות הזיהוי הרגיל של ngm והיא מתחזקת עם הזן E. coli NA22 אשר גדל יותר מכבש מ OP50.
ההתקדמות של הטכנולוגיה cyEVs try (facs) אפשרה ניתוח ישיר של הפרט20,21, המתיר כימות הEVs ללא המגבלות הטמונות בשיטות אחרות. עבודה קודמת הראו כי חלבון הוא לא פרוקסי שימושי עבור השפע EV משום שיטות טיהור שונות תוצאה באופן משמעותי שונים EV-to-חלבון יחס22. מאוד טהור שברים EV מכילים קצת חלבון יחסית, מה שהופך אותו קשה לכמת דגימות עם ה-BCA או ג'לים Coomassie. ניתוח מערבי יכול לזהות הבדלים יחסיים של חלבונים בודדים, אך אין באפשרותם לזהות כמה EVs נמצאים במדגם. כימות חזקה של מספר EV על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק הוא הקשיח על ידי טווח צר שלה האות אל הרעש, חוסר יכולת להבדיל בין EVs ואגרגטים מוצק, ואת חוסר ההעברה של שיטות בין מכשירים עם מפרטים שונים23. לכן, מאמר זה מכיל גם הליך הניתן להתאמה כללי של הזרם cyEVs להפלות ולכמת את.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu; יחידות מסננים m</td><td>Genesee</td><td>25-233</td><td>לבדיקת המדיה הממוזגת מפסולת</td></tr><tr><td>תמיסה של 1% של Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>HFH10</td><td>הוסף את זה ל-0.05% כדי ליז EVs</td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחות צמיחה גבוהות</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לטיפוח אוכלוסיות גדולות של תולעים</td></tr><tr><td>2 ליטר צלוחיות מבולבלות תחתונות</td><td>ThermoFisher</td><td>4110-2000PK</td><td>לביצוע הפרדת אי הכללת גודל של EVs</td></tr><tr><td>40 &mu; m רשת</td><td>אמזון</td><td>CMY-0040-C/5PK-05</td><td>השתמש בזה כדי להפריד תולעים בוגרות משלבי הזחל</td></tr><tr><td>5 &mu; m רשת</td><td>אמזון</td><td>CMN-0005-C</td><td>השתמש בזה כדי להפריד L1s משלבי תולעת אחרים</td></tr><tr><td>6 ס"מ גידול רגיל צלחת גידול תולעים בינונית</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לטיפוח אוכלוסיות קטנות של תולעים</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 מסנן צנטריפוגלי 10 kD mwco</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7715</td><td>לריכוז אי הכללת הגודל מסנן</td></tr><tr><td>צנטריפוגלי Amicon Ultra-4 10 kD mwco</td><td>MilliporeSigma</td><td>C78144</td><td>לריכוז המדיה המותנית</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה Apogee A50</td><td>Apogee</td><td></td><td>ציטומטר זרימה זה מתמחה בפתרון חלקיקים בגודל ננומטר</td></tr><tr><td>ApogeeMix</td><td>Apogee</td><td>1493</td><td>הערכת פיזור אור וביצועי פלואורסצנטיות של FACS</td></tr><tr><td>DI-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher</td><td>D3167</td><td>הוסף זאת ב-20 uM כדי לתייג</td></tr><tr><td>EVs עמודת כרומטוגרפיה חד פעמית</td><td>BioRad</td><td>7321010</td><td>לביצוע הפרדת אי הכללת גודל של EVs</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>MilliporeSigma</td><td>G9391-100G</td><td>לטיפול בקצות פיפטה כך שתולעים לא ידבקו</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>87785</td><td>הוסף לדגימת EV כדי למנוע פירוק חלבון</td></tr><tr><td>צינורות איסוף מחייבים חלבונים נמוכים</td><td>ThermoFisher</td><td>90410</td><td>השתמש בהם עבור דגימות EV</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>לציפה של סוכרוז של תולעים</td></tr><tr><td>S מאגר בסיסי</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>מתכון בספר תולעת</td></tr><tr><td>Sepharose CL-2B שרף</td><td>MilliporeSigma</td><td>CL2B300-100 מ"ל</td><td>לביצוע הפרדת אי הכללת גודל של EVs</td></tr><tr><td>שייקר מסלול קטן</td><td>ABC Scientific</td><td>83211301</td><td>השתמש בזה עבור תולעת S דגירה בסיסית</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S8501-5KG</td><td>לציפה של סוכרוז של תולעים</td></tr></tbody></table>

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

הפרשה של קרום קטן מאוגד שלפוחיות לתוך הסביבה החיצונית הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי של כל התאים. אלה שלפוחיות ושלפוחית (EVs) פונקציה מחוץ לתא כדי לווסת תהליכים פיזיולוגיים גלובליים על ידי העברת חלבונים, גרעין חומצות, מטבוליטים, ושומנים בין רקמות. EVs משקפים את המצב הפיזיולוגי של תאי המקור שלהם. EVs הם מעורבים יש תפקידים בסיסיים כמעט בכל היבט של בריאות האדם. לכן, החלבון EV והקרגוס גנטית הם נותחו יותר ויותר עבור סמנים בריאותיים של בריאות ומחלות. עם זאת, השדה EV עדיין חסרה מערכת המודל חסרי חוליות מודל המאפשר את המחקר של הרכב מטענים EV. ג. אלגיה מתאימה גם לחקר EV משום שהיא פעילה באופן פעיל EVs מחוץ לגופה לתוך הסביבה החיצונית שלה, המאפשר בידוד נתיישב. מאמר זה מספק את כל המידע הדרוש ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שמות מEVs לסביבה זו, כולל כיצד לעבוד באופן כולל עם אוכלוסיות גדולות מאוד של הגיל-תולעים מסונכרנות, מטהר EVs, ופרוטוקול cy, לנסות באופן ישיר מודד את מספר EVs שלם במדגם מטוהר. כך, הספרייה הגדולה של ריאגנטים גנטי זמין עבור מחקר C. אלגיה ניתן לצותת לחקירת ההשפעות של מסלולים גנטיים תהליכים פיזיולוגיים על הרכב מטענים EV.

תרשים של התהליכים הנחוצים ליצירה וטיהור EVs מוצג באיור 1. הזמנים האופייניים הדרושים להשלמת כל שלב מוצגים מתחת. איור 2 מציג סכימטי להכנת דגימות עבור ניתוח facs באמצעות DI-8-anepps (איור 2א) כמו גם את החישובים הנחוצים כדי להעריך את המספר הכולל של EVs במדגם (איור 2b).
תוצאות מייצגות מ -10 משכפל ביולוגי מוצגות באיור 3א. השונות בין המשכפלת אינה משמעותית והS.E.M. הטיפוסית של גודל האוכלוסיה היא מעט מעל 10% (איור 3ב). סינון התולעים והטיפוח בלוחות הצמיחה הגבוהים הטריים ייצרו אוכלוסייה גדולה של מבוגרים גרבוניים המתאימים לסנכרון האקונומיקה. צלחת אחת מורעב מעובד בדרך זו יכול לייצר אוכלוסייה ניסיונית של 1 x 106 או יותר מסונכרן או יותר כי כל מבוגר gravid יכיל על 10 ביצים. ניתן לשמור על אוכלוסיות גדולות של אוכלוסיות מסונכרן מבחינה נפשית על ידי סינון ביצים וזחלים באמצעות פילטר 40 יקרומטר כדי להשיג EVs מחיות מבוגרות. מבוגרים שנשמרו הועברו לצלחות גדילה טריות טריים בצפיפות של 20,000 בעלי חיים לכל צלחת. תהליך זה חזר על עצמו כל יומיים. איור 3ג מציג שלוש משכפל ביולוגי של אוכלוסיות תולעת הועברו על פני שלוש העברות צלחות. העברת בעלי חיים בין הלוחות גורמת לאבדן בעלי חיים בערך של כ -10% (איור 3ג) ואילו כ -20% מבעלי החיים אובדים בשלב הציפה של סוכות (איור 3ד).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig3a.jpg"> איור 3: קוונפיקציה של אוכלוסיות גדולות של C. אלגיה עבור ניתוח EV. (א) השוואה של מספר תולעים L1 בשלב הזחל מבודדים מתוך לאחרונה מורעב אחד (&lt; 24 שעות) לוחית צמיחה גבוהה. הערכים של כל אחד מ-10 משכפל ביולוגי מותווים. הסיכום של כל נקודות הנתונים ב -10 משכפל מוצג גם בתור מגרש כינור ובר עם S.E.M. זה מראה כי צלחת אחת של תולעים מורעבים לאחרונה תניב ~ 80,000 L1 תולעים בשלב הזחל. (ב) S.E.M. של 15 מדידות אוכלוסיית הצלחות השונות בלוח A המותוות כנקודות בודדות. באופן כללי, ה-S.E.M. גדול במקצת מ-10%. (ג) שלושה משכפל ביולוגי של אוכלוסיית התולעים הוערך לאחר כל אחד משני העברות בין לוחות כל 4 h. העברה זו של בעלי חיים בין צלחות לא הייתה ירידה משמעותית בגודל האוכלוסייה. הדבר מעיד על כך שמתודולוגיה שהוצגה כאן לצורך העברת תולעים אינה מהווה אובדן משמעותי של בעלי חיים. (ד) מדידות האוכלוסייה שנלקחו במהלך שלוש שכפול ניסיוני EV: מספרם של בעלי החיים שהיו מוערכים על הזחלים L1 המקורי שהתחילו את הניסוי, מספר בעלי חיים צעירים התאושש מצוף סוכות מוכן לתקופת הדגירה 24 h, מספר בעלי חיים שנספרו הכנה EV על התאוששות של הסוד. יש ירידה קטנה אך לא משמעותית בגודל האוכלוסייה בין שערוך האוכלוסין הראשוני בשלב הזחל L1 ומאוחר יותר כאשר בעלי החיים הם מבוגרים צעירים. המדד הממוצע לאוכלוסיית L1 הוגדר כ-100%, וכל המידות האחרות שינו את גודלם לערך זה. קווי שגיאה S.E.M. * = p ערך &lt; 0.05, נ = לא משמעותי במבחן מזווג פרמטרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig3alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
יחס חלבון-לבעלי חיים הוא מדד שימושי לאפיון הכנה של EV. מדד זה יכול לספק אמצעי מהיר לקביעת העקביות בין ההכנות EV. בממוצע, 1,000 סוג פראי בעלי חיים למבוגרים צעירים יהיה להפריש 1 μg של חלבונים גדולים יותר 10 kDa לתוך הסביבה שלהם (איור 4א). כאשר שבר זה מופרד עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה הדרה בגודל, פרופיל החלבון הכולל מראה שיא חלבון קטן בין 2-6 מ ל ופסגה גדולה לאחר 8 מ ל. הEVs כלולים ב -5 הmL הראשונים של הטור (איור 4ב'). ניתוח מעקב ננו-חלקיק הראשון 5 מ ל של משחרלי הטור מכיל אוכלוסיה של מונולפיזור קטן, ~ 150 ננומטר EVs (איור 4ג). הילוכים אלקטרון מיקרוסקופ של גודל שברים הדרה חושף שופע EVs ב 2 – 6 mL שבריר של הללויה אבל לא בכמויות מאוחרות יותר. EVs ידועים בצורת הספל שלהם ולכן קל להפלות מחלקיקים מוצקים המופיעים בנקודות בהירות כאשר הם מוכנים תחת תנאי הצביעה השליליים (איור 4ד).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig4.jpg"> איור 4: טיהור של EVs ס מ מתוך ביומסה המופרש כולל. (א) היחס בין החלבונים הכולל הגדולים מ-10 kda למספר התולעים המשורטטות בהכנה ל -10 משכפל ביולוגי הותווה. רוב ההכנות הכילו 1 μg של חלבון לכל 1,000 בעלי חיים. (ב) משחרריזציה של חלבון מטור של 10 מ ל שרף טעון עם 1 מ ל של הסוד המרוכז. השברים המאוחדים בניתוחים נוספים מוצללים לקבוצות. (ג) ננו-חלקיק ניתוח מעקב של שרף מאוחד שברים 2 – 6 מ ל. מרווח הביטחון של 95% הוא אפור מוצלל. (ד) מנתח של שרף מאוחד שברים. החומר ההתחלתי היה גם חלקיקים כמו שלפוחית וחלקיקים לא שלפוחית. השבר המאוחד של 2 – 6 מיל היה מועשר לשלפוחיות עם חלקיקים לא-שלפוחית מעטים. The 7-11 mL שברים מאוחד הכיל כמה חלקיקים שלפוחית כמו, אבל הרבה חלקיקים לא שלפוחית. שברים של 12 עד 15 מיל הכילו רק חלקיקים לא שלפוחית. כל המיקרוגרפים מוצגים באותה הגדלה. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי להשוות במישרין את המאפיינים של הזרימה cyEVs try בין C. אלגיה והאדם, אנחנו מטוהרים EVs מהמדיה הממוזגת של תרביות תאים של נוירונים אנושיים עם שיטה זו. הזרימה cy, try מפרידה חלקיקים המבוססים על פיזור אור. פיזור אור קטן זווית (הסלים) בערך בהתאם לגודל, ואת פיזור האור ארוך זווית (LALS) התואם עם מבנה הקרום הפנימי. רוב האירועים מדגם כולל מתרבות התא ו -C. אלגיה EV ההכנות מתמקדים באשכול ממורכז סביב 103 בעשר בניםו 104 lals (איור 5א). היסטוגרמה של ג. אלגיה לדוגמה אירועים הממוינים לפי מראה כי כל ההכנות שיא ב ~ 103 (איור 5ב).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig5.jpg"> איור EVs מוגדרות בבירור על ידי מאפייני פיזור האור שלהם. C. elegans (א) היסטוגרמה של אירועי הEVs בשלושה משכפל ביולוגי של ס. אלאנים . ~ 80% מכלל אירועי המדגם נכללים באוכלוסיה הדוקה ומוגדרת בבירור. בדומה לניתוח מעקב ננו-חלקיק, הוא מראה כי התפלגות הגודל של ה -C. אלגיה EVs היא חד-מונוסון. ההיסטוגרמה של המאגר S בסיס המשמש כדי לדלל את הדגימות מוצג להשוואה. (ב) השוואת מאפייני השבירה של הEVs ותרבות התא האנושי מטוהרים בשיטות המתוארות בטקסט זה. שני הסוגים של EV מציגים בעקביות הפצות פיזור אור קצר וארוך הזווית הארוכה (ובו LALS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
התוויות DI-8-ANEPPS של c. אלגיה , בעקביות הדגשת רוב האירועים הכולל הן c. אלגיה ו התאים הנגזרים דגימות. חרוזי הכיול והבקרות מוצגים באיור 6א. מגרשי הפיזור הבודדים של FACS מוצגים מדגם C. אלגיה המוכן מ200,000 בעלי חיים (#1) ושניים המוכנים מ-500,000 בעלי חיים (איור 6ב). EVs מ או 100 mL (#1) או 200 mL (#2, 3) של תרבות התא נותחו גם (איור 6ג). הן C. אלגיה ותרבות התאים הנגזרים הראה אירועי פלורסנט שופע שנעלמו כאשר מטופלים עם 0.05% טריטון-X 100 ואור sonication. זה מוכיח כי האירועים המסומנים הם חומרי ניקוי מבנים פוספוליפיד הזרחן (שלפוחיות) במקום חוסר רגישות ליפופרוטאין מוצק אגרגטים. שפע EV מחושב כהפרש בין מספר האירועים בשער DI-8-ANEPPS בין השברים ללא חומרי ניקוי (-) ועם חומרי ניקוי (+) פחות את האירועים בבקרת צבען בלבד. עבור בהירות, הנתונים המוצגים בנפרד באיור 6B ואיור 6C מסוכמים כתרשימי עמודות באיור 6D ואיור 6E. שפע הEVs הטהור לא היה שונה באופן משמעותי בין ה -C. אלגיה לבין תרבות התא ההכנות הנגזרות (איור 6F).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig6.jpg"> איור 6: דוגמאות של הזרם cy, לנסות נתונים המשמשים לחישוב שפע EV. (א) כדי לוודא שניתן להשוות את מספר האירועים באופן ישיר בין דגימות, יש להפעיל את הפקדים ' מאגר בלבד ' והאפשרות ' מאגר ' ו'צבע בלבד ' באותו קצב זרימה ושעת איסוף בדומה לשברים בדגימת EV. יש מעט מאוד אירועים בשער DI-8-ANEPPS. (ב) תוצאות מייצגות של הפרוטוקול DI-8-anepps וטיפול בחומרי ניקוי מ- C. אלגיה. שלושה משכפל ביולוגי מוצגים. שכפול ביולוגי #1 היה מוכן מ 200,000 בעלי חיים בעוד #2 ו#3 היו מוכנים 500,000 בעלי חיים. היעלמותו של EVs עם טיפול בחומרי ניקוי הוא ברור בכל המקרים. (ג) תוצאות מייצגות של הפרוטוקול DI-8-anepps וטיפול בחומרי ניקוי באמצעות מדיה ממוזגת לתרבות התא האנושי. משכפל ביולוגי #1 ו#2 הוכנו מ 200 mL של מדיה ממוזג בעוד שכפול ביולוגי #3 הוכן מ 100 mL. (ד) גרף עמודות של הנתונים שנאספו משלושת הגרפים הביולוגיים של ה -C. אלגיה EVs. קווי שגיאה = S.E.M. זווג בדיקות דו-זנבי בין טיפולים. = p ערך &lt; 0.001. (ה) גרף עמודות של הנתונים שנאספו מתוך שלושה משכפל ביולוגי של תרבות התא נגזר EVs. לזווג דו-זנבי בדיקות בין טיפולים. = p ערך &lt; 0.001 (F) מספר האירועים הרגישים לצבע על חומרי ניקוי לכל μl, היתה מחושבת עבור כל המשכפלת הביולוגית של ה . אלגיה ותרבות התא. הערכים בין שני המקורות לדוגמה EV אינם שונים באופן משמעותי. לזווג דו-זנבית t-בדיקות בין הטיפולים p ערך = 0.685. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1 מכילה את הערכים הניסיוניים הגולמיים עבור המלא 4.5 μl של כל סוג לדוגמה שנותחו. המספר הכולל של אירועים שנאספו משברים EV מטוהרים מ 500,000 בעלי חיים היה 10-20x על מספר הרקע של חלקיקים שנאספו על ידי מאגר לבד בעוד שבר מטוהרים מ 200,000 בעלי חיים הכיל על 2x כמו אירועים רבים כמו מאגר לבד. מספר האירועים בתוך השער DI-8-ANEPPS מוצג גם עבור כל דוגמה. ניתן לייבא מדדים אלה לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את מספר הEVs הרגישים לצבען, הרגיש לניקוי לעיל. לדוגמה, מספר ה-EVs ב-1 mL של השכפול הביולוגי הראשון של C. אלגיה , יחושב כך:
(18,974 – 3,853-1,487) x (10/4.5) x 1,000 = 30,297,778.
טבלה 1: הזרמת מידע באמצעות טבלש. הנתונים המוצגים באיור 6 מוצגים כגיליון אלקטרוני. עבור כל דוגמה האירועים הכולל ואירועים מגודרת של DI-8-ANEPPS מוצגים. כל שכפול ביולוגי מאורגן לפי סדר הדגימות #1 – 3 בפרוטוקול. מדדים אלה מגלים כי המספר הכולל של אירועים שנאספו מדגימות C. אלגיה שהוכנו מ-500,000 בעלי חיים או 200 mL של התקשורת הממוזג התרבות התאים היה 10-20x על מספר הרקע של חלקיקים שנאספו על ידי מאגר לבד בעוד שכפול ביולוגי מטוהרים מתוך 200,000 בעלי חיים הכיל על 2x כמו אירועים רבים מספר האירועים בתוך השער DI-8-ANEPPS מוצג גם עבור כל דוגמה. ניתן לייצא מדדים אלה לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את המספר הכולל של EVs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/Table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a>

מאמר זה מציג שיטות ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שלפוחיות. Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

השדה חוץ-תאי חסר מודל חסר חוליות הניתן למתיחה גנטית כדי לחקור את אותות החלבון וה-RNA של ורים חוץ-תאיים. פרוטוקול זה קובע את השיטות להשגת יבולים חוץ-תאיים שופעים וטהורים מ- C.elegans. זה מספיק עבור RNA-SEQ חזק וניתוח פרוטומי.כאשר C.elegans תרבות מסונכרנת מיצו את המזון מן צלחת בינונית הצמיחה הרגילה שלהם, להשתמש גומיות כדי להבטיח כובע מסנן רשת ניילון חמישה מיקרומטר על בקבוק סטרילי ולהתחיל ואקום. יוצקים את תולעי L1 על המסנן ומעבירים נפח שווה של בינוני מעל אגרגטים תולעת. לאחר המערבולת, להעביר שלושה 10 כרכים microliter של ההשעיה תולעת על מכסה צלחת טיפוח תולעת לספור את מספר בעלי החיים בכל טיפה.התאימו את מתלי התולעת לשני בעלי חיים למיקרוליטר של מדיום טרי ומערבולת את ההשעיה שוב. לאחר מכן, להוסיף תשע, 10 טיפות microliter של תולעים על מכסה צלחת חדש באופן ידני לספור את מספר בעלי החיים בכל טיפה. לאחר מכן לחשב את הממוצע ואת השגיאה הסטנדרטית של הממוצע כאחוז של כל אוכלוסיית תולעת ולחשב את המספר הכולל של בעלי חיים בכל אוכלוסייה.כדי להכין את התולעים לדור secretome, לשטוף את התולעים עם שלוש חמש דקות שוטף ב 15 מיליליטר של מדיום M9 סטרילי עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של קרבניצילין לכל צלחת לכל לשטוף עם מערבולת עדינה כדי לנתק את התולעים, בריכת לשטוף לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר הכביסה האחרונה, לדלל את התולעים לחיה אחת לכל מיקרוליטר של פתרון S-באזל בתוספת 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של כולסטרול ו 50 ריכוז קרבניצילין מיקרומולארי. לאחר מכן להוסיף עד 400 מיליליטר של ההשעיה תולעת לבקבוק סטרילי שני ליטר תחתית מבולבל.מניחים את הבקבוק על מסובב עגול ב 20 מעלות צלזיוס ו 100 סיבובים לדקה במשך 24 שעות. לקציר חוץ-תאי של רכיים, מעבירים את התולעים בצינור חרוט 50 מיליליטר לצנטריפוגה ומפענחים את העל-טבעי באמצעות מסנן ואקום של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חלקיקים. לאחר הספירה, מניחים טיפה של תולעים מושעות על מדשאה חיידקית ולהבקיע את בעלי החיים כמו נע, משותק, או מת לאחר 15 דקות.לאחר מכן, לרכז את supernatant מסונן ל 700 microliters עם מסנן ניתוק משקל מולקולרי 10 קילודלטון מחדש ולהוסיף 150 microliters של פתרון S-באזל טרי להפחתה. סנן ומערבולת את הפתרון שנוצר וחזור על ההפחתה והסינון פעמיים נוספות כפי שהוכח. לאחר הסינון האחרון, צנטריפוגה supernatant כדי להסיר את כל החלקיקים והפסולת שאולי הצטברו במהלך הטיפול ולהוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז בתוספת EDTA לפי הוראות היצרן.כדי להכין את עמודת אי-הכללת הגודל, decant 15 מיליליטר של שף אגרוז מושעה לתוך מחסנית עמוד זרימת כבידה ריקה. כאשר העמודה התנקזה, להוסיף פתרון S-באזל עד מיטת שף הוא ארוז בנפח סופי של 10 מיליליטר. החלף את מאגר שף עם 40 מיליליטר של פתרון S-Basel מסונן סטרילי, דואג לא להפריע את רשף, ולאפשר כוח הכבידה לנקז את המאגר דרך העמודה.לאחר החלק העליון של הרף כבר לא שקוע, מכסה את החלק התחתון של המחסנית כדי לעצור את הזרימה ולהניח צינור איסוף מתחת לעמודה. כדי ליזום את השבר הסודי, להסיר את הכובע מיד להוסיף את פתרון סודי מרוכז טיפה חכם לחלק העליון של מיטת העמוד, ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של S-באזל פתרון טיפה חכם. מניחים צינור איסוף טרי מתחת לעמודה וממלאים באיטיות את מאגר העמודים העליון בחמישה מיליליטר של פתרון S-Basel.לאחר איסוף שני המיליליטרים הראשונים של eluate, במהירות לשנות את הצינורות כדי לאסוף את ארבעת המיליליטרים הבאים. השתמש nitrocellulose מחדש 10 קילודלטון מסנן ספין ניתוק משקל מולקולרי לרכז את הערכה החוץ תאית המכילה עמודה eluate ל 300 microliters ולהעביר את המסנן לחזור צינור microcentrifuge מחייב נמוך. לאחר מכן לשטוף את קרום המסנן פעמיים עם 100 microliters של פתרון S-Basel ב 20 שניות של מערבולת לכל לשטוף ולשלב את לשטוף עם המקורי retentate עבור נפח מדגם סופי של 500 microliters.כדי להכין את השלפוחיות החוץ-תאיות לכימות על-ידי ניתוח ציטומטרי של זרימה, הוסיפו 840 מיקרוליטרים של תווי S-Basel ו-60 מיקרוליטרים של שלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות לצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 300 מיקרוליטרים של המדגם לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים יחד עם שבעה מיקרוליטרים של בדיקה חזקה מתאימה לכל צינור. הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של 1%Triton X-100 לצינור האחרון וערבבו את כל הצינורות על ידי מערבולת.מניחים קצה sonicator במרכז הצינור של המדגם השלישי דופק את המדגם 10 פעמים ב 20% כוח ו 30% מחזור חובה. לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של פתרון S-באזל לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה בקרה ולהוסיף שבעה microliters של בדיקה לצינור הצבע בלבד. סמן את מאגר הצינור השני בלבד.ואז להדגר את כל הצינורות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור לפני הניתוח שלהם על ידי ציטומטריה זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כדי לנתח את הנתונים, פתח את הקבצים בתוכנת הניתוח הציטומטרי המתאימה לזרימה. הגדר שער מלבני החל בחלק העליון של החלקה המשתרעת ממפלס פיזור האור בזווית קטנה באחת פעמים 10 לשתיים עד פעם אחת 10 לארבע והורדת השער עד שהוא מכיל כ -2.5% מכלל האירועים.תן שם לשער לאחר הבדיקה והעתק והדבק את השער על שתי החלקות הנתונים האחרות של הדגימה והבקרה. לאחר מכן יצא את הניתוח לגיליון אלקטרוני. כאן מוצגות תוצאות מייצגות של 10 שכפולים ביולוגיים.השונות בין השכפולים אינה משמעותית והשגיאה הסטנדרטית האופיינית של ממוצע גודל האוכלוסייה היא קצת יותר מ-10% העברת בעלי חיים בין צלחות גורמת לאובדן של כ-10% מבעלי החיים, בעוד כ-20% מבעלי החיים הולכים לאיבוד בשלב ההצף של סוכרוז. בממוצע, 1,000 בעלי חיים צעירים מסוג פראי יפרשו מיקרוגרם אחד של חלבונים הגדולים מ-10 קילו-דלטון לסביבתם. כאשר שבר זה מופרד עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל, פרופיל אלוטיון החלבון הכולל מדגים שיא חלבון קטן בין שניים לשישה מיליליטר ושיא גדול לאחר שמונה מיליליטר.הווסקולרים החוץ-תאיים כלולים בחמשת המיליליטרים הראשונים של העמודה. בהשוואה ישירה של מאפייני ציטומטריית הזרימה בין C.elegans לבין שלפוחיות חוץ תאיות אנושיות, היסטוגרמה של C.elegans אירועי מדגם שלפוחית חוץ תאית, ממוין על ידי פיזור אור זווית קטן, מראה כי כל ההכנות לשיא בעוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של כ 1 פעמים 10 לשלישי. בדיקה potentiometric DI-8-ANEPPS, תוויות חזקות C.elegans וויסקלים חוץ תאיים ואת שפע של וויסקלים חוץ תאיים מטוהרים ממוינים על ידי הביטוי DI-8-ANEPPS אינו שונה באופן משמעותי בין C.elegans ותרבות התא נגזר ההכנות.הדגימות שהוכנו על ידי הליך זה הן נוחות עבור כל שיטות ניתוח שלפוחית חוץ-תאית טיפוסי במורד הזרם, כולל RNA-SEQ, ציטומטריית זרימה, ניתוח מעקב חלקיקים ננו, וניתוח פרוטומי. יצירת שיטות לטיהור וריצים חוץ-תאיים של C.elegans מאפשרת לחוקרים להשתמש במודל חסרי חוליות פשוט זה כדי לחקור את המסלולים הגנטיים והתהליכים הפיזיולוגיים המשפיעים על הרכב מטען דם חוץ-תאי.

purification-analysis-caenorhabditis-elegans-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

מקור: ווטסון, די.סי., et.al. בידוד וטיהור ניתנים להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את הבידוד והריכוז של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בקרום החיצוני של חיידקים מהונדסים גנטית. התהליך כולל גידול החיידקים לשחרור EVs, ואחריו צנטריפוגה עוקבת ושלבי סינון להסרת תאים ופסולת. לבסוף, אולטרה-סינון משמש לריכוז הרכבים החשמליים לניתוח במורד הזרם.

בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

הדו ח הנוכחי מדגיש את הדרישות כרונולוגי לחילוץ שלפוחית לפוחית (EV) בידוד מ מיקרוגלייה או דם מקרופאגים. Microglia-EVs נגזר הוערכו כרגולטורים של neurite מוצלח בעוד דם מקרופאג-נגזר EVs נחקרו בשליטה של הפלישה C6 glioma תא ב מבחנה. המטרה היא להבין טוב יותר אלה פונקציות EV כמו מגשרים החיסונית במיקרו סביבות מסוימות.

אפיון של תא החיסון-מסחטות נגזרות ושלפוחיות ולימוד השפעה פונקציונלית על סביבת התא

שיטה זו מתארת פרוטוקול להכנת תמצית חלבון בתפוקה גבוהה מדגימות אלגנים של Caenorhabditis ו- co-immunoprecipitation לאחר מכן.

הכנת תמצית חלבון ושיתוף חיסוני מאלגנים של קנורהאביטיס

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

מחקר זה מתאר שיטה לבידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המועשרות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), מזהה את המאפיינים הפיזיים של BEV ממורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז, ודן ביישומים האפשריים של גישת DGC במחקר קליני ומדעי.

בידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

כאן, אנו מדגימים את שיטת האפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שנאספו מנוזלים ביולוגיים, כגון דמעות ורוק, של נבדקים אנושיים. הסורק המשמש בשיטה זו מסוגל לזהות את הפנוטיפ, הגודל וספירת החלקיקים הכוללת של EVs מ-1 מיקרוליטר של הדגימה.

אפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזלים ביולוגיים

הפרוטוקול מתאר בידוד של EVs מיקרוביאליים במעיים מחולדות רגישות למלח המוזנות ב-HSD באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. EVs אופיינו במעקב אחר ננו-חלקיקים, מבחני TEM, LPS/BCA וריצוף 16S rRNA כדי לנתח את הגודל, המורפולוגיה, ההרכב ומקור המיקרוביוטה.

הפרדה ואפיון דיפרנציאלי של שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקי מעיים בחולדות רגישות למלח בתנאי תזונה עתירי מלח

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

למד שיטה לטיהור וניתוח מסחטות של Caenorhabditis elegans ושלפוחיות חוץ-תאיות. הפרוטוקול מאפשר איסוף וספירה באמצעות זרימה ציטומטרית לניתוח RNA-SEQ ופרוטאומי.

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

גלה סרטונים נוספים